Name: Metodologia sintética para Asymmetric Ferroceno Derivados Sistemas Bio-conjugadas via Metodologia base de resina em Fase Sólida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprenda a sintetizar bioconjugados de ferroceno-biotina em fase sólida para imobilização em superfícies de ouro. Este método simplifica a purificação e permite alta pureza no produto final.

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KG foi apoiada pela concessão P-1760 RA Fundação Welch, TCU Andrews Instituto de Matemática e Ciências da Educação (para KG), TCU pesquisa e criatividade Atividade Grant (a KG) e TCU SERC Grant (a JHS).

1. Síntese de biotina-Fc-cisteína (1) <ol><li> Métodos em fase sólida para produzir resina-1 ligado. <ol><li> Coloque biotina resina carregada (250 mg, 0,145 mmol) para uma seringa de vidro sinterizado e inchar a resina através da elaboração de dimetilformamida (5 mL) e agitando a seringa num agitador de laboratório durante 20 min. Expelir a solução e repetir dimetilformamida inchaço mais uma vez. </li><li> Remover o grupo protector Fmoc por adição de 4-6 ml de 20% de piperidina em dimetilformamida para a seringa, seguido por 10-15 min de agitação. Repetir o processo de desprotecção com mais de 4-6 ml de piperidina. Lava-se a resina com uma sequência de 3x dimetilformamida, 3x dimetilformamida: metanol (1: 1), metanol 3x: diclorometano (1: 1), diclorometano 3x, ~ 5 ml cada. Fazer um teste de ninidrina (+) sobre uma pequena amostra (~ 10) dos grânulos para confirmar a desprotecção bem sucedida pela presença de azul após aquecimento. </li><li> Misturar uma solução contendo ácido 1&#39;-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico(203,3 mg, 0,4350 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (58,8 mg, 0,413 mmol), carbodiimida de diisopropilo (0,0673 ml, 0,435 mmol), diisopropil etil amina (0,0757 ml, 0,435 mmol), e uma mistura 4: 1 de diclorometano e dimetilformamida. Desenhe esta dentro da seringa de frita e agitar suavemente num agitador de laboratório durante 6 horas. Em seguida expelir a solução a partir da seringa e lavagem conforme descrito anteriormente. </li><li> Realizar o teste da ninidrina (-), tal como descrito acima para confirmar acoplamento. O teste de ninidrina ainda podem ser úteis na confirmação de acoplamento apesar de a cor laranja do cordão de derivados de a fixação da porção contendo ferro. </li><li> Em seguida, remover o grupo Fmoc através da adição de 20% de piperidina em dimetilformamida e lavado como descrito acima. O teste de ninidrina (+) deve ser utilizado para confirmar a remoção do Fmoc. </li><li> Prepara-se uma solução composta por Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (58,8 mg, 0,4125 mmol), carbodiimida de diisopropilo (0,0673 ml, 0,4350mmol), diisopropiletilamina (0,0757 mL, 0,4350 mmol), e uma mistura 4: 1 de diclorometano e dimetilformamida. Adicione este cocktail acoplamento cisteína a seringa frita e agitar suavemente durante 6 horas. Lavar utilizando o protocolo descrito anteriormente. </li><li> Confirmar acoplamento utilizando o teste de ninidrina (-), seguida por remoção do componente de Fmoc com 20% de piperidina e lavagem. Verifique se o terminal de acesso gratuito amina usando o teste de ninidrina (+). </li></ol></li><li> A clivagem de um a partir da resina. <ol><li> Adicione uma solução de TFA (9,45 ml), água (0,25 ml), 1,2-etanoditiol (0,25 ml), e silano de triisopropilo (0,1 ml), adicioná-lo à seringa e agitar suavemente durante 4 h. </li><li> Recolher a solução vermelha-castanha resultante num tubo de Eppendorf e evapora-se o TFA lentamente com uma corrente de ar. </li><li> Adicionar éter dietílico frio (~ 15 ml) para o tubo de Eppendorf para precipitar 1, que irá formar uma ligeira agitação. Isolar o produto por meio de centrifugação (1 g, 5 min). Then ciclos repetidos de lavagens de éter etílico (~ 60 ml total) e centrífuga para obter 1 como um sólido vermelho / marrom. </li></ol></li></ol> 2. Caracterização e Análise de 1 <ol><li> Confirmar que a identidade corresponder a conectividade e composição mostrada na Figura 2, usando 1 H (16 varrimentos) e 13 C RMN (512 scans) em metanol deuterado (300 ul) e análise de ESI-MS. Espere os seguintes resultados: 1 H RMN Espectro (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4,104 (d, 2H ), 4,274 (q, 1H), 4.426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) e espectro de 13 C RMN (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH2), 28,300 (CH2), 35,474 (CH2), 38,698 (CH2), 39,241 (CH2), 39,717 (CH2), 55,340 / 55,538 (Cp-anel), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). ESI-MS (m / z): Encontrado: 639,00 [1 + Na] +, teórico: 639,1 [1 + Na] + e HR-MS (m / z): Encontrado: 617,2049 [1 + H] +, Teórico: 617.1622 [1 + H] +. </li><li> Realizar HPLC, análise elementar para confirmar a composição de um isolado. Realizar cromatogramas de HPLC utilizando uma coluna de fase reversa C8 com MeOH a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min. Nota: tempos de retenção de HPLC foram: 3,198-4,674 min. </li></ol> 3. Imobilização de 1 sobre uma superfície de ouro <ol><li> Cut polímero apoiado lâminas de ouro em quadrados de ~ 0,25 em 2. </li><li> Encher um copo de 50 ml com uma solução de água Dl de 1 (~ 1 mM). </li><li> Adicionar a lâmina de ouro para o copo e cubra com um vidro de relógio. Tudoow da lâmina de vidro a incubar O / N à temperatura ambiente sem agitação. </li><li> Remover o slide de ouro a partir da solução e permitir que ela seca ao ar. </li><li> Obter imagens de microscopia eletrônica de varredura, utilizando um microscópio eletrônico de varredura (ou equivalente) para observar imobilizada 1. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A síntese de derivados de ferroceno assimétricas é um desafio em solução. Por exemplo, as tentativas para produzir uma solução em resultou em baixos rendimentos do produto desejado (menos de 20%). Do mesmo modo, reacções que utilizam ácido carboxílico 1&#39;-amino-ferroceno (sans Fmoc) e biotina ligada resina resultou em um produto insolúvel consistente com o produto polimerizado relatado por Baristic et al. e produto mínima. 47 Isto é ainda mais complicada pelo ferroceno e ...

