Diálise: Separação baseada em difusão
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Overview
A diálise é uma técnica comum usada na bioquímica para separar moléculas baseadas na difusão. Neste procedimento, uma membrana semipermeável permite o movimento de certas moléculas com base no tamanho. Este método pode ser aplicado à remoção de tampão, conhecido como desselting, ou troca de moléculas tampão ou íons de uma solução proteica.
Este vídeo abrange os princípios da diálise, juntamente com um procedimento geral. Várias aplicações da diálise são revisadas, incluindo a remoção de reagentes gradientes após a ultracentrifugação, a remoção do detergente após uma extração de proteína de membrana e a reconstituição de proteínas mudando o ambiente de solução.
As amostras bioquímicas normalmente têm altas concentrações de buffer que podem interromper o processamento e análise a jusante. A diálise é uma técnica comum e barata usada para separar moléculas baseadas na difusão. O método utiliza uma membrana semi-permeável que permite o movimento de certos componentes, com base no tamanho. Este vídeo mostrará os conceitos de diálise, um procedimento geral e alguns de seus usos na bioquímica.
O aspecto mais importante da diálise é uma membrana semi-permeável, que tem poros que impõem um corte de peso molecular, permitindo que moléculas abaixo de um certo tamanho passem. Por exemplo, uma membrana de 10k geralmente retém moléculas maiores que 10 kilodaltons. No entanto, o corte de peso molecular não é um limite discreto ou preciso. A membrana normalmente contém uma ampla gama de tamanhos de poros, de modo que uma pequena fração de moléculas perto do limite pode ser perdida.
Uma vez que o corte de peso molecular é definido usando proteínas globulares, moléculas lineares de massa semelhante, como DNA ou RNA, podem escapar. As membranas são tipicamente escolhidas de meio a um terço do peso molecular da molécula desejada.
Para realizar o procedimento, uma amostra é colocada na membrana, que por sua vez é adicionada a um grande volume de solução, chamado dialise. Com o tempo, moléculas menores se difundirão livremente através da membrana entre a amostra e o dialise, enquanto as biomoléculas maiores são mantidas dentro. Diálise é um processo lento. É comum permitir que ele seja executado durante a noite, ou mesmo em vários dias.
Se o dialise é água pura, a concentração total de tampão diminuirá, um processo conhecido como dessaciação. Se a solução contiver outras partículas pequenas, algumas se moverão para a amostra, levando à troca de buffer. Como a diálise é um processo de equilíbrio, o diálise pode ser atualizado várias vezes para deslocar ainda mais pequenas moléculas. Uma vez concluído o processo, a amostra é recolhia para posterior processamento.
Agora que você já viu o básico da diálise, vamos dar uma olhada em um procedimento geral.
Antes de iniciar o procedimento, a membrana é pré-diálise. Isso facilita o uso e remove quaisquer conservantes. Uma vez pronta, a amostra é coletada, tipicamente com uma seringa e, em seguida, adicionada ao recipiente de diálise. Isso pode ser tubos nus, ou contidos dentro de uma fita. O excesso de ar é removido da configuração da diálise para maximizar a área de superfície da amostra com a membrana. A configuração é então colocada no dialise com agitação para maximizar a difusão. Deve flutuar para não inibir a agitação.
O dialise é alterado em intervalos relevantes à medida que o equilíbrio entre a amostra e o dialise é atingido. Após a última mudança, a reação é normalmente deixada para funcionar durante a noite. Após um período de tempo suficiente, a amostra sem buffer ou trocada é removida do. Uma vez coletada, a amostra pode ser analisada ou processada posteriormente, dependendo da natureza do experimento.
Agora que olhamos para um procedimento geral de diálise, vamos ver algumas das maneiras que esta técnica é usada na bioquímica.
Gradientes de densidade são uma maneira comum de separar amostras biológicas complexas. Este conceito se baseia na distribuição de pequenas partículas, tipicamente íons de sacarose ou cloreto de césio. Uma vez concluídos, esses reagentes normalmente precisam ser removidos antes que a amostra coletada possa ser processada. A diálise permite utilizar a amostra purificada para análise futura.
