透析: 拡散による分離
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Overview
透析は拡散に基づく分子を分離するため生物化学で使用される一般的な手法です。この手順では、半透膜にはサイズに基づいて特定の分子の動きことができます。このメソッドは、タンパク質溶液から脱塩、として知られているバッファーのバッファー分子またはイオンの交換の除去に適用できます
。このビデオをカバーすると共に、一般的なプロシージャ透析のいくつかのアプリケーションがレビューされ、透析の原理遠心、膜タンパク質後洗剤を除去するグラデーションの試薬の除去を含む。抽出、およびソリューション環境の変化によるタンパク質の再構成します
。生化学的サンプルが通常ダウン ストリームの処理や解析を妨げる高いバッファー濃度を持っています。透析は一般的な安価な技術の拡散に基づく分子を分離するために使用します。メソッドは、サイズに基づいて、特定のコンポーネントの移動を可能にする半透膜を利用しています。このビデオは、生化学の透析、一般的な手順とその利用方法のいくつかの概念が表示されます
。透析の最も重要な側面は、半透膜、分子を通過する一定のサイズ以下を許可する分子量カットオフを課すことを細孔を持っています。たとえば、10 k 膜は一般に 10 キロダルトンより大きい分子を保持します。ただし、分子量カットオフは、不連続値または正確な境界ではありません。膜分子カットオフ付近のごく一部が失われる可能性がありますので通常幅広い細孔径、含まれています
。分子量カットオフが球状蛋白質、DNA や RNA のようなのとほぼ同じ質量の線形分子を使用して定義されるのでをすり抜ける可能性があります。膜は通常選ばれた 1 つ半分目的分子の 3 分の 1 の分子量
。サンプルの手順を実行するは、膜は、大量の透析液と呼ばれるソリューションに追加されます順番に配置されます。時間をかけてより小さい分子が拡散自由にサンプルと、透析膜中大きな生体分子内で開催。透析は、ゆっくりとしたプロセスです。それは夜間に実行を許可する一般的なあるいは複数日にわたる
。透析液が純粋な水の場合、全体的なバッファー濃度が下がり、脱塩として知られているプロセス。ソリューションには、他の小さな粒子が含まれている、いくつかはサンプルでは、バッファー交換につながるに移動します。透析は平衡プロセスなので透析液更新できます複数回さらに小さい分子を転置します。サンプルは、さらなる処理のため再収集プロセスが完了します
。今あなた ' 見 ve 透析の基礎ができます ' s の一般的な手順を見てみましょう
。手順を開始する前に膜が透析液中に浸漬します。これにより、使いやすく、あらゆる防腐剤を削除します。一度準備ができて、サンプルを注射器で通常、収集して透析コンテナーに追加されます。これは裸管をすることができます。 またはカセット内に含まれます。余分な空気がサンプルを最大化する透析セットアップから削除され ' 膜の表面積を s。セットアップは、拡散を最大限に攪拌を透析液に分類されます。それで攪拌を阻害しないする必要があります
。透析液が変更される関連する間隔でサンプルと透析液間の平衡に到達します。最後の変更後の反応は通常一晩実行に残っています。十分な時間期間の後、カセットから無料のバッファーまたは交換のサンプルが削除されます。サンプルの分析または実験の性質によっては、さらに処理することができますを収集した後
。今は ' 一般的な透析の手順見てきました、' s はこの手法は生化学で使用される方法のいくつかを参照してください
。密度勾配は、複雑な生体試料を分離する一般的な方法です。この概念は、塩化物イオンを小さな粒子、ショ糖やセシウムの分布に依存します。完了すると、これらの試薬は通常収集されたサンプルを処理することができます前に削除する必要があります。透析は将来の分析のための精製されたサンプルを利用することが可能になります
。ある特定の蛋白質がセル内で見つかった ' s 脂質二重層とは通常球状脂質ベシクル リポソームと呼ばれるにそれらを散在しました。タンパク質や脂質は最初洗剤で抽出しました。透析はゆっくりプロテオリポソームを形成、洗剤を削除する使用ことができます
。浄化後いくつかの蛋白質をミスフォールドまたは変性、機能の損失に 。構造のこれらの変化を引き起こす化合物取除くことができる透析、機能分析の改革につながる
。あなた ' ve を見たゼウス ' s 透析ビデオ。今、拡散法、簡単な実験手法と本手法の使用を理解する必要があります
。見てくれてありがとう!
Procedure
Disclosures
Transcript
Biochemical samples typically have high buffer concentrations that can disrupt downstream processing and analysis. Dialysis is a common, inexpensive technique used to separate molecules based on diffusion. The method utilizes a semi-permeable membrane that allows the movement of certain components, based on size. This video will show the concepts of dialysis, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
The most important aspect of dialysis is a semi-permeable membrane, which has pores that impose a molecular weight cut-off, allowing molecules below a certain size to pass through. For example, a 10k membrane will generally retain molecules larger than 10 kilodaltons. However, the molecular weight cutoff is not a discrete or precise boundary. The membrane typically contains a broad range of pore sizes, so a small fraction of molecules near the cutoff may be lost.
Since the molecular weight cutoff is defined using globular proteins, linear molecules of similar mass, like DNA or RNA, may slip through. Membranes are typically chosen one half to one third the molecular weight of the desired molecule.
To perform the procedure, a sample is placed into the membrane, which is in turn added to a large volume of solution, called the dialysate. Over time, smaller molecules will diffuse freely across the membrane between the sample and the dialysate, while the larger biomolecules are held within. Dialysis is a slow process. It is common to allow it to run overnight, or even across multiple days.
If the dialysate is pure water, the overall buffer concentration will decrease, a process known as desalting. If the solution contains other small particles, some will move into the sample, leading to buffer exchange. Because dialysis is an equilibrium process, the dialysate can be refreshed multiple times to further displace small molecules. Once the process is complete the sample is re-collected for further processing.
Now that you’ve seen the basics of dialysis, let’s take a look at a general procedure.
Before beginning the procedure, the membrane is presoaked in dialysate. This makes it easier to use, and removes any preservatives. Once ready, the sample is collected, typically with a syringe and is then added to the dialysis container. This can be bare tubing, or contained within a cassette. Excess air is removed from the dialysis setup to maximize the sample’s surface area with the membrane. The setup is then placed into the dialysate with stirring to maximize the diffusion. It should float to not inhibit stirring.
The dialysate is changed at relevant intervals as equilibrium between sample and dialysate is reached. After the last change, the reaction is typically left to run overnight. After a sufficient time period, the buffer-free or -exchanged sample is removed from the cassette. Once collected, the sample can be analyzed or further processed, depending on the nature of the experiment.
Now that we’ve looked at a general dialysis procedure, let’s see some of the ways this technique is used in biochemistry.
Density gradients are a common way to separate complex biological samples. This concept relies on the distribution on small particles, typically sucrose or cesium chloride ions. Once complete, these reagents typically need to be removed before the collected sample can be processed. Dialysis makes it possible to utilize the purified sample for future analysis.
Certain proteins are found within a cell’s lipid bilayer, and are usually studied by interspersing them into spherical lipid vesicles known as liposomes. The proteins and lipids are first extracted with a detergent. Dialysis can be used to slowly remove the detergent, forming proteoliposomes.
After purification, some proteins are misfolded, or denatured, leading to a loss in functionality. The compounds that cause these changes in structure can be removed with dialysis, leading to the reformation of functioning analytes.
You’ve just watched JoVE’s video on dialysis. You should now understand this diffusion-based method, a simple experimental procedure, and the use of this technique.
Thanks for watching!
