Ensaios Enzimáticos e Cinética
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Overview
A cinética enzimática descreve os efeitos catalíticos das enzimas, que são biomoléculas que facilitam reações químicas necessárias para organismos vivos. Enzimas atuam em moléculas, conhecidas como substratos, para formar produtos. Os parâmetros cinéticos enzimáticos são determinados através de ensaios que medem direta ou indiretamente mudanças no substrato ou concentração do produto ao longo do tempo.
Este vídeo abordará os princípios básicos da cinética enzimática (incluindo equações de taxa) e modelos cinéticos. Os conceitos que regem os ensaios enzimáticos também são discutidos, seguidos por um típico ensaio colorimétrico. A seção de aplicações discute um ensaio enzimático via análise de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET), caracterizando atividade enzimática extracelular no ambiente e investigando cinética de reparo de DNA usando sondas moleculares.
Enzimas são catalisadores bioquímicos essenciais para a vida. Ensaios enzimáticos são usados para estudar as propriedades cinéticas das reações enzimáticas, elucidando os efeitos catalíticos das enzimas. Este vídeo cobrirá cinética e ensaios enzimáticos, passará por um procedimento geral e mostrará algumas aplicações.
Enzimas são proteínas, ou menos frequentemente RNAs, que agem em um reagente específico, referido como o substrato. Uma enzima reduz a energia de ativação necessária para iniciar uma reação bioquímica, fazendo com que a reação ocorra em uma velocidade mais rápida.
Reações enzimáticas podem ser divididas em três componentes elementares. A primeira é a formação do complexo enzimá-substrato, formado pela ligação do substrato ao local ativo da enzima. O complexo pode se decompor em seus constituintes originais. Esta é a segunda reação elementar. Alternativamente, o complexo pode formar o produto e recuperar a enzima, a terceira reação elementar.
A cinética de uma reação elementar é dada pela equação da lei de taxa elementar. Equações de lei de taxas dão a taxa em termos de concentração dos reagentes e uma taxa constante. Cada uma das reações elementares tem uma equação de lei de taxa individual, com sua própria constante taxa. Estas equações podem ser destiladas até um modelo cinético conhecido como equação de Michaelis-Menten. Isso dá a taxa de reação em termos de concentração de substrato; que pode ser experimentalmente determinado. Algumas tendências gerais para reações enzimáticas podem ser identificadas usando a equação de Michaelis-Menten. Na alta concentração de substratos, um ponto de saturação é atingido, chamado Vmax. Aqui, a taxa é limitada pela concentração total da enzima, e o número de moléculas de substrato que uma enzima converte em produto por determinado tempo, também conhecido comok cat. Em Michaelis-Menten cinética kgato é uma das duas constantes que governam a taxa de reação. A outra constante, KM, é conhecida como a constante de afinidade. KM também é equivalente à concentração onde a taxa de reação é equivalente a meio Vno máximo . Uma enzima com maior afinidade terá um KM mais baixo e atingirá vmax mais rápido, enquanto uma enzima com menor afinidade terá um KM mais alto e levará mais tempo para chegar aoV max. Conhecer kgato e KM permite que enzimas sejam comparadas. Para fazer isso, usamos uma proporção chamada eficiência enzimápica. Gatok mais alto e KM inferior resultam em maior eficiência, enquantok cat inferior e km mais alto resulta em menor.
Os fatores utilizados para elucidar cinética enzimática devem ser determinados experimentalmente. Esses ensaios são tipicamente realizados misturando uma solução enzimático e substrato em um ambiente controlado. Observações são feitas medindo as mudanças na concentração do substrato, produto ou subprodutos em relação ao tempo.
A mudança de concentração ao longo do tempo é usada para determinar a taxa de reação. Para determinar a cinética, os dados de taxa devem ser obtidos em múltiplas concentrações. Se um enredo da taxa inicial inversa vs. concentração inicial inversa, conhecida como o enredo lineweaver-Burk, é linear, então a reação segue a cinética de Michaelis-Menten. A inclinação e a interceptação da linha permitem a determinação dos parâmetros cinéticos KM e Vmax,que podem então ser usados para calcular kgato e a eficiência da enzima.
