Summary
Denna rapport ger en detaljerad beskrivning av den metod och resultat av samtidig endokardiell och epicardial optisk kartläggning av elektriska excitation i intakt vänster förmak av en Langendorff-perfusion får hjärtat under stretch-induced förmaksflimmer.
Abstract
Förmaksflimmer (AF) är ett komplext hjärtarytmi med hög sjuklighet och dödlighet. 1,2 Det är den vanligaste ihållande hjärtrytm störningar ses i klinisk praxis och dess prevalens förväntas öka under kommande år. 3 Ökad intraatriell trycket och dilatation har länge insett att leda till AF, 1,4 som belyser betydelsen av att använda djurmodeller och sträcka för att studera AF dynamik. Att förstå mekanismerna bakom AF kräver visualisering av hjärtats elektriska vågor med hög rumslig och tidsmässig upplösning. Medan hög tidsupplösning kan åstadkommas genom konventionella elektriska kartläggning som traditionellt används i mänskliga elektrofysiologiska studier begränsar fåtal intraatriell elektroder som kan användas samtidigt den rumsliga upplösningen och utesluter all detaljerad spårning av de elektriska vågorna under arytmi. Införandet av optiska kartläggning i början av 90-talet aktiverade brett fält karaktärisering av fibrillatory aktivitet tillsammans med sub-millimeter rumsliga upplösningen i djurmodeller 5,6 och ledde till identifiering av snabbt snurrande elektrisk våg mönster (rotorer) som källorna till fibrillatory aktivitet som kan uppstå i kamrarna eller förmaken. 7-9 Använda kombinerad gång-och frekvens-domän analyser av optiska kartläggning är det möjligt att visa diskreta platser av högfrekvent återkommande aktivitet under AF, tillsammans med frekvensen gradienter mellan vänster och höger förmak . Regionen med snabbaste rotorer aktiveras vid högsta frekvens och driver övergripande arytmi. 10,11 Vågorna som härrör från sådana rotorn interagerar med antingen funktionella eller anatomiska hinder i deras väg, vilket resulterar i fenomenet fibrillatory överledning. 12 Kartläggning av endokardiell yta bakre vänster förmak (PLA) tillåter spårning av AF våg dynamik i regionen med den högsta rotorn frekvens. Viktigt är PLA den region där intracavitary kateter-baserat ablativ förfaranden är mest framgångsrika slutar AF hos patienter, 13 vilket understryker betydelsen av att studera AF dynamik från insidan av vänster förmak. Här beskriver vi ett får modell av akut stretch-inducerad AF, som liknar vissa av de egenskaper hos mänskliga paroxysmal AF. Epicardial kartläggning på vänster förmak kompletteras med endokardiell kartläggning av PLA med dubbla kanaler styva Borescope c-monterad på en CCD-kamera, som representerar den mest direkta metoden för att visualisera mönster av aktivering i de mest relevanta området för AF underhåll.
Protocol
1. Hjärta borttagning och Langendorff perfusion
Får som väger 35-40 kg är bedövas med hjälp av 4-6 mg / kg propofol och 60-100 mg / kg av natrium pentobarbital. Hjärtan tas bort via torakotomi och ansluten till en Langendorff-perfusion system med cirkulerande syresatt (95% O2, 5% CO2) Tyrode lösning vid ett konstant flöde av 240-270 ml / min, pH 7,4 och 35,5 till 37,5 ° C. Den Tyrode sammansättning (i mm) är: NaCl 130, KCl 4,0, MgCl2 1, CaCl2 1,8, NaHCO3 24, NaH2PO4 1,2, Glukos 5,6 och Albumin 0,04 g / L. Blebbistatin 10 mikrometer (Enzo Life Science International, Inc. Plymouth Meeting, PA, USA) används för att minska kontraktionskraft.
