Summary
Мы опишем альтернативный подход к перечислению микобактерий
Protocol
1. Подготовка БЦЖ люкс репортер микобактерий акции
- Расти БЦЖ люкс (М. Bovis БЦЖ штамма Монреаль трансформированных плазмидой трансфер pSMT1) при встряхивании на 200rpm до середины логарифмической фазы в Миддлбрук 7H9 бульона, содержащего 0,2% глицерина, 0,05% между 80 и 10% АЦП обогащения.
- Подготовка 1 мл разведения 1:10 культуры БЦЖ люкс в стерильном PBS в люминометра трубки (900μl + 100 мкл PBS БЦЖ люкс культуры) в двух экземплярах.
- Нагрузка трубку с N-децил альдегид (люциферазы субстрата фермента) на задней панели аппарата и обеспечить Крышка крепится и труб на месте.
- Премьер люминометра инжектора с подложкой через премьер программы, набор для введения 100 UCL х 3 в каждую из 3 пустых трубах грунтовки помещен в люминометра.
- Нагрузка 2 трубки в люминометра и снять показания с помощью программы установлена на уровне 100 инъекционных UCL субстрата в каждую пробирку и читать в течение 20 сек с интервалом 1 сек.
- Когда акция достигла 1x10 8 РГ / мл до 2х10 8 РГ / мл (это занимает около 3-4 дней роста), добавляют равный объем 30% стерильного глицерина, чтобы культура в 50 мл трубки сокола и осторожно перемешать.
- Алиготе 1,5 мл объема в подписанные 2 мл завинчивающейся крышкой микропробирок и хранить при температуре -80 ° C.
2. Определение фондовой РГ / КОЕ корреляции и содержание аликвоты
- Добавить 15 мл Миддлбрук культуральной среде 7H9 с 10% АЦП дополнение к 200 мл колбу с вентилируемый колпачок.
- Добавить 15μl из гигромицину и 30μl 20% Tween.
- Удалите флакон БЦЖ люкс из морозильника и размораживания при комнатной температуре (RT) в безопасности кабинета. Добавить содержимое флакона для средних и затяните крышку.
- Инкубируйте при встряхивании на 200rpm при температуре 37 ° С в течение 4 дней.
- На каждый день, составляют серийные 10-кратные разведения (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 и 1:100000) для определения КОЕ.
- Настройка же разведений в параллельных и дублирующих определить люминесценции (см. часть 1,2-1,6).
- Приготовьте два 3-купе пластин Миддлбрук 7H11 агар (1 л жидкой среды, содержащей 0,5% глицерина, 10% OADC дополнения, 1 мл 20% Твин и 1 мл гигромицину).
- Пластина из 100 мкл каждого разведения на сегмент каждой пластины с использованием отдельных разбрасыватели, распределяя жидкость равномерно по отдельным камеры.
- Печать каждой пластины с парафильмом, помещают в стерильный пластиковый пакет, печать с автоклава ленты, и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 2 недель с крышками вниз.
- Осмотрите регулярно до CFUs появляются (2-3 недели).
- Для подсчета колоний, удаления пластины из инкубатора и место на колонию счетчика. Рассчитать означает для каждого разведения от дубликатов пластин.
- Рассчитать РГ / КОЕ соотношение использованием эквивалентной РОС и КОЕ считается для каждого разведения. Отношение должно быть между 3 и 5 РГ / КОЕ.
3. Подготовка культуры БЦЖ люкс для прививки в цельной крови
- Добавить 15 мл Миддлбрук культуральной среде 7H9 с 10% АЦП дополнение к 200 мл колбу с вентилируемый колпачок.
- Добавить 15μl из гигромицину и 30μl 20% Tween.
- Удалите флакон БЦЖ люкс из морозильника и размораживания при комнатной температуре в безопасности кабинета. Добавить содержимое флакона для средних и затяните крышку.
- Инкубируйте при встряхивании на 200rpm при температуре 37 ° С в течение 2 до 4 дней.
- Подготовка 1 мл разведения 1:10 культуры БЦЖ люкс в стерильном PBS в люминометра трубки (900μl + 100 мкл PBS БЦЖ люкс культуры) в двух экземплярах.
- Премьер люминометра с субстратом (как описано выше), мягко вихревой трубы 2 и загрузить в люминометра и снять показания (как описано выше).
- Используйте это чтение для разбавления вниз культуры в ФБР, чтобы дать эквивалент 7х10 6 RLU (это даст посевной около 2х10 5 КОЕ / мл крови и отношение БЦЖ для моноцитов около 1:1, предполагая, что количество моноцитов около 2х10 5 до 4х10 5 моноциты на мл крови).
4. Подготовка цельной крови
- Возьмите 3 до 5 мл венозной крови в пробирку без консервантов гепарина.
- Передача крови 50 мл трубки сокола и разбавить равным объемом RPMI 1640, содержащей 25 мМ глютамина и HEPES (без ручки / стрептококк).
