Summary
We beschrijven een alternatieve benadering voor de opsomming van mycobacteriën
Abstract
Functionele testen al lang een belangrijke rol gespeeld bij het meten van de immunogeniciteit van een bepaald vaccin. Dit wordt conventioneel uitgedrukt als serum bactericide titers. Studies van serum bactericide titers in reactie van vaccins voor kinderziekten hebben ons in staat te ontwikkelen en cut-off te valideren niveaus voor beschermende immuunrespons en dergelijke cut-offs zijn in routine gebruik. Dergelijke testen zijn naar voren opgenomen in de routine evaluatie van de vaccins die in de eerste plaats cel-gemedieerde immuniteit in de vorm van effector T-cel responsen, zoals tuberculose vaccins induceren. In het diermodel, is de prestatie van een bepaalde kandidaat-vaccin regelmatig geëvalueerd in gestandaardiseerde bactericide testen, en alle huidige nieuwe TB-vaccin kandidaten zijn onderworpen aan deze stap in de evaluatie voorafgaand aan een menselijke proeven fase. De beoordeling van de immunogeniciteit en daarom de waarschijnlijkheid van beschermende werkzaamheid van nieuwe anti-TB-vaccins moet een soortgelijke stapsgewijze evaluatie idealiter nu ondergaan in de menselijke modellen, inclusief metingen in bactericide assays.
Bactericide assays in het kader van tuberculose vaccins onderzoek zijn al goed ingeburgerd in de diermodellen, waar ze worden toegepast op potentieel veelbelovende kandidaat-vaccins scherm. Reductie van bacteriële belasting in verschillende organen fungeert als de belangrijkste uitlezen van immunogeniciteit. Er zijn echter geen dergelijke tests zijn verwerkt in klinische studies voor nieuwe anti-TB vaccins tot nu toe.
Hoewel er nog steeds onzekerheid over de precieze mechanismen die leiden tot het doden van mycobacteriën in de menselijke macrofagen, is de interactie van macrofagen en T-cellen met mycobacteriën duidelijk nodig. De test beschreven in dit document vertegenwoordigt een nieuwe generatie van bactericide testen die studies van dergelijke belangrijke cellulaire componenten mogelijk maakt met alle andere cellulaire en humorale factoren aanwezig zijn in bloed, zonder het maken van veronderstellingen over de relatieve individuele bijdrage. De assay beschreven door onze groep maakt gebruik van kleine hoeveelheden van bloed en is al toegepast in studies met volwassenen en kinderen in TB-endemische instellingen. We hebben laten zien immunogeniciteit van het BCG-vaccin, de toegenomen groei van mycobacteriën bij HIV-positieve patiënten, evenals het effect van anti-retrovirale therapie en vitamine D op mycobacteriële overleving in vitro. Hier vatten we de methodologie, en presenteren onze reproduceerbaarheid gegevens met behulp van dit relatief eenvoudige, goedkope en veld-vriendelijke model.
Let op: Definities / Afkortingen
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal stam, getransformeerd met plasmide shuttle pSMT1 het dragen van de luxAB genen van Vibrio harveyi, onder de controle van de mycobacteriële GroEL (HSP60) promotor.
CFU = Colony Forming Unit (een maat voor mycobacteriële levensvatbaarheid).
Protocol
1. Voorbereiding van de BCG lux reporter mycobacteriën voorraad
- Grow BCG lux (M. bovis BCG Montreal stam getransformeerd met het plasmide pSMT1 shuttle) met schudden bij max. 200 omw tot medio logaritmische fase in Middlebrook 7H9 bouillon met 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 en 10% ADC verrijking.
- Bereid 1 ml van een 1:10 verdunning van BCG lux cultuur in steriele PBS in een luminometer buis (900μl PBS + 100μl BCG lux cultuur) in tweevoud.
- Laad buis met N-decyl aldehyde (luciferase enzym substraat) op de achterkant van de machine en zorgen voor de deksel is beveiligd en buizen op hun plaats.
- Prime luminometer injector met substraat via het eerste programma, ingesteld op 100 UCL x 3 injecteer in elk van de drie lege priming buisjes geplaatst in de luminometer.
- Laad de twee buizen in de luminometer en neem metingen via een programma ingesteld op het injecteren van 100 UCL van de ondergrond in elke buis en lezen voor 20 sec in 1 sec intervallen.
- Als de voorraad is 1x10 8 RLU / ml tot 2x10 8 RLU / ml (dit duurt ongeveer 3-4 dagen van de groei) bereikt, voeg een gelijk volume van steriele 30% glycerol aan de cultuur in een 50 ml falcon buis en meng.
- Aliquot 1,5 ml volumes in gelabelde 2ml schroefdop microbuisjes en bewaar bij -80 ° C.