2. Stretch-inducerad förmaksflimmer i Langendorff-perfusion får hjärtat
De isolerade, koronar perfusion hjärtat genomgår ett förmaksflimmer trans-septal punktering att utjämnas intracavitary tryck i båda förmaken. Alla ven öppningar sedan förseglas, utom sämre hålvenen, som är kanylerade och ansluts till en digital sensor (Biopac Systems givare-TSD104A, Biopac Systems, Inc., Santa Barbara, USA) och till ett utflöde kanyl vars öppna höjd över förmaken styr intraatriell trycket. Trycket ökade sedan till 12 cm H 2 O, vilket leder till en ~ 30% ökning av förmaksflimmer volym i förhållande till volym 6 cm H 2 O. Trycket bibehålls stabil under hela experimentet. Innan tätning venerna tetrapolar elektroden katetrar (Torq, Medtronic Inc. / Minneapolis / MN / USA) är placerade i var och en av pulmonell vener att spela bipolär signaler från de två distala elektroder (samplingsfrekvens, 1,0 kHz) med en Biopac Systems förstärkare (DA100C, Biopac Systems, Inc., Santa Barbara, USA). Ytterligare två custum tillverkade bipolära elektroder placeras på taket av vänster förmak (LAA) och överst till höger förmak.
3. Optisk kartläggning upprätta
- Epicardial kartläggning av vänster förmak bihang. En bolusinjektion av 5 till 10 ml Di-4-ANEPPS (10 mg / ml) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) och en lastning period av 10 minuter behövs för att erhållas spänningskänsliga fluorescens på laser excitation (532 nm) av epicardial ytan. Den utsända fluorescensen överförs sedan via en 600 nm lång pass filter och projiceras på LittleJoe CCD-kamera (80x80 pixlar, SciMeasure Analytical Systems, Inc. Decatur, GA, USA) och fick med en hastighet av 800 bilder per sekund (se schematisk bild på Figur 1A). Fem sekunders filmer erhålls med 2 min intervall under AF. Det område av kartlagda epicardial ytan är ~ 14 cm 2.
- Endokardiell optiska kartläggning av PLA i intakt hjärtat. En andra LittleJoe CCD kamera (80x80 pixlar) är synkroniserad med epicardial kameran. En 10 mm diameter med dubbla kanaler stel Borescope (Everest VIT, Inc. Flandern, NJ, USA) med en 90-graders synfält införs genom den främre väggen i vänster kammare, över mitralisklaffstenos och fokuserade på endokardiell ytan av PLA. Det optiskt kartlade området på PLA är ~ 4 cm 2, vilket gör att visualisera de fyra pulmonell vener och förmaksflimmer septo-lung-paket (Figur 1A, B). Den Borescope är c-monteras på CCD-kameran via en skräddarsydd Okularadapter. Laser 532 nm ljus är sedan levereras till excitation kanalen i Borescope genom en flytande ljusledaren (0,2 i kärnan).
4. Förmaksflimmer protokoll
Under kontinuerlig förmak sträcka AF induceras via brast pacing (12 Hz, 5 ms pulser, 2x diastoliskt tröskel) genom ett tempo elektrod placerad på toppen av LAA. AF får fortsätta i 50 minuter och 5-sek optiska filmer förvärvas till två minuters intervall. Bipolär inspelningar samlas in kontinuerligt. Förvärv av optiska filmer utlöser samtidiga förvärvet av 5-sek segment av den bipolära inspelningar.
5. Frekvensanalys
Frekvensanalys möjligt att identifiera områden med hög aktiveringsgrad under AF, tillsammans med frekvensen gradienter mellan vänster och höger förmak. Dominerande frekvens (DF) kartor från varje optiska filmen efter att tillämpa en snabb Fouriertransform algoritm (FFT) till tidsserier fluorescenssignalen registreras i varje pixel. Är 7 FFT också tillämpas på 5 sekunder bipolär signaler (High-pass filtrerad vid 3 Hz och låg-pass filtreras vid 35 Hz) synkroniseras med optisk film.
