Gonad Microinjection: Eine Methode der zusammengesetzten Lieferung direkt in die Keimbahn von C. elegans

- Um für die Injektion vorzubereiten, verwenden Sie einen Wurm Pick, um eine Spur von Halocarbonöl auf einem Agarose-Pad zu legen. Legen Sie Würmer in das Öl und immobilisieren Sie sie, indem Sie sie sanft auf das Agarpad. Stellen Sie sicher, dass das Öl vollständig deckt die Tiere. Es ermöglicht Sauerstoff zu den Würmern zu bekommen, während die Austrocknung zu verhindern. Als nächstes legen Sie das Agarose-Pad auf ein Injektionsmikroskop und positionieren Sie die Nadel senkrecht zum Wurm, zielgerichtet.  

Drücken Sie die Nadel vorsichtig durch die Nagelhaut und injizieren Sie den Gonadenarm mit der Nukleinsäure oder der Verbindung von Interesse. Jeder Gonadenarm enthält ein Keimbahn-Synytium, das sich zu einzelnen Eizellen entwickelt. Material, das in die distale Gonad injiziert wird, wird in diese Oozyten eingearbeitet und beeinflusst die nächste Generation.

Nach der Injektion von Würmern, ersetzen Sie das Öl mit M9 Puffer. Sobald die Würmer beginnen, bewegen Sie sich, übertragen Sie sie auf eine NGM Agar-Platte mit bakteriellen Nahrung. Im folgenden Protokoll wird die Gonaden-Mikroinjektionsmethode verwendet, um einen Cas9-Komplex zu liefern, um das dpy-10-Gen zu zielen und zu bearbeiten.

- Beginnen Sie mit der Vorbereitung von C. elegans und Agarose Pads, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie ein Agarose-Injektionspad und Abdeckung Schlupf auf einen Dissektionsbereich. Verwenden Sie einen Wurmpick, um eine kleine Spur von Halocarbonöl entlang einer Kante des Pads zu legen. Dann positionieren Sie die Würmer parallel, um die Würmer in das Agarose-Pad zu schieben. einen Wurm gleichzeitig zu montieren und zu injizieren.

Sobald sie in Position und am Pad befestigt sind, überlagern Sie die Würmer mit weiteren tropfen Halocarbonöl aus der Spitze des Schneckenpicks. Legen Sie den Deckelschlupf mit den montierten Würmern auf das Injektionsmikroskop. Positionieren Sie die Würmer unter einer geringen Vergrößerung senkrecht zur Injektionsnadel, die mit der RNP-Lösung gefüllt wurde, wie im Textprotokoll beschrieben.

Wechseln Sie zu einer hohen Vergrößerung und positionieren Sie die Nadel neben dem Gonadenarm, entsprechend der Region in der Nähe der Kerne in der Mitte bis spät-pachyten. Mit dem Mikromanipulator, bewegen Sie die Nadel gegen den Wurm, drücken Sie die Nagelhaut leicht. Dann, mit einer Hand, tippen Sie auf die Seite des Mikroskops Bühne, um die Nadel durch die Nagelhaut zu rütteln. Drücken Sie das Injektionspedal oder Knopf, langsam füllen, um Gonadenarm mit der Injektionsmischung, und entfernen Sie die Nadel. Wiederholen Sie den Schritt mit dem anderen.

Sobald die Würmer injiziert sind, entfernen Sie den Deckelinin im Agarose-Pad und legen Sie ihn unter ein Sezierendes Mikroskop. Verdrängen Sie das Öl aus den Würmern, indem Sie einen M9-Puffer über sie pfeifen. Führen Sie diese Behandlung durch, um die Würmer aus dem Agar zu befreien. Nach 10 Minuten, wenn die Würmer im Puffer herumtollen, bewegen Sie sie mit der gezogenen Kapillarpipette auf eine NG-Agarplatte mit OP50-Bakterien. Legen Sie die Platte zwei bis drei Stunden bei 20 Grad Celsius ab, bis sich die Würmer erholt haben und sich bewegen. Agarplatten mit OP50 Dann die Platten auf einen 25 Grad Celsius Inkubator übertragen.