Encyclopedia of Experiments: Biology
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- C. elegans é usado como um modelo experimental de infecção por patógenos intestinais que causam doenças, em parte, por interromper a barreira intestinal, aumentando sua permeabilidade. Para quantificar a integridade da barreira após a exposição a uma bactéria ou composto químico de interesse, coletar vermes lavando-os de suas placas.
Em seguida, coloque esses vermes em pratos de ágar com alimentos rotulados compostos de E. coli ateado misturado com FITC-dextran, um polissacarídeo de alto peso molecular com uma etiqueta fluorescente.
Permita que os vermes comam as bactérias rotuladas. Aqueles com barreiras intestinais intactas limparão rapidamente o alimento, enquanto em vermes com intestinos mais permeáveis, o marcador fluorescente penetrará além do lúmen do órgão.
Transfira os vermes para uma solução de formaldeído para corrigir os animais. Após 1 a 2 minutos, substitua o formaldeído por mídia de montagem.
Finalmente, imagem dos vermes por microscopia fluorescente. Observe que os grânulos intestinais C. elegans são autofluorescentes, então haverá sinal de fundo.
No protocolo de exemplo, vamos avaliar o efeito do tratamento com a biomolécula DIM na permeabilidade intestinal de vermes infectados com bactérias pseudomonas patogênicas aeruginosa.
- Prepare as placas complementadas pelo FITC-dextran misturando 2 mililitros de E inativados a calor. coli com 4 miligramas de FITC-dextran. Adicione 100 microlitadores da mistura a cada uma das 20 placas de ágar NGM frescos e deixe as placas secarem por uma hora em um banco de laboratório limpo. Após 48 horas de tratamento, lave os vermes com S Buffer. Transfira-os para placas complementadas fitc-dextran e para placas NGM sem FITC-dextran e incubar as placas durante a noite.
No dia seguinte, lave os vermes com tampão S e deixe-os rastejar na placa de ágar NGM fresca por uma hora. Adicione 50 microliters de 4% de formaldeído a cada poço de uma placa preta de 96 bem de fundo plano e transfira aproximadamente 50 vermes em cada poço.
- Formaldeído é um químico tóxico e deve ser tratado com cuidado.