6. Förmaksflimmer dynamik
- Generering av fas kartor. Analys av AF dynamik drar nytta av fas filmer genereras via Hilbert förvandling. 14 korthet är den momentana fasen av aktionspotentialen registreras vid varje pixel bestäms genom att omvandla den ursprungliga tidsserier signaler så att varje spektrala komponenter flyttas med motsvarande kvartal cykel 15. Afterwards, den momentana fasen av signalen från den omvända tangens av förhållandet mellan de omvandlas signalen till den ursprungliga signalen. Fasvinkeln, med värden mellan-π och π radianer representeras som en kontinuerlig färgskala för att bygga en fas karta, i vilken den kontinuerliga rumsliga fasövergång speglar processen excitation, repolarisering och återhämtning. 14
- Karakterisering av aktivering mönster. Olika klasser av aktivering mönster kan identifieras med hjälp av fas-filmer (figur 2), inklusive följande:
- En rotor identifieras genom närvaron av alla faser konvergera mot en singularitet punkt som varar mer än ett varv (figur 2A).
- Ett genombrott definieras som en vågfront som finns i synfältet och sprida utåt (Figur 2B) i ett mål-liknande mönster.
- Spatiotemporally organiserat periodiska vågor definieras som minst fyra sekventiella periodiska vågor fram från samma plats i synfältet, med liknande inriktning och inter-våg intervall (Figur 2c).
Ytterligare kvantifiering gör rumslig korrelation av högsta frekvens domäner med de vanligaste mönstret för aktivering från just den regionen. Det senare belyser den avgörande roll kartlägga endokardiell ytan av PLA, eftersom det vanligen representerar den region där den högsta frekvensen domäner ligger vid akuta AF.
7. Representativa resultat:
Dominerande frekvens (DF) övertoningar från PLA till LAA och Råå är närvarande vid akuta stretch-induced AF. Den högsta DF regionen är lokaliserade på eller nära en av pulmonell vener eller någonstans i PLA. 11 En representant AF-episod visas i figur 3, där den högsta DF är lokaliserad på PLA (Höger sämre pulmonell ven). Resultaten talar för förekomst av högfrekventa källor i PLA körning AF överens med vänster till höger DF gradienter observerades under ablativ förfaranden paroxysmal mänskliga AF. 16
Kvantifiering av mönster av aktivering med hjälp av filmer fas kartan visar att det högsta antalet rotorer finns på PLA och korsningen mellan PLA och LAA. 8 Ibland är det möjligt att identifiera långsiktiga rotorer som rotationscentrum (Singularity punkt) lokaliserar med den högsta frekvensdomänen. 10 Eftersom förmaksflimmer vävnad representerar en tredimensionell struktur, identifiera rotorer på den mappade endokardiell yta PLA tyder på att centrum för rotation av dessa rotorer (glödlampor) så småningom vinkelrätt mot ytan av den kartläggning området . Figur 4 visar en sådan rotor inspelad från endokardiet av PLA med samtidig fibrillatory överledning mot LAA, vilket också korrelerar med en frekvens lutning mellan PLA och LAA (9 och 6,4 Hz). Antalet rotorer är genomgående högre i PLA än LAA, vilket tyder på en väsentlig roll för återinträde på PLA att upprätthålla arytmi i denna modell.
Generellt sett är resultaten stödjer teorin om att en stabil och snabb rotorer i vänster förmak kan köra akut stretch-induced AF och utgår vågor genomgår komplexa, rumsligt fördelad mönster ledningshinder som de huvudet mot höger förmak, som manifesterar sig som fibrillatory överledning och gradvis minskande dominerande frekvens.
Figur 1. Schematisk representation av den experimentella inrättas. A: En styv Borescope införs genom den främre väggen i vänster kammare och mitralisklaffstenos öppning och fokuserade på endokardiell ytan av bakre vänster förmak (PLA). En CCD-kameran är kopplad till Borescope och laser belysning ges genom en laser vätska vägledning kopplad till sämre delen av Borescope. Epicardial kartläggning utförs på LAA. Bipolär elektroder placeras på höger förmak och tak av vänster förmak. Ytterligare bipolära signaler erhålls från pulmonell venerna. B: Lateral bild av vänster förmak följande öppna sidovägg för att illustrera. Spetsen på Borescope belyser endokardiell ytan av PLA. En bipolär elektrod är placerad på taket av vänster förmak. LAA: vänster förmak bihang. LV: vänster kammare. RA: höger förmak. RV: höger kammare.
