Réactions enzymatiques et cinétique
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Overview
Cinétique enzymatique décrit les effets catalytiques des enzymes, qui sont des biomolécules qui facilitent les réactions chimiques nécessaires aux organismes vivants. Enzymes agissent sur les molécules, appelées substrats, pour former des produits. Les paramètres cinétiques enzymatiques sont déterminés par l’intermédiaire de tests qui mesurent directement ou indirectement les changements dans la concentration de substrat ou de produit au fil du temps.
Cette vidéo couvre les principes de base des modèles cinétiques et de cinétique enzymatique (y compris les équations de taux). Les concepts régissant les essais enzymatiques sont également discutés, suivie d’un dosage colorimétrique typique. La section applications décrit un test enzymatique par analyse de transfert (FRET) de l’énergie par résonance Förster, caractérisant l’activité de l’enzyme extracellulaire dans l’environnement, et chargée de l’enquête ADN réparation cinétique utilisant molecular probes.
Les enzymes sont des catalyseurs biochimiques qui sont essentielles pour la vie. Des essais enzymatiques sont utilisés pour étudier les propriétés cinétiques de réactions enzymatiques, élucider les effets catalytiques des enzymes. Cette vidéo couvrira la cinétique enzymatique et dosages, passer d’un mode opératoire général et de montrer certaines applications.
Les enzymes sont des protéines ou protéine-comme des molécules qui agissent sur une molécule du réactif, dénommée le substrat. Enzymes réduisent l’énergie d’activation des réactions biochimiques. Cela permet aux réactions de se produire à un taux plus rapide avec la baisse des dépenses énergétiques.
Réactions enzymatiques peuvent être divisées en trois composantes élémentaires. Le premier est la formation de l’enzyme / substrate complexe, formé par la liaison du substrat pour le site actif de l’enzyme. Le complexe peut se décomposer en ses constituants originaux. Il s’agit de la deuxième réaction élémentaire. Sinon, le complexe peut former le produit et récupérer l’enzyme, la troisième réaction élémentaire.
La cinétique d’une réaction élémentaire est donnée par l’équation de droit élémentaire de taux. Équations de taux droit donnent le taux en fonction de la concentration des réactifs et une constante de vitesse. Chacune des réactions élémentaires a une équation de loi taux individuel, avec sa propre constante de vitesse. Ces équations peuvent se ramener à un modèle cinétique dite de l’équation de Michaelis-Menten. Cela donne la vitesse de réaction en fonction de la concentration du substrat ; qui peut être déterminée expérimentalement. Certaines tendances générales pour les réactions enzymatiques peuvent être identifiés à l’aide de l’équation de Michaelis-Menten. À une concentration élevée de substrat, un point de saturation est atteint, appelée Vmax. Ici, le taux est limité par la concentration de l’enzyme totale et le nombre de molécules de substrat une enzyme convertit en produit par avec le temps, également connu sous le nom de kcat. De Michaelis-Menten kcat cinétique est une des deux constantes qui régissent la vitesse de réaction. L’autre constante, KM, est connue comme la constante d’affinité. KM est aussi équivalente à la concentration où la vitesse de réaction est équivalente à un demi Vmax. Une enzyme avec une affinité plus élevée aura une plus faible KM et atteindre les Vmax plus rapidement, alors qu’une enzyme avec une affinité plus faible auront un KM plus haut et prendre plus de temps pour atteindre les Vmax. Sachant kcat et KM permet d’enzymes à comparer. Pour ce faire, nous utilisons un ratio appelé l’efficacité de l’enzyme. Kcat supérieur et inférieur KM entraînent une efficacité accrue, tandis que kcat inférieur et supérieur KM résultats en bas.
Les facteurs utilisés pour élucider la cinétique enzymatique doivent être déterminées expérimentalement. Ces tests sont généralement exécutées en mélangeant une solution d’enzyme et le substrat dans un environnement contrôlé. Observations sont faites en mesurant les changements dans la concentration du substrat, produits ou sous-produits en fonction du temps.