2. Het bepalen van voorraad RLU / CFU correlatie en de inhoud van aliquots
- Voeg 15 ml van Middlebrook 7H9 kweekmedium met 10% ADC aanvulling op een 200 ml erlenmeyer met een geventileerde dop.
- Voeg 15μl van hygromycine en 30μl van 20% Tween.
- Verwijder een flacon van BCG lux uit de vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur (RT) in de veiligheidskast. Voeg de inhoud van de flacon aan het medium en draai de dop.
- Incubeer met schudden bij max. 200 omw bij 37 ° C gedurende 4 dagen.
- Op elke dag, make-up serie 10-voudige verdunningen (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 en 1:100.000) voor de bepaling CFU.
- Stel dezelfde verdunningen parallel en dupliceren om licht te bepalen (zie deel 1.2 tot 1.6).
- Bereid twee 3-compartimenten platen van Middlebrook 7H11 agar (1 liter vloeibaar medium dat 0,5% glycerol, 10% OADC te vullen, 1 ml van 20% Tween en 1 ml hygromycine).
- Plaat uit 100μl van elke verdunning op een segment van elke plaat met behulp van aparte spreaders, het verdelen van de vloeistof gelijkmatig over de individuele kamer.
- Seal elk bord met parafilm, plaats in een steriele plastic zak, afdichting met autoclaaf tape, en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 weken met deksel naar beneden.
- Inspecteer regelmatig tot CFU's worden weergegeven (2-3 weken).
- Te tellen kolonies, verwijder de platen uit de couveuse en plaats deze op een kolonie teller. Bereken het gemiddelde voor elke verdunning van de dubbele platen.
- Bereken de RLU / CFU-verhouding met vergelijkbare RLU en CFU telt voor elke verdunning. De verhouding moet tussen de 3 en 5 RLU / CFU.
3. Voorbereiding van de BCG lux cultuur voor enting in volbloed
- Voeg 15 ml van Middlebrook 7H9 kweekmedium met 10% ADC aanvulling op een 200 ml erlenmeyer met een geventileerde dop.
- Voeg 15μl van hygromycine en 30μl van 20% Tween.
- Verwijder een flacon van BCG lux uit de vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur in de veiligheid kast. Voeg de inhoud van de flacon aan het medium en draai de dop.
- Incubeer met schudden bij max. 200 omw bij 37 ° C gedurende 2 tot 4 dagen.
- Bereid 1 ml van een 1:10 verdunning van BCG lux cultuur in steriele PBS in een luminometer buis (900μl PBS + 100μl BCG lux cultuur) in tweevoud.
- Prime luminometer met substraat (zoals hierboven beschreven), voorzichtig vortex van de twee buizen en laden in de luminometer en neem metingen (zoals hierboven beschreven).
- Gebruik deze lezing te verdunnen af van de cultuur in PBS tot een equivalent van 7x10 6 RLU (dit wordt een inoculum van ongeveer 2x10 5 CFU / ml bloed en een verhouding van BCG te geven aan monocyten van ongeveer 1:1, uitgaande van een monocyt telling van geven ongeveer 2x10 5 tot 4x10 5 monocyten per ml bloed).
4. Voorbereiding van de volbloed
- 3 tot 5 ml van veneuze bloed in een buisje met conserveermiddel-vrije heparine.
- Breng het bloed aan een 50 ml falcon buis en verdunnen met een gelijk volume van RPMI 1640 met glutamine en 25mm HEPES (geen pen / strep).
- Aliquot 900μl van verdund bloed in drievoud in steriele bijou buizen voor elk tijdstip (6 tubes in totaal:. 3 voor 0 uren en 3 voor 96hrs instellen van extra buizen voor extra tijdstippen, indien nodig.
- Aliquot 900μl van Middlebrooks 7H9 kweekmedium met 10% ADC aan te vullen + 50μg/ml hygromycine (hetzelfde medium als gebruikt om de cultuur van de BCG lux) in tweevoud voor de groei controles.
- Voeg 100μl van het verdunde BCG lux aan elke buis van bloed, en om de 2 groei van controlebuizen.
- Meng goed en de drie bijous voor de 96-uurs tijd-punt en de 2 groei controles aan hun zijde in de schommelstoel incubator bij 37 ° C plaats, 20 omw / min (CO 2 niet vereist).
5. Het meten van luminescentie (bij 0hr en 96hrs)
- Centrifuge de drie bijous bij 2000g gedurende 10 minuten.
- Zorgvuldig 300μl van het supernatans verwijderen zonder de pellet te verstoren en de plaats in 2 ml schroefdop microbuisjes te vriezen bij -80 ° C voor verdere cytokine analyse.
- Voeg 300μl van PBS aan elk bijou om het volume van het supernatans verwijderd te vervangen.