Figur 2. Olika mönster av aktivering identifierats efter generation av fas filmer. A: Sekventiell snap shots av vänster förmak (LAA) visar vridbara av en rotor runt dess rotationscentrum (Singularity punkt). Från vänster till höger, är en full rotation klar. B: Ett prov genombrott aktivering mönster på LAA. Vågen visas uppper högra hörnet av synfältet och sprider sig utåt. C: Fyra spatiotemporally organiserat periodiska vågor (vid 0, 182, 352 och 512 ms, respektive) kommer från PLA regionen mot LAA. Isokroner ritas med 10 ms mellanrum. Botten, nyckel för de olika faserna av aktionspotentialens är färgkodad.
Figur 3. Identifiering av regioner som har den högsta frekvensen aktivitet under akuta stretch-induced AF i en Langendorff-perfusion isolerade får hjärtat. A: Anatomiska bild av vänster förmak (LAA), höger förmak (RAA) och bakre vänster förmak (PLA). PLA bild är en endoskopisk bild av kartlagda regionen med fyra pulmonell venerna (PV). B: DF kartor erhållas genom optiska kartläggning på LAA och PLA. Frekvens värde i RAA har erhållits från bipolär electrograms. Den högsta frekvensen regionen ligger i PLA. C: Representant makten spektra, där den högsta DF motsvarar 12,4 Hz vid PLA regionen rätt PV. LSPV: vänster överlägsen pulmonell ven. LIPV: vänster sämre pulmonell ven. RSPV: rätt överlägsen pulmonell ven. RIPV: rätt underlägsna pulmonell ven. Hämtad från referens 11 (David Filgueiras Rama & José Jalife. Mekanismerna bakom förmaksflimmer. I Basic Science för klinisk Electrophysiologist, Vol. 3 (red. Charles Antzelevitch) 141-156 (Saunders, 2011).
Figur 4. Simultaneousphase kartor (A, B) och dominerande kartor frekvens (C) från bakre vänster förmak (PLA) och vänster förmak (LAA). A: Sekventiell snap shots från PLA visar en rotor och drivande av sin singularitet punkt. B: Samtidig fas snap shots från LAA. Mönster för aktivering visar utbredning vågor kompatibel med fibrillatory överledning. Singularity poäng är också närvarande i samband med wavebreaks i fibrillatory ledning regionen. (Se även video 4) C: Samtidig dominerande frekvens kartor från PLA och LAA. Den snabbaste regionen ligger vid PLA (9 Hz), som korrelerar med förekomsten av en rotor i fas kartan analysen. Den högsta frekvensen på LAA är 6 Hz, vilket korrelerar med fibrillatory överledning. På höger sida av panelen C, är enda pixel optisk aktiveringar från PLA och LAA visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Egenskaperna hos akuta stretch-induced AF i den isolerade får hjärtat liknar några av de egenskaper hos mänskliga paroxysmal AF. En akut ökning intraatriell trycket i får hjärtat gör underhåll av AF för lång tid, liknande en högre risk för AF observerats hos patienter med förmaksflimmer dilatation. 1 Förekomst av vänster till höger DF gradienter i får Atria är också liknande dem som är registrerade i mänskliga elektrofysiologiska studier. 16 därför förstå mekanismen upprätthålla AF i detta akuta modell kan förbättra terapeutiska strategier som för närvarande används i mänskliga paroxysmal AF. Några av begränsningarna i det nuvarande strategin är: för det första, svårigheten att återge effekten av det autonoma nervsystemet på flimmer i isolerade hjärtan, vilket utesluter extrapolering av resultaten till in vivo situationer. Och för det andra, fokuserar modellen på akuta stretch-induced AF, och därför slutsatser inte bör utvidgas till att strukturellt remodeled hjärtan, i vilken fibros och förändringar i elektriska egenskaper kan påverka mönster av aktivering på PLA och LAA. Slutligen bör det noteras att på grund av optiska begränsningar samt toxiciteten av spänningskänsliga färgämnen och rörelse-frånkoppling föreningar, optisk kartläggning tekniker är för närvarande inte möjligt i levande individer.
