Mit Laser-Pinzette zur Manipulation isolierter Neuronen In Vitro
Summary
Dieses Video beschreibt die Manipulation von kultivierten Neuronen mittels Laser-Pinzette in vitro.
Abstract
In diesem Papier und Video beschreiben wir die Protokolle in unserem Labor verwendet werden, um die Ausrichtung Präferenzen der regenerierenden Zellen Prozesse der erwachsenen Netzhautneuronen in-vitro-Studie. Verfahren zur Vorbereitung der retinalen Zellkulturen beginnen mit der Präparation, die Verdauung und Zerreiben der Netzhaut, und enden mit der Beschichtung von isolierten Zellen der Netzhaut auf Gerichte speziell für den Einsatz mit Laser-Pinzette gemacht. Diese Gerichte sind in eine Zelle Klebstoff Hälfte und eine Zelle repellant zwei Hälften geteilt. Die Zelle Klebeseite ist mit einer Schicht von Sal-1-Antikörper, die ein Substrat, auf denen unsere Zellen wachsen bieten beschichtet. Andere Klebstoff Substrate könnte auch für andere Zelltypen verwendet werden. Die Zelle repellant Seite ist mit einer dünnen Schicht aus Poly-HEMA beschichtet. Die Zellen auf der Poly-HEMA Seite der Schale überzogen sind mit dem Laser Pinzette gefangen, transportiert und dann neben der Sal-1-Seite in eine Zelle gelegt, um ein Paar zu schaffen. Formation von Zell-Gruppen jeder Größe sollte mit dieser Technik möglich. "Laser-Pinzette-gesteuerte Mikromanipulation" bedeutet, dass der Prüfer können wählen, welche Zellen sich zu bewegen, und den gewünschten Abstand zwischen den Zellen können standardisiert werden. Da der Laserstrahl geht durch transparente Oberflächen der Kulturschale, sind Zelle Auswahl und Platzierung in einem geschlossenen, sterilen Umgebung gemacht. Die Zellen können per Video im Zeitraffer überwacht werden und mit jedem zellbiologischen Technik erforderlich. Diese Technik kann helfen, Untersuchungen von Zell-Zell-Interaktionen.
Protocol
Discussion
Licht hat an Dynamik, und wenn ein Lichtstrahl gebrochen wird, wie es durch eine Zelle durchläuft, eine Kraft ist erforderlich, um die Richtung des Impulses zu ändern. Wegen des Gesetzes von der Erhaltung des Impulses, muss eine Kraft in die entgegengesetzte Richtung, die ihrerseits wieder reagieren auf eine Zelle. Ashkin (1991) zeigten, dass die Kraft, die durch einen Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv fokussiert generiert wird eine Zelle zur Mitte des Fokus zu verschieben. Auch wenn ein Laserstrahl erzeugt nur ein paar Pikonewton v…
Acknowledgements
Forschung wurde durch die NIH Grants EY012031 und EY0182175 und die FM Kirby-Stiftung unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
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- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
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