La variation de concentration au fil du temps est utilisée pour déterminer la vitesse de réaction. Afin de déterminer la cinétique, données de fréquence doivent être obtenues à des concentrations plusieurs. Si une parcelle de la vitesse initiale inverse par rapport à la concentration initiale inverse, connue comme le terrain de Lineweaver-Burk, est linéaire, puis la réaction suit une cinétique de Michaelis-Menten. La pente et l’intersection de la ligne permettant la détermination des paramètres cinétiques KM et Vmax, qui peut ensuite être utilisée pour calculer kcat et l’efficacité de l’enzyme.
Maintenant que les principes de la cinétique enzymatique ont été discutées, regardons comment effectuer un dosage enzymatique typique.
Dans cette procédure, un dosage colorimétrique est démontré. La première étape consiste à générer une courbe d’étalonnage, qui fera la corrélation absorbance avec concentration en protéine. Solutions de concentration connue sont préparées avec un échantillon de contrôle. Une solution de développeur qui réagit avec la protéine cible est ajoutée pour produire un composé coloré. Absorbance est mesurée et comploté contre la concentration pour générer la courbe d’étalonnage.
Pour effectuer le test, une concentration de substrat est préparée ainsi que le montant approprié de l’enzyme. L’enzyme et le substrat sont mélangés et incubés pendant un intervalle de temps programmé. pH et la température sont contrôlés avec des blocs de chauffage et de la solutions tampons. Un agent d’extinction est ajouté pour arrêter la réaction. Solution de développeur est ensuite ajoutée aux réactions et mélangée. Les solutions sont ensuite placées dans des cuvettes et l’absorbance est mesurée. La quantité de substrat consommé est déterminée en comparant l’absorbance mesurée à la courbe standard. En utilisant les données recueillies, la réaction initiale taux sont déterminés en traçant la concentration au fil du temps. Enfin, avec les données de fréquence et de la concentration, l’intrigue de Michaelis-Menten est faite. Ceci permet la détermination des propriétés cinétiques de l’enzyme comme efficacité nombre et enzyme de chiffre d’affaires.
Maintenant que nous avons passé en revue un mode OPERATOIRE, regardons autrement analyses et leurs applications.
Dans cette procédure frette analyse est utilisée pour étudier la cinétique d’une protéase hydrolyse d’une liaison peptidique d’une protéine. Ces émissions peuvent être mesurées, permettant une analyse continue et quantitative de la production et de consommation du substrat, aider à la détermination de la cinétique de réaction.
Des essais enzymatiques peuvent être utilisés en sciences de l’environnement pour déterminer les niveaux d’activité de l’enzyme extracellulaire dans l’environnement. Eaux, sols et sédiments peuvent être prélevés dans l’environnement et manipulés dans le laboratoire. Activité enzymatique extracellulaire de ces matériaux peut ensuite être caractérisée à l’aide d’essais enzymatiques. Il s’agit d’un outil utile pour comprendre comment l’environnement traite les matières organiques.
Mécanisme de réparation de l’ADN de la cellule peut être évalué par l’étude de la cinétique des enzymes présentes dans le noyau. Le taux auquel une enzyme supprime les dommages, ou lésions de l’ADN peut être mesuré à l’aide de balises moléculaires fluorescents, qui seulement sont fluorescents lorsqu’elle est liée à des séquences d’ADN uniques. Le niveau de réparation de l’ADN peut être mesuré en temps réel en détectant les produits de clivage fluorescent étiquetés.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la cinétique enzymatique et dosages. Cette vidéo explique la cinétique enzymatique, couvert des concepts de dosage, passèrent une procédure générale et décrit certaines applications.
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Procedure
Disclosures
Transcript
Enzymes are biochemical catalysts that are essential for life. Enzyme assays are used to study the kinetic properties of enzymatic reactions, elucidating the catalytic effects of enzymes. This video will cover enzyme kinetics and assays, go over a general procedure, and show some applications.
Enzymes are proteins, or less often RNAs, that act on a specific reactant, referred to as the substrate. An enzyme reduces the activation energy needed to initiate a biochemical reaction, causing the reaction to occur at a faster rate.
Enzymatic reactions can be broken up into three elementary components. The first is the formation of the enzyme-substrate complex, formed by the binding of the substrate to the enzyme active site. The complex can decompose into its original constituents. This is the second elementary reaction. Alternatively, the complex can form the product and recover the enzyme, the third elementary reaction.
