Это протокол, описывающий, как изолировать и культуры первичных симпатических нейронов из верхних шейных ганглиев (SCG) новорожденных крысят.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протокол для культивирования симпатических нейронов крысы из верхних шейных ганглиев (SCG)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Верхних шейных ганглиев (SCG) у крыс, мелкие, блестящие, миндалевидные структуры, которые содержат симпатические нейроны. Эти нейроны симпатической иннервации обеспечить для головы и шеи регионов и они представляют собой хорошо известных и относительно однородным населением (4). Симпатические нейроны зависят от фактора роста нервов (ФРН) за выживание, дифференцировку и рост аксонов и распространенный наличие NGF облегчает их культуре и экспериментальные манипуляции (2, 3, 6). По этим причинам, культурный симпатических нейронов были использованы в самых разнообразных исследований, включая нейронные развития и дифференцировки, механизмы запрограммированной и патологической гибели клеток и передачи сигнала (1, 2, 5 и 6). Пройдя из ГКО от новорожденных крыс и культивирования симпатических нейронов не очень сложна и может быть освоен достаточно быстро. В этой статье мы расскажем в деталях, как рассекают из ГКО от новорожденных крысят и использовать их для создания культурах симпатических нейронов. Статья будет также рассказано о подготовительных шагов и различных реагентов и оборудования, которые необходимы для достижения этой цели.
Протокол
1. Подготовка для вскрытия:
- Выберите подходящее блюдо культуры (10 см или 6-и или 24-луночных планшетах и т.д.) в зависимости от характера вашего экспериментов, и покрыть их крысы хвост коллагена за 24 часа до вскрытия. Методы получения крысы хвост коллагена и использовать его для блюд пальто культуры были описаны в другом месте (1).
- Подготовка 0,25% раствора трипсина в фосфатном буферном растворе (PBS) (без ЭДТА) и фильтр стерилизуют. Подготовка 1 мл аликвоты и хранить при -20 º C.
- Подготовка раствора, содержащего 2,5 мМ каждого из уридина и 5-FDU в дистиллированной / деионизированной H 2 O. Фильтр-стерилизовать и подготови....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы используем Sprague Dawley крыс для нашей культуры.
Найдите время и ухода при чистке ганглиев. Удалите все обломки, кровеносных сосудов и жира. Этот шаг важен в обеспечении культуры, которая более или менее однородное и свободным от посторонних типов клеток. Добавление uridine/5-FDU будет в значительной степени устранить любые остающиеся без нейронов (митотический) клетки загрязняющих культуры или хотя бы подавить их распространения.
Кроме того, при диссоциации шаг, будьте терпеливы и не торопитесь, чтобы отдельные нейроны.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.
Благодарности
NZ хотел бы поблагодарить членов лаборатории Субхаса Бисвас, Эндрю Спроул, и Райан Виллет для обучения ее вскрытии и уборки симпатических нейронов. Поддержке грантов от NIH-NINDS.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Пинцет, из нержавеющей стали №5 | Инструмент | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Ножницы DEAVER прямые, остроконечные/тупоконечные, лезвия 43mm - 5.5 | Инструмент | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 с L-глутамином | Реагент | Cellgro | 10-040-CV | |
| Фетальная бычья сыворотка | Реагент | SAFC Global | 12103c | |
| Сыворотка донорской лошади | Реагент | JRH Biosciences | 12449 | Инактивировать нагреванием в водяной бане при 56°C в течение 30 минут. |
| Пенициллин/стрептомицин | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Трипсин без ЭДТА | Реагент | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Уридин | Реагент | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-фтор-5’-дезоксиуридин | Реагент | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Реагент | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Диссекционный микроскоп и источник света | Микроскоп | |||
| Полипропиленовые пробирки объемом 15 ml | Инструмент | BD Biosciences | 352096 | |
| Чашки для культивирования клеток | Инструмент | Corning |
Ссылки
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Si....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
