Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For å forberede injeksjonen, bruk en ormplukk for å legge et spor av halokarbonolje på en agarosepute. Plasser ormer i oljen og immobiliser dem ved å skyve dem forsiktig på agarputen. Sørg for at oljen dekker dyrene fullt ut. Det tillater oksygen å komme til ormenesamtidig som du forhindrer uttørking. Deretter plasserer du agaroseputen på et injeksjonsmikroskop og plasserer nålen vinkelrett på ormen, rettet mot den distale enden av en gonadarm.
Skyv nålen forsiktig gjennom neglebåndet og injiser gonadarmen med nukleinsyren eller forbindelsen av interesse. Hver gonadarm inneholder et germline syncytium som vil utvikle seg til individuelle oocytter. Materiale injisert i den distale gonaden vil bli innlemmet i disse oocyttene og påvirke neste generasjon.
Etter å ha injisert ormer, erstatt oljen med M9-buffer. Når ormene begynner å bevege seg, overfør dem til en NGM-agarplate med bakteriell mat. I følgende protokoll brukes gonadmikroinjeksjonsmetoden til å levere et Cas9-kompleks for å målrette og redigere dpy-10-genet.
- Begynn med tilberedning av C. elegans og agarose pads som beskrevet i tekstprotokollen. Plasser en agarose injeksjonspute og dekkslipp på et disseksjonsomfang. Bruk deretter et ormplukk for å legge et lite spor av halokarbonolje langs den ene kanten av puten. Bruk deretter ormplukket belagt med olje for å løfte flere ormer av NG-agarplaten og inn i oljesporet. Med et fint hår festet til en pipette, for eksempel en øyenvippe eller katte whisker, plasser ormene parallelt forsiktig skyve ormene inn i agaroseputen. montere og injisere én orm om gangen.
Når du er på plass og festet til puten, legg ormene med ytterligere noen dråper halokarbonolje fra spissen av ormplukkingen. Plasser dekselslipet med de monterte ormene på injeksjonsmikroskopet. Under en lav forstørrelse plasserer du ormene vinkelrett på injeksjonsnålen, som er fylt med RNP-løsningen, som beskrevet i tekstprotokollen.
Bytt til en høy forstørrelse og omplasser nålen ved siden av gonadarmen, tilsvarende regionen nær kjernen i midten til sen-pachytene. Bruk mikromanipulatoren, flytt nålen mot ormen, trykk neglebåndet litt. Deretter, med den ene hånden, trykk på siden av mikroskopstadiet for å jolte nålen gjennom neglebåndet. Trykk sakte på injeksjonspedalen eller knappen, fyll langsomt til gonadarmen med injeksjonsblandingen, og fjern nålen. Gjenta trinnet med den andre gonadarmen.
Når ormene er injisert, fjern dekslene i agaroseputen og legg den under et dissekeringsmikroskop. Bruk en trukket kapillær pipette, fortreng oljen fra ormene ved å pipettere en M9-buffer over dem. Utfør denne behandlingen for å frigjøre ormene fra agaren. Etter 10 minutter, når ormene banker rundt i bufferen, flytt dem til en NG-agarplate med OP50-bakterier ved hjelp av den trukket kapillære pipetten. Plasser platen ved 20 grader Celsius i to til tre timer til ormene har kommet seg og beveger seg rundt. Når du er gjenopprettet, overfør ormene individuelt til NG agarplater med OP50 Deretter overfører du platene til en 25 grader Celsius inkubator.