- Zuigen de inhoud van elke bijou in de overeenkomstige 50 ml Falcon buis en voeg 8ml gedestilleerd water aan elke buis. Begin een timer voor 10 minuten.
Nb: Dit is een tijd-gevoelige stap, en dit incubatie dient niet langer dan 10 minuten, worden vanaf het moment dat de cellen eerst in contact komen met water. - Spoel elk bijou met 2 ml gedestilleerd water en vortex gedurende 5 seconden voordat kantelen in de overeenkomstige falcon buis.
- Aan het einde van de 10 minuten incubatie, centrifuge de valk buizen bij 2000g gedurende 10 minuten.
- Giet supernatant in Surfanios ontsmettingsmiddel.
- Voeg een paar glazen kralen aan elke pellet en vortex.
- Voeg 1 ml steriele PBS aan elke buis en vortex.
- In luminometer buizen, maken 1:10 verdunningen voor elk monster in duplo met PBS (900μl PBS + 100μl steekproef) en op het 96-uurs tijd-punt. Maak dezelfde verdunningen voor elk van de groei van controles.
- Voorzichtig vortex de buizen en laden in de luminometer en neem metingen (zoals hierboven beschreven)
NB: Lezingen tussen drie exemplaren van hetzelfde monster moet binnen 15% van elkaar.
6. Representatieve resultaten:
Het is belangrijk om bacteriën te gebruiken in logaritmische fase van groei voor de volbloed lux analyses, dat wil zeggen gegroeid 48-72 uur voorafgaand aan de inoculatie van de monsters, zoals metabolische activiteit is niet optimaal als een van beide direct uit de vriezer of in de stationaire fase. De voorafgaande groei moet worden gestandaardiseerd voor een reeks experimenten om ofwel 48 of 72 uur om de variabiliteit te voorkomen. Figuur 1 toont de groei curve van een vertegenwoordiger cultuur van BCG lux. De verdubbelingstijd is ongeveer 24 uur tot stationaire fase wordt bereikt.
Figuur 1. Vertegenwoordiger groeicurve van BCG lux meer dan 96 uur in 7H9 medium en correlatie van RLU en CFU.
Hoewel RLU values altijd correleren met CFU, kan het aantal RLU overeenkomt met een enkele CFU variëren, afhankelijk van de voorraad, die is waarom het is een goede gewoonte om dezelfde frozen voorraad te gebruiken gedurende een reeks experimenten om een consistente multipliciteit van infectie garantie ( MOI).
Tabel 1 toont een voorbeeld van een ruwe datum op het moment van inoculatie (T 0) en op 96 uur. De groei ratio's worden berekend volgens de formule T 96 / T 0, maar ook andere tijdsintervallen kunnen natuurlijk ook worden gemeten. Het is echter niet raadzaam om de culturen gebruiken buiten 96 uur, omdat er aanzienlijke celdood optreedt.
Tabel 1. Voorbeeld van ruwe data op het moment van inoculatie (T0) en na 96 uur (T96) en de berekende groei ratio van 3 volwassen donoren.
Afhankelijk van de beschikbare antigeen-specifieke geheugen reacties en mogelijk ook neutrofielen, de groei ratio's variëren tussen individuen, zoals hier afgebeeld in figuur 2 in het bloed van kinderen met en zonder HIV-infectie. Gemiddeld jonge kinderen hebben een hogere groei van ratio's dan volwassenen, tuberculinehuidtest (TST) + ve individuen hebben een lagere groei dan de ratio's TST-ve individuen, en HIV-geïnfecteerde patiënten hebben een hoge groei van ratio's als gevolg van de deficiëntie van CD4 T-cel populatie, een van de belangrijkste bemiddelaars van cellulaire immuunresponsen op mycobacteriën.
Figuur 2 Inter-donor variabiliteit:. Groei verhoudingen van T 0 versus 96 uur voor een set van de patiënten, afhankelijk van de onderliggende HIV-status.
Reproduceerbaarheid van de groei ratio's over een periode van tijd is weergegeven in figuur 3, die voortvloeit uit 64 donoren bloedde twee keer over een periode van 12 maanden en van een enkele donor bloedde herhaaldelijk voor controle experimenten samengevat. Mogelijke oorzaken van variabiliteit kan worden veranderingen in de mycobacteriële overgevoeligheid of variabiliteit binnen het niveau van gastheer cytokines, zoals waargenomen in vele bioassays.
Figuur 3. (A) Single donor op 12 keer meer dan 12 maanden. (B) meerdere (64) donoren op twee keer meer dan 12 months.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bactericide assays in het kader van tuberculose vaccins onderzoek zijn goed ingeburgerd in diermodellen, waar ze worden toegepast op potentieel veelbelovende kandidaat-vaccins scherm. Reductie van bacteriële belasting in verschillende organen fungeert als de belangrijkste uitlezen van immunogeniciteit.