Agora que os princípios da cinética enzimática foram discutidos, vamos ver como um ensaio típico de enzimas é realizado.
Neste procedimento é demonstrado um ensaio colorimétrico. O primeiro passo é gerar uma curva padrão, que irá correlacionar a absorção com a concentração de substrato. Soluções de concentração conhecida são preparadas juntamente com uma amostra de controle. Uma solução de desenvolvedor que reage com o substrato é adicionada para produzir um composto colorido. A absorvência é medida e plotada contra a concentração para gerar a curva padrão.
Para realizar o ensaio, uma concentração conhecida de substrato é preparada juntamente com a quantidade apropriada de enzima. A enzima e o substrato são misturados e permitidos incubar por um intervalo de tempo definido. pH e temperatura são controladas com soluções tampão e blocos de aquecimento. Um agente saciado é adicionado para parar a reação. A solução do desenvolvedor é então adicionada às reações e misturadas. As soluções são então colocadas em cuvetas e a absorção é medida. A quantidade de substrato consumido é determinada comparando a absorvância medida com a curva padrão. Usando os dados coletados, as taxas iniciais de reação são determinadas por traçar a concentração ao longo do tempo. Finalmente, com os dados de taxa e concentração, a trama de Michaelis-Menten é feita. Isso permite a determinação de propriedades cinéticas para a enzima, como número de rotatividade e eficiência enzimática.
Agora que revisamos um procedimento de ensaio, vamos ver outras maneiras de os ensaios serem realizados e suas aplicações.
Neste procedimento, a análise fret é usada para estudar a cinética de uma protease hidrolise de uma ligação peptídea de uma proteína. Essas emissões podem ser medidas, permitindo uma análise contínua e quantitativa do consumo e produção de substratos, auxiliando na determinação da cinética de reação.
Ensaios enzimáticos podem ser usados em ciência ambiental para determinar os níveis de atividade enzimular extracelular no ambiente. Águas, solos e sedimentos podem ser coletados do meio ambiente e processados em laboratório. A atividade enzimática extracelular desses materiais pode então ser caracterizada por ensaios enzimáticos. Esta é uma ferramenta útil para entender como o ambiente processa material orgânico.
O mecanismo de reparação de DNA de uma célula pode ser avaliado estudando a cinética das enzimas encontradas no núcleo. A taxa na qual uma enzima remove lesões de DNA, ou danos, pode ser medida usando sinalizadores moleculares fluorescentes, que só fluorescem quando ligados a sequências de DNA únicas. O nível de reparação do DNA pode ser medido em tempo real, detectando os produtos de decote fluorescente rotulados.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre cinética enzimática. Este vídeo explicou cinética enzimática, cobriu conceitos de ensaio, passou por um procedimento geral e descreveu algumas aplicações.
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Procedure
Disclosures
Transcript
Enzymes are biochemical catalysts that are essential for life. Enzyme assays are used to study the kinetic properties of enzymatic reactions, elucidating the catalytic effects of enzymes. This video will cover enzyme kinetics and assays, go over a general procedure, and show some applications.
Enzymes are proteins, or less often RNAs, that act on a specific reactant, referred to as the substrate. An enzyme reduces the activation energy needed to initiate a biochemical reaction, causing the reaction to occur at a faster rate.
Enzymatic reactions can be broken up into three elementary components. The first is the formation of the enzyme-substrate complex, formed by the binding of the substrate to the enzyme active site. The complex can decompose into its original constituents. This is the second elementary reaction. Alternatively, the complex can form the product and recover the enzyme, the third elementary reaction.
