Protokoll för odling sympatiska nervceller från Rat Superior Cervikal Ganglia (SCG)
Summary
Detta är ett protokoll som beskriver hur man isolera och odla primära sympatiska nervceller från överlägsen livmoderhalscancer ganglierna (SCG) för nyfödda råttungar.
Abstract
Den överlägsna livmoderhalscancer ganglierna (SCG) hos råttor är små, glänsande, mandelformade strukturer som innehåller sympatiska nervceller. Dessa nervceller ger sympatiska innervations för huvudet och hals och de utgör en väldefinierad och relativt homogen befolkning (4). Sympatiska nervceller är beroende av nervtillväxtfaktor (NGF) för överlevnad, differentiering och axonal tillväxt och den utbredda tillgängligheten av NGF underlättar deras kultur och experimentell manipulation (2, 3, 6). Av dessa skäl har odlade sympatiska nervceller använts i en mängd olika studier med nervsystemets utveckling och differentiering, mekanismer för programmerad och patologiska celldöd och signal transduktion (1, 2, 5 och 6). Dissekera ut SCG från nyfödda råttor och odling sympatiska nervceller inte är mycket komplicerat och kan bemästras ganska snabbt. I denna artikel kommer vi att beskriva i detalj hur man dissekera ut SCG från nyfödda råttungar och att använda dem för att upprätta kulturer av sympatiska nervceller. Artikeln kommer även att beskriva de förberedande åtgärder och de olika reagenser och utrustning som behövs för att uppnå detta.
Protocol
Discussion
Vi använder Sprague Dawley för våra kulturer.
Ta dig tid och omsorg vid rengöring av ganglierna. Ta bort allt skräp, blodkärl och fett. Detta steg är viktig för att se en kultur som är mer eller mindre homogen och fri från främmande celltyper. Tillskottet av uridine/5-FDU kommer till stor del eliminera återstående icke-neuronala (mitotiska) celler förorenar kultur eller åtminstone hämma deras spridning.
Dessutom, under dissociation steg, ha tålamod och ta dig tid att separera nervceller så att de inte finns…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NZ vill tacka labbet medlemmar Subhas Biswas, Andrew Sproul, och Ryan Willet för träning henne i dissekera och skörd sympatiska nervceller. Finansierats med bidrag från NIH-NINDS.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 | Tool | Roboz | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Biosciences | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma | U3003 | |
| 5-Fluoro-5′ deoxyuridine | Reagent | Sigma | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Bioproduct | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Falcon | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning, Nunclone |
References
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).
