Tekniska Demonstration av hela genomet Array jämförande genomik hybridisering
Summary
Den här videon är en teknisk demonstration av hybridisering protokoll för hela genomet kakel väg array CGH som läser av hela det mänskliga genomet med bara 25-100 ng DNA som kan isoleras från en mängd källor, bland annat arkivens formalin fasta material.
Abstract
Array jämförande genomik hybridisering (matris CGH) är en metod för att upptäcka vinster och förluster av DNA-segment eller genen dosering i genomet 1. Senaste framstegen inom denna teknik har möjliggjort hög upplösning jämförelse av hela genomet för att identifiera genetiska förändringar i cancer och andra genetiska sjukdomar 2. Sub-Megabase Upplösning Plattsättning-set array (eller SMRT) uppsättning består av en uppsättning av ca 30 tusen överlappande bakteriell konstgjord kromosom (BAC) kloner som spänner över det mänskliga genomet i ~ 100 kilobase par (kb) segment 2. Dessa BAC mål är individuellt syntetiseras och fläckiga i två exemplar på en enda glasskiva 2-4. Array CGH bygger på principen om konkurrerande hybridisering. Prov och referens DNA differentiellt märkta med Cyanine-3 och Cyanine-5 fluorescerande färger, och co-hybridiseras till i arrayen. Efter en inkubationstid på obundna proverna tvättas bort från bilden och arrayen avbildas. En fritt tillgänglig anpassad programpaket som kallas SeeGH (www.flintbox.ca) används för att bearbeta den stora mängd uppgifter som samlats in – ett enda experiment genererar 53.892 datapunkter. SeeGH visualiserar log2 förhållandet signalstyrkan mellan två prover vid varje BAC mål som vertikalt är i linje med kromosomala läge 5,6. Den SMRT array kan upptäcka förändringar så små som 50 kb i storlek 7. Den SMRT array kan upptäcka en rad olika evenemang DNA ombildning inklusive DNA vinster, förluster, förstärkningar och homozygota deletioner. En unik fördel med SMRT matrisen är att man kan använda DNA isolerat från formalinfixerade fast inbäddade paraffin prover. I kombination med den låga ingången krav oförstärkta DNA (25-100 ng) Detta gör att profilering av dyrbara prover som de som produceras av microdissection 7,8. Detta tillskrivs den stora storleken på varje BAC hybridisering mål som gör att bindningen av tillräckligt märkta prover för att producera signaler för upptäckt. En annan fördel med denna plattform är toleransen av vävnad heterogenitet, vilket minskar behovet av tråkiga vävnad microdissection 8. Denna video protokoll är en steg-för-steg anvisning från märkning ingången DNA genom att signalera förvärvet för hela genomet kaklet väg SMRT array.
Protocol
Discussion
Dålig kvalitet DNA kommer inte att ge en bra hybridisering profil. Det är viktigt att säkerställa att prov och referens-DNA är fria från föroreningar som fenol, RNA, salt, etc som kan störa slumpmässiga främsta märkning steget innan en hybridisering experiment. Till exempel på resuspension av DNA i Tris – EDTA (TE) i stället för vatten rekommenderas inte så hög saltkoncentration kan hämma märkning reaktion. Vi rekommenderar testmetoder för DNA-kvalitet med Nanodrop spektrofotometer för att mäta både DNA-mängd samt öv…
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Wan Lam Lab BAC Array laget speciellt Miwa Suzuki och Bryan Chi för utarbetandet av denna artikel. Detta arbete stöddes av medel från kanadensiska Institutes for Health Research, Genome Canada / Genome British Columbia, och NIH / NIDCR bevilja RO1 DE15965-01.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH — a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