Biossensores são pequenos dispositivos que utilizam a tecnologia de reconhecimento biomolecular como a plataforma para análise seletiva e são utilizados para a sua especificidade, velocidade e baixo custo. Os biossensores eletroquímicos para a detecção de biomoléculas estão na vanguarda deste campo, devido à sua simplicidade, custo-benefício, e alta sensibilidade. 1,3 A anatomia geral destes sensores é um eletrodo equipado com uma molécula de reconhecimento específico para o marcador biológico de interesse . A ligação do marcador por molécula de reconhecimento resulta de uma alteração local do potencial ou da corrente que pode ser detectada por uma simples medição. Até à data, a porção reconhecimento pode variar de enzimas, anticorpos, 4-8 9-12 células inteiras, 13-16, 17-20 receptores peptídeos 21-23 e 24 e de DNA em grande parte com foco em moléculas maiores, biológicos. 25-28 Research esforços nessa arena têm se concentrado principalmente na imunossensores where uma imunoglobulina é imobilizada com um núcleo activo redox (tais como ferroceno) e utilizados para detectar um anticorpo de interesse. Estes estudos foram excluídos aplicações clínicas devido à baixa precisão e tempo de consumo decorrentes das complicações decorrentes do uso de antígeno / anticorpos. 1,3 crescente atenção centrou-se na detecção de moléculas pequenas (menos de 1 kg / mol) de biomédica , alimentos e interesse ambiental, além de segurança nacional. 29 Os exemplos mais conhecidos de dispositivos biossensores são monitores de glicose de auto-teste, que têm tela impressa eletrodos enzimáticos acoplados a um metro amperometric bolso. Estes sistemas utilizam tipicamente um método coulométrico onde a quantidade total de carga gerada pela reacção de oxidação da glicose é medida ao longo de um período de tempo. Dispositivos mobiliários deve ser portátil, robusto e de mão de fazer uso fácil para a população em geral. Tag Redox como ferrocene são necessry para proporcionar a detecção eletroquímica de biomarcadores ou pequenas moléculas em solução como a maioria dos biomarcadores não são intrinsecamente eletroquimicamente ativa. 30-38 Ferroceno é uma molécula organometallic que é um padrão-ouro para eletroquímica, o que o torna uma excelente opção para a integração em biossensores eletroquímicos. Espécies ativas redox à base Ferroceno já acumulou considerável atenção devido ao seu pequeno tamanho, boa estabilidade, acesso sintético conveniente, modificação química fácil, lipofilicidade relativa, e facilidade de ajuste redox. 3,30-42 Pequenas moléculas baseado no núcleo ferrocene tem sido amplamente utilizado como detectores de íons metálicos e pequenas moléculas. 32-38,43 Sistemas dirigidas a espécies maiores, como biomoléculas têm utilizado a ligação de anticorpos grandes ou imunoglobulinas para derivados do ferroceno que foram incorporados em uma superfície eletroquímica. 1,3,39 , 44 Em cada caso, o potencial de corrente e intensity do par redox Fe III / Fe II foi alterado por acoplamento molecular, produzindo, assim, um novo identificador espectroscópica indicando a presença da molécula de analito. Esta mudança surge a partir da sobreposição extensiva que ocorre entre o sistema-pi dos anéis ciclopentadienilo e os de ferro orbitais d. Se o sistema pi é modificado, ou seja, derivado ou reagir, em seguida, a interacção orbital, por sua vez, a mudança. Isto irá afectar o núcleo Fe e pode ser observada como uma mudança no potencial do par Fe III / Fe II. 40,45,46 Estas propriedades tornam um tal sistema atractivo para uso como um agente de quantificação em um imunoensaio electroquímico ou biossensor. De modo a produzir sistemas de ferroceno contendo capacidades específicas para biossensores é óptima para modificar um anel de Cp com a bio-receptor específico para uma molécula alvo e utilizar o outro anel de Cp como uma amarra molecular para a leitura electroquímica ou electrode (Figura 1). Síntese destes derivados do ferroceno assimétricos é desafiado por reações colaterais e a formação de espécies diméricas e poliméricas formadas sobre intermolecular cross-linking. 47 No entanto, o acoplamento química produzindo uma ligação amida é o caminho mais direto para fornecer derivados simples de ferrocene envolvendo componentes biológicos tais como péptidos e seus metabolitos. Portanto, as técnicas de fase sólida primeiro desenvolvidos na década de 1950 por Merrifield de síntese de péptidos podem ser aplicados a compostos organometálicos contendo ferroceno. Através da utilização da molécula de ácido 1&#39;-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico ortogonalmente substituído, um sistema de ferroceno, que pode incluir uma porção do receptor (biotina), leitura electroquímica (ferroceno), e o componente de imobilização-ligante (cisteína) possui Foram construídas aqui detalhado. A síntese deste bio-conjugado é discutido bem como prova para a imobilização sobre uma superfície de ouro. Este trabalho represenst a primeira apresentação de um sistema composto de biotina, ferroceno e um aminoácido para a imobilização sobre uma superfície de ouro.

