Summary
우리는 작은 분자 기반 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)에 마우스 배아 줄기 세포의 차별 화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 차별화 후 30 일에 의해 고효율 Olig2 + NG2 + OPCs를 생성합니다. 우리는 또한 행동 잠재력을 불 수있다 "급상승"OPCs를 생성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Oligodendrocytes은 중추 신경계의 myelinating 세포 수 있습니다. demyelinating 질병의 재생 세포 치료, 이식을위한 혈통 - 최선을 다하고 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)의 순수한 인구 파생에 상당한 관심이 있습니다. OPCs는 전사 인자의 Olig2 및 proteoglycan의 NG2의 표면 표현의 활동에 의해 특징입니다. GFP - Olig2 (G - Olig2) 마우스 배아의 줄기 세포 (mESC) 기자 라인을 사용하여, 우리는 GFP + Olig2 + NG2 + OPCs에 mESCs의 차별 화를위한 조건을 최적화. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 먼저 mESCs에서 embryoid 기관의 세대 (EBS)를 설명합니다. 둘째, 우리는 작은 분자로 mESC - 파생 EBS의 치료를 설명 : (1) retinoic 산 (RA)와 정의 문화 조건 (2) 소닉 헤지 호그 (쉬) 작용제의 purmorphamine (PUR)는 oligodendroglial 혈통에 EB 차별을 직접합니다. 이 방법으로 OPCs 30 일 기간에 높은 효율 (> 80 %)로 구할 수 있습니다. 이 프로토콜의 mESCs에서 파생된 세포는 기본 조직 문화에서 파생된 OPCs에 phenotypically 비슷합니다. mESC 파생 OPCs는 현장에서 뇌 OPCs의 subpopulation에 대한 설명 급상승 속성을 표시하지 않습니다. 이 electrophysiological 속성을 연구하기 위해, 우리는 ectopically 나 표현하여 mESC - 파생 OPCs 춤을 추는의 생성을 설명
Protocol
GFP - Olig2 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)를 생성하는 자세한 절차 :
- 마우스 ES 세포 라인 GFP - Olig2 (G - Olig2)은 미국 유형 문화 수집 (ATCC)에서 구입. mESCs는 정기적으로 조사 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 계층에 삼일마다 passaged 있습니다. MEF 세포는 젤라틴 코팅 여섯 잘 조직 문화 판 ESCs을 passaging하기 전에 최소한 1 일 이상 0.1 %로 도금입니다. mESC 문화 매체 20 % 태아 소 혈청 (GIBCO), 2 MM L - 글루타민, 1 ㎜의 나트륨 pyruvate, 0.1 MM β - 메르 캅 토 에탄올 /, 1 % 불필요한 아미노산 (와 보충 Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) (GIBCO)입니다 NEAA), 1000 U / ML 백혈병 억제 인자.
- MES의 식민지가 하나의 셀에 (TrypLE, 5 분, 37 ° C) trypsinized 및 녹아웃 혈청 대체 (KSR) 중간에 중단되며, 다음 세포는 세포에서 코스타 초저 첨부 여섯 잘 플레이트 (코닝)으로 전송됩니다 50,000 세포 / cm 2 밀도. 이러한 조건에서 mESCs는 embryoid기구 (EBS)를 형성합니다. KSR 매체 20 % KSR, 1 MM 나트륨 pyruvate, 1 % NEAA, 그리고 0.1 MM β - 메르 캅 토 에탄올 /과 보완의 - 최소한의 필수적인 매체를 (- 멤)로 구성되어 있습니다.
- 일 4 일 7, retinoic 산 (RA, 0.2 M)와 purmorphamine (PUR, 1 M)은 같은 그림과 같이 포함되어 있습니다. KSR 또는 N2 매체에서 1A. N2 매체 1X의 N2의 보완, 1 MM 나트륨 pyruvate, 1 % NEAA, 그리고 0.1 MM β - 메르 캅 토 에탄올 /를 포함하는 - 멤입니다. 매체는 매일 변경됩니다.
- 일 8시, EBS는 N2 매체와 fibroblast 구성되어 OPC 매체에서 0.01 % polyornithine - 코팅 요리 TrypLE (5 분, 37 ° C) 및 도금을 사용하여 disaggregated 아르 성장 인자 - 2 (FGF - 2, 20, NG / ML). 중간 이틀마다 변경됩니다.
- 세포 trypsinized (TrypLE, 3 분, 37 ° C)과 그들이 합류이되면 매주 약을 replated 있습니다. 30 일, 세포의 80 %가 GFP/Olig2 표현을 표시하고, NG2 - 긍정적인 OPCs의 특징입니다.
- 급상승 OPCs를 생성하려면, BacMam 나 + 채널 키트 이러한 mESC - 파생 OPCs에 나 V 1.2 subunit을 소개하는 데 사용됩니다. BacMam 시약 (1 ML, 구성 요소가) 5 ML의 최종 볼륨 PBS와 혼합됩니다. 다음, 혼합 BacMam 시약 전에 PBS로 rinsing하기 (50~70%의 합류에서) 60mm 문화 접시에 mESC - 파생 OPCs 문화로 추가됩니다. 2 시간 보육 후, 혼합 BacMam 시약은 1X 확장기와 함께 보충 OPC 매체로 제거하고 교체합니다. 확장기는 구성 요소 B DMSO (구성 요소 C)에서 재구성됩니다. 다음, 추가 2 시간 보육 후 확장기와 매체 전체 OPC 매체로 제거하고 교체합니다. 세포는 24 시간 후에 assayed 있습니다.
