Summary
Dies ist ein Protokoll beschreibt, wie zu isolieren und Kultur primären sympathischen Neuronen aus überlegen Halsganglien (SCG) der neugeborenen Ratte Welpen.
Abstract
Die überlegene Halsganglien (SCG) in Ratten sind klein, glänzend, mandelförmige Strukturen, die sympathischen Neuronen enthalten. Diese Neuronen liefern sympathischen Innervationen für die Kopf-Hals-Region, und sie stellen eine gut charakterisierte und relativ homogenen Bevölkerung (4). Sympathischen Neuronen sind abhängig von nerve growth factor (NGF) für das Überleben, Differenzierung und axonalen Wachstum und der weit verbreiteten Verfügbarkeit von NGF erleichtert, ihre Kultur und experimentelle Manipulation (2, 3, 6). Aus diesen Gründen haben kultivierten sympathischen Neuronen in einer Vielzahl von Studien, einschließlich der neuronalen Entwicklung und Differenzierung, die Mechanismen des programmierten und pathologischen Zelltod und Signaltransduktion (1, 2, 5 und 6) verwendet worden. Dissecting die SCG von neugeborenen Ratten und Kultivierung sympathischen Neuronen ist nicht sehr kompliziert und kann ziemlich schnell gemeistert werden. In diesem Artikel werden wir im Detail beschreiben, wie Sie sezieren die SCG von neugeborenen Ratten Welpen und sie zu nutzen, um Kulturen von sympathischen Neuronen zu etablieren. Der Artikel beschreibt auch die vorbereitenden Schritte und die verschiedenen Reagenzien und Geräte, die benötigt wird, um dies zu erreichen sind.
Protocol
1. Vorbereitung für die Zerlegung:
- Wählen Sie den entsprechenden Kulturschale (10 cm oder 6-well oder 24-Well-Platten, etc.) abhängig von der Art Ihrer Experimente und überziehen sie mit Rattenschwanz Collagen 24 Stunden vor dem Sezieren. Das Verfahren zur Herstellung von Rattenschwanz Collagen und dessen Verwendung zur Beschichtung von Kulturschalen wurden an anderer Stelle (1) beschrieben.
- Bereiten Sie eine 0,25% Trypsin-Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (kein EDTA) und Filter zu sterilisieren. Bereiten Sie 1 ml aliquotiert und bei -20 º C.
- Bereiten Sie eine Lösung, die 2,5 mM jeweils von Uridin und 5-FDU in destilliertem / deionisiertem H 2 O. Filter-sterilisiert und bereiten 50 pl-Aliquots. Lagerung bei -20 º C.
- Bereiten Sie komplette Medium: RPMI 1640 Kulturmedium mit 10% Hitze-inaktiviertem Pferdeserum (Wärme durch Inkubation in einem 56 º C im Wasserbad für 30 Minuten inaktiviert) und 5% fötales Rinderserum.
- Bereiten Finale Medium: RPMI 1640 Kulturmedium mit 1% hitzeinaktiviertem Pferdeserum + NGF (100ηg/ml Endkonzentration) + Penicillin / Streptomycin (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU-Lösung (10 nM Endkonzentration) . Hinweis: dieses Medium sollte nachgeholt werden frisch vor Gebrauch jedesmal. Für ein Experiment in einem 24-Well-Platten-Format, wird man brauchen, um 12 ml dieses Mediums vorbereitet. Es wird empfohlen, dass Sie ein wenig mehr Vorbereitung. NGF kann aus einer Vielzahl von kommerziellen Quellen (siehe Tabelle am Ende dieses Protokolls) erworben werden.
