Протокол для культивирования симпатических нейронов крысы из верхних шейных ганглиев (SCG)
Summary
Это протокол, описывающий, как изолировать и культуры первичных симпатических нейронов из верхних шейных ганглиев (SCG) новорожденных крысят.
Abstract
Верхних шейных ганглиев (SCG) у крыс, мелкие, блестящие, миндалевидные структуры, которые содержат симпатические нейроны. Эти нейроны симпатической иннервации обеспечить для головы и шеи регионов и они представляют собой хорошо известных и относительно однородным населением (4). Симпатические нейроны зависят от фактора роста нервов (ФРН) за выживание, дифференцировку и рост аксонов и распространенный наличие NGF облегчает их культуре и экспериментальные манипуляции (2, 3, 6). По этим причинам, культурный симпатических нейронов были использованы в самых разнообразных исследований, включая нейронные развития и дифференцировки, механизмы запрограммированной и патологической гибели клеток и передачи сигнала (1, 2, 5 и 6). Пройдя из ГКО от новорожденных крыс и культивирования симпатических нейронов не очень сложна и может быть освоен достаточно быстро. В этой статье мы расскажем в деталях, как рассекают из ГКО от новорожденных крысят и использовать их для создания культурах симпатических нейронов. Статья будет также рассказано о подготовительных шагов и различных реагентов и оборудования, которые необходимы для достижения этой цели.
Protocol
Discussion
Мы используем Sprague Dawley крыс для нашей культуры.
Найдите время и ухода при чистке ганглиев. Удалите все обломки, кровеносных сосудов и жира. Этот шаг важен в обеспечении культуры, которая более или менее однородное и свободным от посторонних типов клеток. Добавление uridine/5-FDU будет в значительной …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NZ хотел бы поблагодарить членов лаборатории Субхаса Бисвас, Эндрю Спроул, и Райан Виллет для обучения ее вскрытии и уборки симпатических нейронов. Поддержке грантов от NIH-NINDS.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 | Tool | Roboz | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Biosciences | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma | U3003 | |
| 5-Fluoro-5′ deoxyuridine | Reagent | Sigma | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Bioproduct | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Falcon | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning, Nunclone |
References
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).