대표 결과 :
그림에 표시된 차별 프로토콜을 다음. 1A, G - Olig2의 mESCs는 처음 embryoid 단체 (EBS) (그림의 1B)를 형성 KSR 매체에서 4 일간 정지되었습니다. 그렇다면, 우리는 순차적으로 RA와 PUR와 EBS를 취급. EBS는 4 일 모든 GFP의 형광을 표시하고 D8 (그림의 1B)에 강한 GFP의 형광을 표명하지 않았다. 이 시점에서, EBS는 trypsinized되었으며 성장 요인 FGF - 2와 함께 보충 N2 매체에 도금. 22일 (D30)에 대한 자세한 문화 후, GFP + 세포의 비율은 80.3에 도달 ± 0.6 % 우리의 유동세포계측법 결과에 따라. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 1C, GFP + 세포가 지속적으로 NG2 얼룩 (96.4 ± GFP 양성 세포의 1.3 % 긍정적인 NG2 및 94.8 ± NG2 긍정적인 세포의 1.5 %가 긍정적인 GFP 쓰셨)와 overlapped. 따라서, 이러한 전지는 OPCs으로 그들을 정의 GFP/Olig2 및 NG2을 표현.
mESC 파생 OPCs (76 셀)는 탈분극 (그림 2A)에 따라 행동 잠재력을 해고하지 못했습니다. 나 V 1.2 subunit를 들고 baculovirus와 transducing 후 다음 mESC 파생 OPCs (17 세포의 94.1 %, 16)는 (그림 2B)로 분류 급상승 수 있습니다.
그림 1. embryoid 신체의 프로토콜을 보여주는 OPCs로 GOlig - mESC의 분화. (A) 계획 (EB) 기반 및 작은 분자 기반 차별화. D8에서는 EBS가 disaggregated 및 도금했다. 그들이 합류되었을 때 세포는 주 당 한 번 passaged했다. (B) D8 아니지만 D4 EBS, GFP 발현을 보여주었다. (C) NG2 (빨간색)의 Immunostaining는 D30에서 GFP (녹색) 표현식과 일치했다. DAPI (파란색)은 핵을 식별하는 데 사용되었다. 스케일 바 : 20mm.
그림 2. 에 의해 mESC - 파생 OPCs를 nonspiking에서 난리 OPCs의 생성 바이러스 중재 셀 0으로 depolarized 때도 나 V 채널 표현. (A) 멤브레인 가능성은 -60 뮤직 비디오와 mESC 파생 OPCs에서 개최 되었음, 액션 잠재력을 발사하는 데 실패 MV. (B) mESC 파생 OPC의 예바이러스 전달 후 행동 잠재력을 (빨간색으로 강조) 발사.
Discussion
blastocyst의 배아에서 분리된 배아 줄기 세포 (ESCs)는, oligodendrocyte 사양을 포함하여 초기 포유류의 개발 연구를위한 체외 모델 시스템을 제공하는 유기체 3, 4의 모든 세포 lineages로 구별하실 수 있습니다. mESCs는 소닉 헤지 호그 (쉬) 5의 치료 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)로 차별화하는 표시되었습니다. 또한, mESCs에서 쉬 유발 OPC의 차별화는 배아 개발 6 관찰 올바른 타이밍을 유지합니다. 따라서 mESCs에서 체외 OPC의 분화에의 성격은 생체내 개발에 배운되었습니다 것과 일치로 간주됩니다. 여기, 작은 분자 RA와 쉬 작용제의 PUR 사용, 우리는 성공적으로 고효율 GFP + Olig2 + NG2 + OPCs에 G - Olig2 mESCs을 차별.
그들은 전체 세포의 상당한 비율 (~ 5 %)를 구성하고 어디 proteoglycan NG2 7 표현과 나선형 루프 - 나선의 전사 인자 Olig2 8 시까지 특징 OPCs는, 개발하고 성숙한 CNS에 oligodendrocytes를 생성 주요 proliferating 세포 유형 9. V 채널 나 보여준 근 20 년 연구가들은 OPCs의 subpopulation 표현하고 탈분극 10, 11시 활성화할 수 있습니다. 또한, 최근 인상적인 관찰 9 전압 - 게이 티드 나트륨 (나 V) 채널의 표현에 따라 언제 depolarized 흰 물질 현장 쥐 CNS에서에서 OPCs는 (~ 50 %) 액션 잠재력을 생성하기 때문에 난리로 세분화 될 수 있다고했습니다 와 subpopulations을 nonspiking. 그러나 이러한 요동 치고 속성의 기능은 여전히 대부분 알 수 있습니다. 우리는 electrophysiologically, 쉬 - 의존 프로토콜 차별화된 mESC 파생 OPCs는 현장 뇌 OPCs에서 같은이 아니라, 사실을 발견했습니다. subunit 나 V 1.2를 소개하면 다음과 침묵 mESC 파생 OPCs가 튀어 오르고 수 있었다.
따라서 요동 치고 / mESC - 파생 OPCs과 차별화 프로토콜 여기에 설명된 내용을 nonspiking (1) OPCs 춤을 추는과 nonspiking 사이의 기능적 차이, (2) mESC 파생 OPCs에 나트륨 채널 표현을 촉진 수도 선별 새로운 요소를 공부하고 용이하게 수 있습니다 ( 3) 개발 및 인간 ESC 또는 유도 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)에서 OPCs의 차별 프로토콜을 최적화.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 일부 보건 국립 연구소 (RO1 NS059043 및 RO1 ES015988), 국립 다중 경화증 학회, 빈혈 연구, Feldstein 의료 재단 로체 재단, 어린이를위한 이너스 병원에서 WD로 보조금에 의해 지원되었다.
우리는 제안 데이빗 플레져와 제니퍼 비행기를 감사하고 싶습니다. 우리는이 문서에 관한 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
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