<table><tbody><tr><td>Biotina Novatag Resina</td><td>NovaBiochem</td><td>8550510001</td><td></td></tr><tr><td>TORVIQ 10 ml Luer Lock Seringa frita</td><td>Fisher</td><td>NC9299151</td><td></td></tr><tr><td>piperidina</td><td>Teste de</td> ninidrina Acros <td>P / 3520 / PB05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017-1ea</td><td></td></tr><tr><td>1'-Fmoc-amino-ferroceno-1-ácido carboxílico</td><td>Omm Scientific Special</td><td>Order</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime; -Diisopropilcarbodiimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Novabiochem</td><td>8520080025</td><td></td></tr><tr><td>ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5408</td><td></td></tr><tr><td>1,2-etanodiiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>triisopropil silano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubos (20 ml)</td><td>Qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Qualquer fonte</td><td></td><td>Seque com peneiras moleculares antes de usar e armazene em frasco de mídia de 100 ml para facilitar o uso</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Qualquer fonte</td><td></td><td>Seque com peneiras moleculares antes de usar e armazene em frasco de mídia de 100 ml para facilitar o uso</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Qualquer fonte</td><td></td><td>secar com peneiras moleculares antes de usar e Armazene em frasco de mídia de 100 ml para facilitar o uso</td></tr><tr><td>Centrifugue</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia sintética para asymmetric ferroceno derivados sistemas bio-conjugadas via metodologia base de resina em fase sólida