The kinetics of an elementary reaction is given by the elementary rate law equation. Rate law equations give the rate in terms of the concentration of the reactants and a rate constant. Each of the elementary reactions has an individual rate law equation, with its own rate constant. These equations can be distilled down to a kinetic model known as the Michaelis-Menten equation. This gives the reaction rate in terms of the substrate concentration; which can be experimentally determined. Some general trends for enzyme reactions can be identified using the Michaelis-Menten equation. At high substrate concentration, a saturation point is reached, called Vmax. Here, the rate is limited by the total enzyme concentration, and the number of substrate molecules an enzyme converts into product per given time, also known as kcat. In Michaelis-Menten kinetics kcat is one of the two constants that govern reaction rate. The other constant, KM, is known as the affinity constant. KM is also equivalent to the concentration where the reaction rate is equivalent to one-half Vmax . An enzyme with a higher affinity will have a lower KM and reach Vmax faster, while an enzyme with lower affinity will have a higher KM and take longer to reach Vmax. Knowing kcat and KM allows for enzymes to be compared. To do this we use a ratio called enzyme efficiency. Higher kcat and lower KM result in higher efficiencies, while lower kcat and higher KM results in lower.
The factors used to elucidate enzyme kinetics must be determined experimentally. These assays are typically performed by mixing an enzyme and substrate solution in a controlled environment. Observations are made by measuring the changes in concentration of the substrate, product, or byproducts with respect to time.
The change in concentration over time is used to determine the reaction rate. In order to determine the kinetics, rate data must be obtained at multiple concentrations. If a plot of the inverse initial rate vs. inverse initial concentration, known as the Lineweaver-Burk plot, is linear, then the reaction follows Michaelis-Menten kinetics. The slope and intercept of the line allow for the determination of the kinetic parameters KM and Vmax, which can then be used to calculate kcat and the enzyme efficiency.
Now that the principles of enzyme kinetics have been discussed, let’s look at how a typical enzyme assay is performed.
In this procedure a colorimetric assay is demonstrated. The first step is to generate a standard curve, which will correlate absorbance with substrate concentration. Solutions of known concentration are prepared along with a control sample. A developer solution that reacts with the substrate is added to produce a colored compound. Absorbance is measured and plotted against concentration to generate the standard curve.
To perform the assay, a known concentration of substrate is prepared along with the appropriate amount of enzyme. The enzyme and substrate are mixed and allowed to incubate for a set time interval. pH and temperature are controlled with buffer solutions and heating blocks. A quenching agent is added to stop the reaction. Developer solution is then added to the reactions and mixed. The solutions are then placed in cuvettes and absorbance is measured. The amount of substrate consumed is determined by comparing the measured absorbance to the standard curve. Using the collected data, initial reaction rates are determined by plotting concentration over time. Finally, with the rate data and concentration, the Michaelis-Menten plot is made. This allows for the determination of kinetic properties for the enzyme such as turnover number and enzyme efficiency.
Now that we’ve reviewed an assay procedure, let’s look at other ways assays are performed and their applications.
In this procedure FRET analysis is used to study the kinetics of a protease hydrolyzing a peptide bond of a protein. These emissions can be measured, allowing for a continuous and quantitative analysis of substrate consumption and production, aiding in the determination of the reaction kinetics.
Enzyme assays can be used in environmental science to determine the levels of extracellular enzyme activity in the environment. Waters, soils, and sediments can be collected from the environment and processed in the laboratory. Extracellular enzymatic activity of these materials can then be characterized using enzyme assays. This is a useful tool for understanding how the environment processes organic material.
A cell’s DNA repair mechanism can be evaluated by studying the kinetics of enzymes found in the nucleus. The rate at which an enzyme removes DNA lesions, or damages, can be measured using fluorescent molecular beacons, which only fluoresce when bound to unique DNA sequences. The level of DNA repair can be measured in real time by detecting the fluorescently labeled cleavage products.
You’ve just watched JoVE’s video on enzyme kinetics and assays. This video explained enzyme kinetics, covered assay concepts, went over a general procedure, and described some applications.
Thanks for watching!