Trots visade att använda optisk kartläggning och särskilt endokardiell kartläggning av PLA som i detta protokoll framsteg vårt mekanistisk förståelse av AF genom att identifiera det högsta antalet rotorer i den snabbaste frekvensen domäner. Det senare tyder på att återinträde kan vara avgörande för att upprätthålla den arytmi. Således olika farmakologiska strategier fokuserar på att avsluta återinträde kan studeras med hjälp av denna modell, vilket gör den lämplig för relevanta translationell studier.
Tekniska förbättringar i det optiska rangordning ständigt eftertraktade. Även det breda fält visa och hög spatial och temporal upplösning erhålls med optisk kartläggning möjliggör identifiering av långvariga rotorer på 2D-mappade ytan, väldigt ofta de rotorer rörelse från synfältet. Således skulle en mer panorama optisk rangordning möjliggöra bättre uppföljning av drivande rotorer och arytmi i allmänhet. Nya färger som ger djupare tränga in signaler och nya matematiska analyser kan också möjliggöra spårning rotorer och deras filament inuti 3D-strukturen för PLA väggen. Det senare skulle också möjliggöra en bättre förståelse av mönster av aktiveringar som tidigare beskrivits som yta genombrott, vilket kan innebära intramural reentrant aktivitet. Ytterligare förbättringar som eftersträvas är: minskad toxicitet av spänningskänsliga färgämnen, optiska prober för ytterligare fysiologiska parametrar såsom intracellulär kalcium koncentration, förbättrad föreningar och tekniker för rörelse minskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Delvis stöd i NHLBI Bidrag P01-HL039707 och P01-HL087226 och Leducq Foundation (JJ och OB), en spansk Society of Cardiology Fellowship, Fundación Pedro Barrie de la Maza och Fundación Alfonso Martín Escudero (DFR), genom Fédération Française de Cardiologie (RPM), genom en Heart Rhythm Society gemenskap Award, The Fellowship of Japan Heart Foundation / Det japanska samhället av Electrocardiology (MY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Propofol | Abbott Laboratories | 5206-04-03 | |
| Pentobarbital | Lundbeck Inc | NDC 67386-501-55 | |
| Introducer 18 Gauge | Terumo Medical Corp. | SS*FF1832 | |
| Cuffed endotracheal tube (9 mm) | DRE Veterinary | #9440 | |
| Fiber Optic Laryngoscope Case | DRE Veterinary | #991 | |
| Fiber Optic Blade | DRE Veterinary | #984 | |
| Operating Scissors | DRE Veterinary | #9702#1944 | |
| Scalpel Handle #3 Solid 4" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Sterile Scalpel Blades | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9801-10 | |
| Ventilation bag | Westmed | 562013 | |
| Sims Scissors Curved Sharp/Blunt | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 | |
| Tissue Forceps (×2) | DRE Veterinary | #1895 | |
| KANTROWITZ Thoracic Forceps, 11" | Biomedical Research Instruments | 34-1980 | |
| Finochietto Large Chest Spreader | Kapp Surgical Instrument Inc. | KS-7301 | |
| Thoracotomy shears | Rostfrei Solingen | ||
| Plastic tray | Nalge Nunc international | Fischer | |
| Bonn Scissors (×2) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5840SC | |
| Surgical silk | Fisher Scientific | 50-900-04214 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | |
| Tetrapolar electrode catheters (Torq) (×4) | Medtronic Inc. | 05580SP | |
| Digital sensor. Biopac Systems transducer | Biopac Systems, Inc. | RX104A | |
| Biopac Systems amplifier | Biopac Systems, Inc. | DA-100C | |