Certas proteínas são encontradas dentro da bicamada lipídica de uma célula, e geralmente são estudadas intercalando-as em vesículas lipídicas esféricas conhecidas como lipossomos. As proteínas e lipídios são extraídos pela primeira vez com um detergente. A diálise pode ser usada para remover lentamente o detergente, formando proteoliposomes.
Após a purificação, algumas proteínas são desdobradas, ou desnaturadas, levando a uma perda de funcionalidade. Os compostos que causam essas mudanças na estrutura podem ser removidos com diálise, levando à reforma dos analitos funcionais.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE em diálise. Agora você deve entender este método baseado em difusão, um procedimento experimental simples e o uso desta técnica.
Obrigado por assistir!
Procedure
Disclosures
Transcript
Biochemical samples typically have high buffer concentrations that can disrupt downstream processing and analysis. Dialysis is a common, inexpensive technique used to separate molecules based on diffusion. The method utilizes a semi-permeable membrane that allows the movement of certain components, based on size. This video will show the concepts of dialysis, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
The most important aspect of dialysis is a semi-permeable membrane, which has pores that impose a molecular weight cut-off, allowing molecules below a certain size to pass through. For example, a 10k membrane will generally retain molecules larger than 10 kilodaltons. However, the molecular weight cutoff is not a discrete or precise boundary. The membrane typically contains a broad range of pore sizes, so a small fraction of molecules near the cutoff may be lost.
Since the molecular weight cutoff is defined using globular proteins, linear molecules of similar mass, like DNA or RNA, may slip through. Membranes are typically chosen one half to one third the molecular weight of the desired molecule.
To perform the procedure, a sample is placed into the membrane, which is in turn added to a large volume of solution, called the dialysate. Over time, smaller molecules will diffuse freely across the membrane between the sample and the dialysate, while the larger biomolecules are held within. Dialysis is a slow process. It is common to allow it to run overnight, or even across multiple days.
If the dialysate is pure water, the overall buffer concentration will decrease, a process known as desalting. If the solution contains other small particles, some will move into the sample, leading to buffer exchange. Because dialysis is an equilibrium process, the dialysate can be refreshed multiple times to further displace small molecules. Once the process is complete the sample is re-collected for further processing.
Now that you’ve seen the basics of dialysis, let’s take a look at a general procedure.
Before beginning the procedure, the membrane is presoaked in dialysate. This makes it easier to use, and removes any preservatives. Once ready, the sample is collected, typically with a syringe and is then added to the dialysis container. This can be bare tubing, or contained within a cassette. Excess air is removed from the dialysis setup to maximize the sample’s surface area with the membrane. The setup is then placed into the dialysate with stirring to maximize the diffusion. It should float to not inhibit stirring.
The dialysate is changed at relevant intervals as equilibrium between sample and dialysate is reached. After the last change, the reaction is typically left to run overnight. After a sufficient time period, the buffer-free or -exchanged sample is removed from the cassette. Once collected, the sample can be analyzed or further processed, depending on the nature of the experiment.
Now that we’ve looked at a general dialysis procedure, let’s see some of the ways this technique is used in biochemistry.
Density gradients are a common way to separate complex biological samples. This concept relies on the distribution on small particles, typically sucrose or cesium chloride ions. Once complete, these reagents typically need to be removed before the collected sample can be processed. Dialysis makes it possible to utilize the purified sample for future analysis.
Certain proteins are found within a cell’s lipid bilayer, and are usually studied by interspersing them into spherical lipid vesicles known as liposomes. The proteins and lipids are first extracted with a detergent. Dialysis can be used to slowly remove the detergent, forming proteoliposomes.
After purification, some proteins are misfolded, or denatured, leading to a loss in functionality. The compounds that cause these changes in structure can be removed with dialysis, leading to the reformation of functioning analytes.
You’ve just watched JoVE’s video on dialysis. You should now understand this diffusion-based method, a simple experimental procedure, and the use of this technique.
Thanks for watching!
