Usando uma pinça Laser Para Manipulação neurônios isolados In Vitro
Summary
Este vídeo descreve a manipulação de neurônios cultivados usando laser pinças in vitro.
Abstract
Neste artigo e vídeo, descrevemos os protocolos utilizados em nosso laboratório para estudar as preferências de segmentação dos processos celulares regeneração de neurônios da retina adulta in vitro. Procedimentos para a preparação de culturas de células da retina começam com a dissecção digestão, e trituração da retina, e terminam com o chapeamento de isoladas as células da retina em pratos feitos especialmente para uso com laser pinças. Estes pratos são divididos em meia célula adesiva e meia repelente celular. O lado adesivo célula é revestida com uma camada de Sal-1 anticorpos, que fornecem um substrato sobre o qual nossas células crescer. Outros substratos adesivo pode ser usado para outros tipos celulares. O lado repelente célula é revestida com uma fina camada de poly-HEMA. As células banhado no lado poli-HEMA do prato são capturados com a pinça a laser, transportado e depois colocado adjacente a uma célula na-1 Sal lado para criar um par. Formação de grupos de células de qualquer tamanho deve ser possível com esta técnica. "Micromanipulação Laser-pinças controlada" significa que o pesquisador pode escolher quais as células a se mover, e a distância desejada entre as células podem ser padronizadas. Porque o feixe de laser atravessa as superfícies transparentes da placa de cultura, seleção e colocação de células são feitas em um ambiente fechado estéril. As células podem ser monitorados por vídeo em tempo-lapso e usado com qualquer técnica de células biológicas necessárias. Esta técnica pode ajudar as investigações de interações célula-célula.
Protocol
Discussion
A luz tem força, e quando um raio de luz é refratada ao passar através de uma célula, uma força é necessária para mudar a direção do momentum. Por causa da lei da conservação do momento, uma força na direção oposta deve, por sua vez, reagem de volta em uma célula. Ashkin (1991) mostrou que a força gerada por um feixe de laser focalizado por uma lente objetiva do microscópio irá mover uma célula para o centro do foco. Mesmo que um feixe de laser gera apenas uma piconewtons alguns de força, essa força é suficiente para p…
Acknowledgements
Pesquisa foi suportada pelo NIH Grants EY012031 e EY0182175 ea FM Kirby Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
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