| Di-4-ANEPPS | Sigma-Aldrich | D8604-5mg | |
| Blebbistatin | Enzo Life Sciences | BML-E1315-0025 | |
| LittleJ– CCD video camera(×2) | SciMeasure Analytical Systems, Inc. | ||
| Dual-channel rigid borescope | Everest VIT, Inc. | R10-25-0-90 | |
| Perfusion pumps (×2) | Cole-Parmer | GK-77920-30 | |
| Temperature probe | Cole-Parmer | R-08491-02 | |
| pH meter | Fisher Scientific | 01-913-806 | |
| Digital temperature gauge | Cole-Parmer | GK89000-10 | |
| Oxygenator filters | Sorin | 05318 | |
| Silicon perfusion tubes (L/S 15) | Masterflex (Cole Palmer) | 96410-15 | |
| Laser light guides (×6) | Oriel Corp. | 77536 | |
| Liquid light-guide (0.2 in core) | Newport Corp. | 77556 | |
| Laser generator (1 watt) (×1) | Shanghai Dream Lsaer Tecchnology | SDL-532-1000T | |
| Laser generator (5 watt) (×1) | Newport Corp. | MILL 5sJ |
References
- Kannel, W. B., Wolf, P. A., Benjamin, E. J., Levy, D. Prevalence, incidence, prognosis, and predisposing conditions for atrial fibrillation: population-based estimates. Am J Cardiol. 82, (1998).
- Wolf, P. A., Abbott, R. D., Kannel, W. B. Atrial fibrillation as an independent risk factor for stroke: the Framingham Study. Stroke. 22, 983-988 (1991).
- Miyasaka, Y. Secular trends in incidence of atrial fibrillation in Olmsted County, Minnesota, 1980 to 2000, and implications on the projections for future prevalence. Circulation. 114, 119-125 (1980).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Gray, R. A., Pertsov, A. M., Jalife, J. Spatial and temporal organization during cardiac fibrillation. Nature. 392, 75-78 (1998).
- Gray, R. A.
- Samie, F. H. Rectification of the background potassium current: a determinant of rotor dynamics in ventricular fibrillation. Circ Res. 89, 1216-1223 (2001).
- Kalifa, J. Intra-atrial pressure increases rate and organization of waves emanating from the superior pulmonary veins during atrial fibrillation. Circulation. 108, 668-671 (2003).
- Mandapati, R., Skanes, A., Chen, J., Berenfeld, O., Jalife, J. Stable microreentrant sources as a mechanism of atrial fibrillation in the isolated sheep heart. Circulation. 101, 194-199 (2000).
- Yamazaki, M. Mechanisms of stretch-induced atrial fibrillation in the presence and the absence of adrenocholinergic stimulation: interplay between rotors and focal discharges. Heart Rhythm. 6, 1009-1017 (2009).
- Rama, D. F., Jalife, J. Mechanisms Underlying Atrial Fibrillation. Basic Science for Clinical Electrophysiologist. Antzelevitch, C. 3, SAUNDERS. 141-156 (2011).
- Berenfeld, O., Zaitsev, A. V., Mironov, S. F., Pertsov, A. M., Jalife, J. Frequency-dependent breakdown of wave propagation into fibrillatory conduction across the pectinate muscle network in the isolated sheep right atrium. Circ Res. 90, 1173-1180 (2002).
- Haissaguerre, M. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. N Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
- Warren, M. Blockade of the inward rectifying potassium current terminates ventricular fibrillation in the guinea pig heart. J Cardiovasc Electrophysiol. 14, 621-631 (2003).
- Claerbout, J. F. Fundamentals of Geophysical Data Processing. , McGraw-Hill. New York. (1976).
- Atienza, F. Real-time dominant frequency mapping and ablation of dominant frequency sites in atrial fibrillation with left-to-right frequency gradients predicts long-term maintenance of sinus rhythm. Heart Rhythm. 6, 33-40 (2009).