- Ausstattung: Man wird einem Binokular und Lichtquelle benötigen. Ein Dual-Schwanenhals LWL-Hilfslicht mit Schwerpunkt Tipps bevorzugt. Darüber hinaus wird ein Bedarf zu reinigen und zu sterilisieren (durch Autoklavieren oder Eintauchen in 70% Ethanol für mindestens 20 Minuten) folgende Zerlegung-Werkzeuge: zwei Paare von Mikro-Sezieren Edelstahl Pinzette, und ein Paar Präparierscheren (auch aus Edelstahl und sowohl aus Roboz). Zwei sterile Injektionsnadeln (26 gague x 1 ½ Zoll oder ähnliches) wird auch benötigt werden. Es ist notwendig, eine Dissektion Bord, die eine 3 "x3" Stück Styropor in Aluminiumfolie eingewickelt und mit einem Kimwipe ist. Sprühen Sie die Karte mit 70% Ethanol zu dekontaminieren. Schließlich bereiten ein Feuer-poliertem Glas Weide Pipette. Um Feuer-Politur, nehmen Sie die Glaspipette und halten Sie die Spitze in die Flamme ein paar Sekunden, während der Rotation. Bei näherer Betrachtung wird die Spitze glatter aussehen und die Öffnung wird enger. Dies ist notwendig für den Schritt, wo die Zellen getrennt werden können. Führen Feuerpolitur in einer Zellkultur Haube, so dass die Pipette steril bleibt.
2. Dissection von Superior Halsganglien:
- Sammeln neugeborenen Ratten Welpen, die im Alter von P0 oder P1 sind.
- Schnell wischen den Welpen für die Präparation mit 70% Ethanol, um die Chancen der Verschmutzung zu reduzieren.
- Schnell enthaupten Welpe mit einem scharfen Schere (dieser Schritt wird nicht im Video angezeigt werden). Halten Sie den Kopf mit einer sterilen Pinzette gegen sterile Gaze kurz drain überschüssiges Blut.
- Platzieren Sie den Kopf auf die Zerlegung Pad mit der Bauchseite nach oben und der kaudalen Ende orientierten Richtung. Der abgetrennte Luftröhre sollte gut sichtbar sein. Verwenden Sie die sterile Injektionsnadeln auf den abgetrennten Kopf der Sezieren Pad in der folgenden Weise zu sichern: push einen Pin obwohl das Dach des Mundes in die Polster und drücken Sie den zweiten Stift wenn der abgetrennte Luftröhre in die Polster. Platzieren Sie die Pads unter dem Binokular und beginnen Dissektion.
- Mit beiden Pinzetten (eine in jeder Hand) wegzuräumen Haut und Fett um die Luftröhre, dabei nicht zu tief. Dadurch wird aussetzen ein Paar Muskeln laufen fast parallel zueinander auf beiden Seiten der Luftröhre. Hinweis: bei der Präparation, müssen Sie mit kaltem sterilem PBS oder kalt, serumfreien RPMI 1640-Medium mit einer sterilen, Pasteurpipette geliefert abzuwaschen überschüssiges Blut und zu halten, den Bereich sauber und feucht zu bewässern. Dies kann nur einmal oder mehrmals je nach getan werden, wie schnell man arbeitet. Für ein Erlebnis Dissektor, dauert es nur etwa zwei Minuten vor drei Minuten bis zu sezieren ein Paar Ganglien.
- Verwenden Sie die Zange zu schneiden und entfernen Sie die Muskeln auf der einen Seite zuerst.
- Sobald die Muskeln entfernt wird, wird die Halsschlagader sichtbar. Oft ist es hell rosa und enthält Blut. Es kann vorkommen, heller als andere Blutgefäße, dass Sie möglicherweise in der Nähe zu sehen und aus diesem Grund der Halsschlagader unter Umständen nicht sofort sichtbar. Diese Arterie verläuft entlang der Luftröhre und gabelt sich in das, was aussieht wie ein "Y"-förmigen Schleife. Diese Zweiteilung ist ein wichtiger Meilenstein und einmal er sich befindet, wird es relativ einfach, die SCG finden.
