Protocole pour les neurones sympathiques de rat Culture ganglions cervicaux supérieur (SCG)
Summary
C'est un protocole décrivant la façon d'isoler et de culture primaire de neurones sympathiques des ganglions cervicaux supérieurs (GCS) de ratons nouveau-né.
Abstract
Les ganglions cervicaux supérieurs (GCS) chez les rats sont petites, brillant, en forme d'amande structures qui contiennent des neurones sympathiques. Ces neurones fournissent innervations sympathiques pour la tête et du cou et ils constituent une population bien caractérisés et relativement homogène (4). Neurones sympathiques sont tributaires du facteur de croissance nerveuse (NGF) pour la croissance de survie, la différenciation et axonale et la généralisation de la disponibilité du NGF facilite leur culture et leur manipulation expérimentale (2, 3, 6). Pour ces raisons, des cultures de neurones sympathiques ont été utilisés dans un large éventail d'études, y compris le développement neuronal et la différenciation, les mécanismes de mort cellulaire programmée et pathologiques, et la transduction du signal (1, 2, 5 et 6). Disséquer la CTB à partir de rats nouveau-nés et les neurones sympathiques en culture n'est pas très compliqué et peut être maîtrisé assez rapidement. Dans cet article, nous allons décrire en détail comment disséquer la CTB de ratons nouveau-nés et à les utiliser pour établir des cultures de neurones sympathiques. L'article décrit également les étapes préparatoires et les différents réactifs et du matériel qui sont nécessaires pour atteindre cet objectif.
Protocol
Discussion
Nous utilisons des rats Sprague-Dawley pour nos cultures.
Prenez le temps et les soins lors du nettoyage des ganglions. Enlever tous les débris, les vaisseaux sanguins et de graisse. Cette étape est importante pour assurer une culture qui est plus ou moins homogènes et de types de cellules étrangères. L'ajout de uridine/5-FDU éliminera largement toutes les cellules restantes non-neuronales (mitose) contaminent la culture ou au moins supprimer leur prolifération.
En outre, durant l'étape de dissociation, être…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NZ tiens à remercier les membres du laboratoire Subhas Biswas, Andrew Sproul, et Ryan Willet pour sa formation en disséquant et la récolte neurones sympathiques. Soutenu par des subventions du NIH-NINDS.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 | Tool | Roboz | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Biosciences | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma | U3003 | |
| 5-Fluoro-5′ deoxyuridine | Reagent | Sigma | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Bioproduct | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Falcon | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning, Nunclone |
References
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
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- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).
