全基因组阵列比较基因组杂交技术示范
Summary
这个视频是一个全基因组平铺路径阵列比较基因组杂交，扫描整个人类基因组只用25-100纳克的DNA，可以从多种来源，包括档案福尔马林固定材料隔离技术示范的杂交协议。
Abstract
阵列比较基因组杂交（阵列CGH）技术是一种检测DNA片段或基因的基因组中的1剂量的收益和损失的方法。这项技术的最新进展，使高分辨率的整个基因组的遗传变异在癌症和其他遗传性疾病 2鉴定比较。小组Megabase分辨率平铺设置阵列（SMRT）阵列是由一组细菌人工染色体（BAC），跨越2〜100个碱基对的人类基因组（KB）段的克隆约三万重叠。这些BAC的目标是独立的合成和发现重复单一载玻片 2-4 。阵列比较基因组杂交的基础上有竞争力的杂交的原则。样品和参照DNA差异与菁- 3标记和荧光染料菁- 5，和合作的阵列杂交。潜伏期后，未结合的样品从幻灯片冲洗成像阵列。 SeeGH（www.flintbox.ca）免费提供的自定义软件包是用来处理大量的数据收集 – 一个单一的实验产生53892个数据点。 SeeGH可视化之间在每个BAC目标的2样品与5,6染色体的位置，这是垂直对齐的log2信号强度的比值。 SMRT的阵列，可以检测高达50 KB的大小 7小的改动。 SMRT的阵列，可以检测多种，包括DNA的收益，损失，扩增和纯合性缺失的DNA重组事件。 SMRT的阵列的一个独特优势是，可以使用从福尔马林固定石蜡包埋样品中分离DNA。当与非放大的DNA（25 – 100ng）的低投入的要求相结合 ，这使得如7,8显微切割生产的珍贵样品的分析。这要归功于大尺寸每个BAC杂交的目标，让约束力，以生产足够的标记的样品进行检测的信号。这个平台的另一个优势是组织异质性的耐受性，减少繁琐的组织显微切割8的需要。此视频的协议是一个标签输入DNA，通过对整个基因组的瓦片路径SMRT的阵列信号收购一步一步的教程。
Protocol
Discussion
质量差的DNA，将不会提供一个良好的杂交个人资料。它是必不可少的，以确保样品和参照DNA污染物，如苯酚，RNA，盐等可能与干预的随机总理标签步骤之前开始杂交实验。例如再悬浮的DNA在Tris – EDTA代替水（TE）是不建议高盐浓度能抑制标记反应。我们建议使用Nanodrop分光光度计测量DNA的数量以及吸光度曲线的整体形状和260/280，二百三十分之二百六十零比例化验DNA的质量。
洗衣机：从杂交盒中删除的幻灯片?…
Acknowledgements
我们要感谢为编写本文运临实验室的BAC阵列队，特别是三轮铃木和布赖恩志的成员。这项工作是支持由来自加拿大研究所的资金卫生研究院，加拿大基因组/基因组不列颠哥伦比亚省和美国国立卫生研究院/ NIDCR授予RO1 DE15965 – 01。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
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