Technische Demonstration von Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization
Summary
Dieses Video ist eine technische Demonstration der Hybridisierung Protokoll für gesamte Genom Fliesen Weg Array-CGH, die das gesamte menschliche Genom mit nur 25-100 ng DNA, die aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Archivierung Formalin fixiert Material isoliert werden können Scans.
Abstract
Array komparative genomische Hybridisierung (Array-CGH) ist eine Methode zum Nachweis von Gewinnen und Verlusten von DNA-Segmenten oder Gen-Dosierung in das Genom 1. Jüngste Fortschritte in dieser Technologie sind mit hochauflösenden Vergleich ganzer Genome für die Identifizierung genetischer Veränderungen bei Krebs und anderen genetischen Erkrankungen 2 aktiviert. Die Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (oder SMRT)-Array besteht aus einer Reihe von rund 30.000 überlappenden bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Klone, die das menschliche Genom in ~ 100 Kilobasenpaar (kb) Segmente 2 span zusammen. Diese BAC-Ziele werden individuell hergestellt und entdeckte in zweifacher Ausfertigung auf einem einzigen Objektträger 2-4. Array-CGH ist auf dem Prinzip der kompetitiven Hybridisierung. Proben-und Referenz-DNA werden differentiell mit Cyanin-3 bezeichnet und Cyanine-5 Fluoreszenzfarbstoffe, und das Array co-hybridisiert. Nach einer Inkubationszeit die ungebundenen Proben werden von der Folie gewaschen und das Array abgebildet. Eine frei verfügbare kundenspezifische Software-Paket namens SeeGH (www.flintbox.ca) wird verwendet, um die große Menge an Daten gesammelt Prozess – einem einzigen Experiment erzeugt 53.892 Datenpunkte. SeeGH visualisiert die log2 Signalintensität Verhältnis zwischen den 2 Proben an jedem BAC Ziel, die vertikal mit chromosomalen Position 5,6 ausgerichtet ist. Der SMRT Array erkennt Änderungen so klein wie 50 kb in Größe 7. Der SMRT Array erkennt eine Vielzahl von DNA Umlagerung Veranstaltungen, darunter DNA Gewinne, Verluste, Amplifikationen und homozygote Deletionen. Ein einzigartiger Vorteil der SMRT Array ist, dass man DNA aus Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Proben isoliert zu verwenden. In Verbindung mit dem niedrigen Eingang Anforderungen der unverstärkten DNA (25-100 ng) kombiniert dies ermöglicht Profilierung der wertvollen Proben, wie sie durch Mikrodissektion 7,8 produziert. Dies ist auf die Größe der einzelnen BAC-Hybridisierung Ziel, dass die Bindung von ausreichend markierten Proben, um Signale für den Nachweis produzieren können zugeschrieben. Ein weiterer Vorteil dieser Plattform ist die Toleranz des Gewebes Heterogenität, der Bedarf an langwierige Gewebe Mikrodissektion 8. Dieses Video-Protokoll ist ein Schritt-für-Schritt-Anleitung von der Kennzeichnung der eingesetzten DNA bis hin zur Übernahme des gesamten Genoms Fliesen Weg SMRT Array Signal.
Protocol
Discussion
Schlechte Qualität DNA wird nicht eine gute Hybridisierung Profil. Es ist wichtig, dass die Probe zu gewährleisten und Referenz-DNA sind frei von Verunreinigungen wie Phenol, RNA, Salz, etc, die mit dem random prime Kennzeichnung Schritt vor Beginn einer Hybridisierung Experiment stören können. Zum Beispiel die Resuspension der DNA in Tris – EDTA (TE) anstelle von Wasser ist nicht so hohe Salzkonzentration empfohlen hemmen können die Kennzeichnung Reaktion. Wir empfehlen Testen DNA-Qualität mit dem Nanodrop Spektralphotometer, um sowo…
Acknowledgements
Wir wünschen den Mitgliedern des Wan Lam Lab BAC-Array-Team vor allem Miwa Suzuki und Bryan Chi für die Vorbereitung dieses Artikels danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Canadian Institutes for Health Research, Genome Canada / Genome British Columbia, und NIH / NIDCR gewähren RO1 DE15965-01 unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH — a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