- Sever die Arterie am meisten kaudalen Ende und heben Sie sie leicht mit der Zange (das andere Ende ist noch angeschlossen ist). Sobald Sie dies tun, werden Sie sehen, eine mandelförmige, glänzend aussehende kleine Masse von Gewebe, das lose an der Arterie ist nur zum Zeitpunkt der Bifurkation befestigt und das hat thread-wie Pre-und / oder postganglionären Verknüpfungen. Dies ist das Ganglion cervicale superius. Verwenden Sie eine zweite Zange in der anderen Hand vorsichtig heraus, und in einem kleinen Kulturschale (35 mm) mit kaltem, serumfreien RPMI 1640-Medium.
- Anschließend entpacken Sie das Ganglion auf der anderen Seite der Luftröhre nach dem gleichen Protokoll.
3. Reinigung der Ganglia:
- Sobald alle Ganglien wurden herauspräpariert, sollten sie so viel wie möglich von fremden Gewebe befreit werden.
- Unter dem Dissektionsmikroskop, können Sie sehen, dass die Ganglien haben Stücke von Arteria carotis, Fett oder anderes Gewebe angebracht. Arbeiten Sie mit einer Pinzette in jeder Hand zu necken sich diese unerwünschten Stoffe. Ort und Stelle gereinigt Ganglien in ein steriles 15 ml konische, Polypropylen-Röhrchen, mit RPMI 1640-Medium.
- Die Vor-und / oder postganglionären Verknüpfungen sollten auch weggeschnitten werden. Jedes Ganglion hat etwa 10.000 Neuronen. Sobald die Neuronen vergoldet sind, werden sie wieder nachwachsen ihre Neuriten.
4. Gründung sympathische Neuron Kultur:
- Centrifuge die Ganglien an 200xg für 2 Minuten und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Ganglien in 0,5 bis 1 ml 0,25% Trypsin-Lösung. Legen Sie in einem 37 ˚ C Wasserbad oder Inkubator für 30 Minuten. Dies wird dazu beitragen distanzieren die Zellen in den Ganglien.
- Nach 30 Minuten mit 10 ml Vollmedium zu verdünnen und zu neutralisieren die Trypsin und Zentrifuge bei 200xg für 2 Minuten.
- Überstand und resuspendieren in 2 ml von Final Medium.
- Weitere distanzieren die Zellen durch Zerreiben der Ganglien nach oben und unten mit dem Feuer-poliertem Glas Weide Pipette. Man reibt die Ganglien 20 Mal und legen Sie die Röhrchen auf Eis für ein paar Minuten.
- In der Zwischenzeit, Feuer-polish der Pipette mehr, um die Öffnung schmaler (ca. 2 / 3 bis 1 / 2 mm im Durchmesser). Warten Sie ein paar Minuten, bis sie abkühlt und verreiben den Ganglien 20-mal mehr. Wie Sie fortfahren, wird das Medium geworden schrittweise trüber darauf hinweist, dass die Zellen werden dissoziiert. Wiederholen Sie diesen Schritt ein-oder zweimal, je nachdem wie gut die Zellen zu distanzieren. Nach einiger Zeit werden Sie feststellen, dass alle die Ganglien dissoziiert in Neuronen und keine intakten Ganglien sind sichtbar in die Röhre. Es kann einige Gewebe Material, das nicht distanzieren wird. An dieser Stelle lassen Sie die Röhre in Eis sitzen für ein paar Minuten so, dass jede undissoziierten Schutt auf dem Boden absetzen können. Jetzt sorgfältig sammeln fast alle des Mediums von oben und in einem anderen Rohr. Um sicherzustellen, dass Sie nicht sammeln die undissoziierten Schutt, verlassen etwa 50 ul am Boden des Röhrchens. Fügen Sie mehr von der Final Medium, um die Röhrchen mit dissoziierten Zellen: dieses Volumen ist abhängig von der Art der Kultur Platte ist man zur Kultur mit den Neuronen. Zum Beispiel: Wenn ein 24-well Schale eingesetzt werden, dann mit 0,5 Ganglien pro Well (~ 10.000 Neuronen pro Well) in 0,5 ml von Final Medium pro Vertiefung. Eine typische Ratte Wurf besteht aus 12 Welpen, die 24 Ganglien geben würde. Das ist genug, um Samen einer 24-Well-Platte und das Gesamtvolumen von Final Medium 12 ml. Hinweis: die Ganglien enthalten auch eine kleine Population von Gliazellen und anderen Zelltypen, die in der Kultur wird. Mit Uridine/5-FDU im Finale Medium verhindert ihre Verbreitung und Förderung ihres Todes.