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

A detecção precoce é uma chave para o sucesso do tratamento da maioria das doenças, e é especialmente indispensável para o diagnóstico e tratamento de vários tipos de cancro. As técnicas mais comuns utilizados são métodos de imagem, como a ressonância magnética (MRI), Positron Emission Topografia (PET), e Topografia Computadorizada (CT) e são ideais para a compreensão da estrutura física da doença, mas só pode ser realizada uma vez a cada quatro a seis semanas, devido à utilização de agentes de imagiologia e de custo global. Com isto em mente, o desenvolvimento de &quot;point of care&quot; técnicas, como biossensores, que avaliam o estágio da doença e / ou a eficácia do tratamento no consultório do médico e fazê-lo em tempo hábil, iria revolucionar os protocolos de tratamento. 1 Como um meio para explorar biossensores ferroceno base para a detecção de moléculas biologicamente relevantes 2, foram desenvolvidos métodos para produzir conjugados de bio-ferroceno-biotina aqui descritos. Este relatório vai se concentrar em um sistema-biotina-ferrocene cisteína que pode ser imobilizada em uma superfície de ouro.

A forma ligada resina de 1 é mostrada na Figura 2. A ligação covalente do componente ferroceno dá origem a uma coloração laranja para as pérolas de resina que é persistente com lavagem contínua e indicativo de um complexo de ferro contendo imobilizada em oposição a absorção de ferro pela PEG componente da esfera de resina. A forma livre da resina-1 é idêntica em cor para as pérolas de resina. A seguir à remoção do composto a partir da resina-esferas, a pureza e o rendim...

A síntese de espécies assimétricas de ferroceno é desafiadora usando técnicas de solução. Este relatório enfoca os métodos realizados para produzir um bioconjugado ferroceno-biotina usando reações fáceis e limpas realizadas por meio de síntese em fase sólida. A incorporação de uma porção tiolada é mostrada para conferir a capacidade de imobilização em superfícies de ouro.

Metodologia sintética para Asymmetric Ferroceno Derivados Sistemas Bio-conjugadas via Metodologia base de resina em Fase Sólida

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir conjugados assimétricos de ferreno, biotina, bio que possam ser imobilizados em uma superfície de ouro. Isso é alcançado pela síntese do conjugado de ferreno-biotina-bio em uma resina de fase sólida. Como segundo passo, o conjugado é removido da resina, o que permite o isolamento e a caracterização do composto.Em seguida, o bioconjugado é incubado com uma superfície de ouro para permitir a adesão dos talatos ao ouro. Os resultados mostram que um bioconjugado de ferne pode ser produzido com bom rendimento e pureza e, em seguida, imobilizado em uma superfície de ouro. A principal vantagem do uso desta técnica em comparação com métodos existentes, como métodos baseados em solução, é que a purificação é simples e direta.Além de evitar subprodutos gerados por métodos baseados em solução, tivemos inicialmente a ideia deste método ao refletirmos sobre a eficiência e praticidade dos sensores de glicose utilizados para monitorar pacientes diabéticos. Demonstrará este procedimento Sean Rodich do meu laboratório e Paulina Gonzalez, estudantes de graduação e pós-graduação, respectivamente, do meu laboratório. Primeiramente, coloque 250 miligr

synthetic-methodology-for-asymmetric-ferrocene-derived-bio-conjugate

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

A síntese de péptidos em fase sólida eficiente de um trímero bis péptido-funcionalizado utilizando um "fecho de segurança" procedimento de clivagem a partir de resina de HMBA é descrito.

Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o &quot;Safety Catch&quot; Metodologia

Detalhes do presente Protocolo, os passos importantes necessários para a bioconjugação de uma cisteína contendo proteína para uma maleimida, incluindo a purificação de reagentes, condições de reacção, purificação e caracterização de bioconjugados bioconjugado.

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

Um método geral potencial para a síntese de matrizes peptídicas multimetálicas solúveis em água contendo uma sequência predeterminada de centros metálicos é apresentado.

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Apresentamos um protocolo para a construção de vinil/Tioéter peptídeos helicoidais sulfeto-amarrados usando foto-induzido thiol-ene/thiol-ino hydrothiolation.

Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation

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Sapphire celular de alta pressão para medições de Equilíbrio de Fases de CO<sub&gt; 2</sub&gt; / Orgânicos / Sistemas de Água

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