The kinetics of an elementary reaction is given by the elementary rate law equation. Rate law equations give the rate in terms of the concentration of the reactants and a rate constant. Each of the elementary reactions has an individual rate law equation, with its own rate constant. These equations can be distilled down to a kinetic model known as the Michaelis-Menten equation. This gives the reaction rate in terms of the substrate concentration; which can be experimentally determined. Some general trends for enzyme reactions can be identified using the Michaelis-Menten equation. At high substrate concentration, a saturation point is reached, called Vmax. Here, the rate is limited by the total enzyme concentration, and the number of substrate molecules an enzyme converts into product per given time, also known as kcat. In Michaelis-Menten kinetics kcat is one of the two constants that govern reaction rate. The other constant, KM, is known as the affinity constant. KM is also equivalent to the concentration where the reaction rate is equivalent to one-half Vmax . An enzyme with a higher affinity will have a lower KM and reach Vmax faster, while an enzyme with lower affinity will have a higher KM and take longer to reach Vmax. Knowing kcat and KM allows for enzymes to be compared. To do this we use a ratio called enzyme efficiency. Higher kcat and lower KM result in higher efficiencies, while lower kcat and higher KM results in lower.
The factors used to elucidate enzyme kinetics must be determined experimentally. These assays are typically performed by mixing an enzyme and substrate solution in a controlled environment. Observations are made by measuring the changes in concentration of the substrate, product, or byproducts with respect to time.
The change in concentration over time is used to determine the reaction rate. In order to determine the kinetics, rate data must be obtained at multiple concentrations. If a plot of the inverse initial rate vs. inverse initial concentration, known as the Lineweaver-Burk plot, is linear, then the reaction follows Michaelis-Menten kinetics. The slope and intercept of the line allow for the determination of the kinetic parameters KM and Vmax, which can then be used to calculate kcat and the enzyme efficiency.
Now that the principles of enzyme kinetics have been discussed, let’s look at how a typical enzyme assay is performed.
In this procedure a colorimetric assay is demonstrated. The first step is to generate a standard curve, which will correlate absorbance with substrate concentration. Solutions of known concentration are prepared along with a control sample. A developer solution that reacts with the substrate is added to produce a colored compound. Absorbance is measured and plotted against concentration to generate the standard curve.
To perform the assay, a known concentration of substrate is prepared along with the appropriate amount of enzyme. The enzyme and substrate are mixed and allowed to incubate for a set time interval. pH and temperature are controlled with buffer solutions and heating blocks. A quenching agent is added to stop the reaction. Developer solution is then added to the reactions and mixed. The solutions are then placed in cuvettes and absorbance is measured. The amount of substrate consumed is determined by comparing the measured absorbance to the standard curve. Using the collected data, initial reaction rates are determined by plotting concentration over time. Finally, with the rate data and concentration, the Michaelis-Menten plot is made. This allows for the determination of kinetic properties for the enzyme such as turnover number and enzyme efficiency.
Now that we’ve reviewed an assay procedure, let’s look at other ways assays are performed and their applications.
In this procedure FRET analysis is used to study the kinetics of a protease hydrolyzing a peptide bond of a protein. These emissions can be measured, allowing for a continuous and quantitative analysis of substrate consumption and production, aiding in the determination of the reaction kinetics.
Enzyme assays can be used in environmental science to determine the levels of extracellular enzyme activity in the environment. Waters, soils, and sediments can be collected from the environment and processed in the laboratory. Extracellular enzymatic activity of these materials can then be characterized using enzyme assays. This is a useful tool for understanding how the environment processes organic material.
A cell’s DNA repair mechanism can be evaluated by studying the kinetics of enzymes found in the nucleus. The rate at which an enzyme removes DNA lesions, or damages, can be measured using fluorescent molecular beacons, which only fluoresce when bound to unique DNA sequences. The level of DNA repair can be measured in real time by detecting the fluorescently labeled cleavage products.
You’ve just watched JoVE’s video on enzyme kinetics and assays. This video explained enzyme kinetics, covered assay concepts, went over a general procedure, and described some applications.
Thanks for watching!