- Feed Zellen alle 48 Stunden durch den Austausch 2 / 3 des Mediums mit frischem RPMI +1% Pferdeserum + NGF und uridine/5-FDU. Hinweis: Auf den ersten, enthält die Kultur sympathischen Neuronen in dieser Runde ohne Neuriten zu suchen. Short Neuriten sichtbar 24 Stunden nach der Sektion und progressiv geworden dichter und im Laufe der Zeit verzweigt.
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Discussion
Wir verwenden Sprague Dawley Ratten für unsere Kulturen.
Nehmen Sie sich Zeit und Sorgfalt bei der Reinigung der Ganglien. Entfernen Sie alle Fremdkörper, Blutgefäße und Fett. Dieser Schritt ist bei der Gewährleistung einer Kultur, die mehr oder weniger homogen und frei von fremden Zelltypen ist wichtig. Die Zugabe von uridine/5-FDU wird weitgehend beseitigt alle restlichen nicht-neuronalen (Mitose) Zellen Kontamination der Kultur oder zumindest zu unterdrücken ihre Verbreitung.
Darüber hinaus, während die Dissoziation Schritt, geduldig zu sein und sich die Zeit nehmen, um die Neuronen trennen, so dass sie nicht in großen Klumpen gefunden werden, wenn sie auf die Platten ausgesät. Nachdem große Klumpen von Zellen werden nicht zu guten experimentellen Ergebnissen. Zum Beispiel werden große Klumpen machen es schwierig für die Neuronen transfiziert oder infiziert werden. Immunfärbung kann auch behindert und keine Experimente, dass das Zählen der Neuronen benötigt wird schwierig durchzuführen, wie gut.
Es ist nicht notwendig, um das Medium mit Pen / Strep jedes Mal, wenn die Kulturen gefüttert zu ergänzen. Der Zusatz von Pen / Strep allerersten Mal werden die Zellen überzogen ist ausreichend. Sie fügen frische uridine/5-FDU auf das Medium jedes Mal, wenn das Medium ausgetauscht.
Wir haben sympathischen neuronalen Kultur verwendet werden, um Apoptose in Reaktion auf NGF-Entzug zu studieren. Zum Beispiel in Biswas et al. 2007 (2), wurden sympathischen Neuronen mit shRNA gegen mehrere Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen bei der Förderung der Apoptose transfiziert. Deckwerth et al. 1996 (5) haben sympathischen Neuronen von Wildtyp-Mäusen und Mäusen, denen der pro-apoptotischen Gens, Bax verwendet. Sie haben, wie diese Neuronen verhalten, wenn sie von NGF entzogen sah. Abbildung 6 aus Biswas et al. 2007 (2) und Abbildung 3 aus Deckwerth et al. 1996 (5) zeigen, was transfizierten und nicht transfizierten sympathischen neuronalen Kulturen aussehen, bzw..
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Acknowledgments
NZ möchte lab Mitglieder Subhas Biswas, Andrew Sproul und Ryan Willet für die Ausbildung ihrer in sezieren und Ernte sympathischen Neuronen zu danken. Unterstützt durch Zuschüsse aus dem NIH-NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
