Protokoll zur Kultivierung sympathischen Neuronen aus Ratten-Superior Halsganglien (SCG)
Summary
Dies ist ein Protokoll beschreibt, wie zu isolieren und Kultur primären sympathischen Neuronen aus überlegen Halsganglien (SCG) der neugeborenen Ratte Welpen.
Abstract
Die überlegene Halsganglien (SCG) in Ratten sind klein, glänzend, mandelförmige Strukturen, die sympathischen Neuronen enthalten. Diese Neuronen liefern sympathischen Innervationen für die Kopf-Hals-Region, und sie stellen eine gut charakterisierte und relativ homogenen Bevölkerung (4). Sympathischen Neuronen sind abhängig von nerve growth factor (NGF) für das Überleben, Differenzierung und axonalen Wachstum und der weit verbreiteten Verfügbarkeit von NGF erleichtert, ihre Kultur und experimentelle Manipulation (2, 3, 6). Aus diesen Gründen haben kultivierten sympathischen Neuronen in einer Vielzahl von Studien, einschließlich der neuronalen Entwicklung und Differenzierung, die Mechanismen des programmierten und pathologischen Zelltod und Signaltransduktion (1, 2, 5 und 6) verwendet worden. Dissecting die SCG von neugeborenen Ratten und Kultivierung sympathischen Neuronen ist nicht sehr kompliziert und kann ziemlich schnell gemeistert werden. In diesem Artikel werden wir im Detail beschreiben, wie Sie sezieren die SCG von neugeborenen Ratten Welpen und sie zu nutzen, um Kulturen von sympathischen Neuronen zu etablieren. Der Artikel beschreibt auch die vorbereitenden Schritte und die verschiedenen Reagenzien und Geräte, die benötigt wird, um dies zu erreichen sind.
Protocol
Discussion
Wir verwenden Sprague Dawley Ratten für unsere Kulturen.
Nehmen Sie sich Zeit und Sorgfalt bei der Reinigung der Ganglien. Entfernen Sie alle Fremdkörper, Blutgefäße und Fett. Dieser Schritt ist bei der Gewährleistung einer Kultur, die mehr oder weniger homogen und frei von fremden Zelltypen ist wichtig. Die Zugabe von uridine/5-FDU wird weitgehend beseitigt alle restlichen nicht-neuronalen (Mitose) Zellen Kontamination der Kultur oder zumindest zu unterdrücken ihre Verbreitung.
Darüber hinaus, während die Dissoziati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NZ möchte lab Mitglieder Subhas Biswas, Andrew Sproul und Ryan Willet für die Ausbildung ihrer in sezieren und Ernte sympathischen Neuronen zu danken. Unterstützt durch Zuschüsse aus dem NIH-NINDS.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 | Tool | Roboz | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Biosciences | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma | U3003 | |
| 5-Fluoro-5′ deoxyuridine | Reagent | Sigma | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Bioproduct | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Falcon | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning, Nunclone |
References
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).