De eerste generatie van de menselijke bactericide assays werden ontworpen met behulp van macrofagen alleen, die besmet zijn met M. tuberculose. CFU diende als de belangrijkste uitlezen van mycobacteriële de overleving na een minimale tijd van 3 weken. Deze testen zich op de voorbereiding van PBMC, zich hechtende monocyten / macrofagen en lysis op bepaalde tijdstippen 1,2.
Als ons begrip van de meer complexe interacties tussen macrofagen en T-cellen naar M. bevatten tuberculose geëvolueerd, en de scheiding van de verschillende celpopulaties met behulp van magnetische korrels was nu mogelijk zijn deze systemen aan te passen door het toevoegen van T-cellen terug in het testen en het meten van CFU 3,4,5. Sommige van deze testen hebben gebruikt wonen M. tuberculose, maar een van de grootste belemmeringen van het werk met M. tuberculose in bactericide assays is de behoefte aan insluiting faciliteiten en het feit dat CFU alleen beschikbaar zijn na 3 weken van de cultuur. Daarnaast, PBMC-gebaseerde testen vereisen een grote hoeveelheid bloed en nog steeds op CFU rekenen als read-out, die duurt 3 weken.
Tot snellere read-outs te vergemakkelijken, gebaseerd op de metabole activiteit, werden nieuwe assays ontworpen. In deze testen, metabolische activiteit wordt gemeten als een correlaat van levensvatbare mycobacteriële en drie verschillende systemen zijn ontworpen in de laatste 10 jaar met behulp van uracil incorporatie 4,5, reporter-gen-gelabeld mycobacteriën 6-11 of een radiometrische detectie-systeem via BacTec / MDGIT flessen 7,8.
Het volbloed lux assay is de enige test tot nu toe die met succes is overgebracht naar TB-endemische instellingen en gebruikt bij kinderen 9,10. Bovendien heeft geen enkele andere test gepubliceerde gegevens van de intra-donor variabiliteit over een periode van tijd.
Een beperking van de lux test is de afhankelijkheid van genetisch gemodificeerde organismen en de noodzaak om de cultuur van het organisme voorafgaand aan de inenting. Echter, vanwege de exacte kwantificering van organismen, is het mogelijk om een zeer nauwkeurige multipliciteit van infectie te berekenen voor elke serie van experimenten en elke partij die de vergelijkbaarheid en reproduceerbaarheid aids. Instructies moeten zorgvuldig worden gevolgd bij de voorbereiding van de stammen om goede levensvatbaarheid van de visbestanden, die essentieel is voor een succesvolle uitvoering van de test te bereiken. Omdat de test wordt uitgevoerd op vers bloed, is het tijd-gevoelige en opslag van de monsters in het veld is niet mogelijk. Idealiter, het bloed moet naar het laboratorium te bereiken binnen 4 uur. Het zou mogelijk zijn in de toekomst verdere verlaging van de hoeveelheid bloed nodig is, en ons laboratorium is op dit moment mee bezig.
Gezien de lage kosten en de toepasbaarheid op kleine steekproeven, is het technisch mogelijk is om deze test te integreren in de klinische studies van nieuwe tuberculose vaccins 10 of anti-tbc interventies 11. Dit zou een extra mogelijkheid om niet alleen de gastheer respons op het vaccin te beoordelen, zoals de huidige praktijk met behulp van een reeks van immunologische en moleculaire technieken (zoals flow cytometrie, ELISPOT en microarray), maar toe te voegen de functionele uitlezing van mycobacteriële overleving na gastheer-pathogeen interactie. Dit is een gangbare praktijk voor vaccin assessments in pre-klinische studies in het diermodel of met behulp van bactericide assays op basis van serum remming voor andere infecties niet te vertrouwen op cellulaire immuunreacties.
Het is tijd om deze aanpak toe te passen op nieuwe tbc-vaccins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door persoonlijke beurzen van de Wellcome Trust Beate Kampmann (056.608, GRO77273).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCG lux | Various | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Biosciences | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC supplement | BD Biosciences | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 (20ml) | |
| N-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR international | 101077 | |
| Sterile PBS | In House | n/a | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Sterile distilled Water | In House | n/a | |
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold Technologies | ||
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning | 99445-12 | |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning | 2150329 | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD Biosciences | 367676 | |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD Biosciences | 352077 | |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR international | 99445-12 | |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| Glass beads 2mm diameter | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| 10ml pipettes and pipette boy | Any Supplier | ||
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | Any Supplier | ||
| Class II safety cabinet cabinet | |||
| Refrigerator (4°C) | |||
| Centrifuge | |||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | |||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |
References
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