- Алиготе 900μl разведенной крови в трех экземплярах в стерильные пробирки, украшения для каждого момента времени (6 труб в общем объеме. 3 для 0hrs и 3 для 96hrs Настройка дополнительных труб для дополнительного timepoints, если это необходимо.
- Алиготе 900μl из Middlebrooks 7H9 культуральной среде с 10% АЦП + дополнение 50μg/ml гигромицину (той же среде, как использовать для культуры БЦЖ люкс) в двух экземплярах для роста контроля.
- Добавить 100 мкл разбавленного БЦЖ люкс в каждую пробирку крови, а также для контроля роста 2труб.
- Хорошо перемешайте и положите 3 bijous за 96 час временной точке и 2 управляет ростом на их стороне в качалке инкубаторе при температуре 37 ° C, 20 об / мин (CO 2 не требуется).
5. Измерение люминесценции (в 0hr и 96hrs)
- Центрифуга 3 bijous на 2000g в течение 10 мин.
- Осторожно выньте 300 мкл супернатанта, не нарушая гранул и место в 2 мл завинчивающейся крышкой микропробирок заморозить при -80 ° C для последующего анализа цитокинов.
- Добавить 300 мкл ФСБ каждого украшения, чтобы заменить объема супернатант удаляют.
- Аспирацию содержимого каждого украшения в соответствующие 50мл трубки сокола и добавить 8 мл дистиллированной воды в каждую пробирку. Начните таймер на 10 мин.
Nb: Это срочных шаг, и это инкубационный не должно быть длиннее 10 минут, начиная с момента, когда первые клетки вступают в контакт с водой. - Промыть каждую украшения с 2 мл дистиллированной воды и вихрь в течение 5 секунд до переломного в соответствующую трубку сокола.
- В конце 10-минутной инкубации, центрифуги сокола труб при 2000g в течение 10 минут.
- Декантировать супернатант в дезинфицирующий Surfanios.
- Добавьте несколько стеклянных шариков, чтобы каждая гранула и вихря.
- Добавить 1 мл стерильной PBS в каждую пробирку и вихря.
- В люминометра трубы, сделать разведение 1:10 для каждого образца в двух экземплярах с PBS (PBS 900μl + 100 мкл образца) и на 96 час временной точке. Сделайте то же разведениях для каждого из роста контроля.
- Аккуратно вихревой трубы и загрузить в люминометра и снять показания (как описано выше)
Nb: Чтения между трем образцам того же образца должна быть в пределах 15% друг от друга.
6. Представитель результаты:
Важно использовать бактерий в логарифмической фазе роста для цельной крови люкс анализы, то есть выросла за 48-72 часа до посева проб, а метаболической активности является субоптимальным, если либо прямо из морозильника или в стационарной фазе. До роста должны быть стандартизированы для серии экспериментов либо 48 или 72 часа, чтобы избежать изменчивости. На рисунке 1 показана кривая роста представителя культуры БЦЖ люкс. Время удвоения составляет около 24 часов, пока стационарная фаза будет достигнута.
Рисунок 1. Представителю кривая роста БЦЖ люкс более 96 часов в 7H9 средних и соотношение РОС и КОЕ.
Хотя РГ значения всегда коррелирует с CFU, число РГ соответствует одному КОЕ может варьироваться в зависимости от состава, который является, почему это хорошая практика, чтобы использовать те же замороженные запасы всей серии экспериментов, чтобы гарантировать последовательное множественности заражения ( МВД).
Таблица 1 показывает пример сырья дата время посева (T 0) и в 96 часов. Рост соотношения рассчитываются по формуле T 96 / T 0, но и другие промежутки времени, конечно, могут быть измерены. Это, однако, не рекомендуется использовать культурами более 96 часов, так как значительная гибель клеток происходит.
Таблица 1. Пример исходных данных на момент прививки (T0) и на 96 часов (T96) и расчетные соотношения роста с 3 взрослых доноров.
В зависимости от наличия антиген-специфической памяти ответы и, возможно, нейтрофилов, рост соотношения варьироваться между отдельными людьми, как показано ниже на рисунке 2 в крови у детей с и без ВИЧ-инфекции. В среднем, маленькие дети имеют более высокие темпы роста соотношения, чем взрослые, туберкулиновой пробы (TST) + ве лиц имеют более низкий рост, чем отношения TST-ве лиц, а также ВИЧ-инфицированные пациенты имеют высокий коэффициент роста из-за дефицита CD4 Т-клеток населения, одним из ключевых посредников клеточного иммунного ответа на микобактерии.
Рисунок 2 Интер-доноров изменчивости:. Рост отношения T 0 по сравнению с 96 часов для набора пациентов, в зависимости от основного ВИЧ-статуса.
Воспроизводимость роста отношения в течение времени показано на рисунке 3, в которой обобщены результаты от 64 доноров крови в два раза за период в 12 месяцев и от одного донора крови неоднократно для контрольных экспериментов. Возможные причины изменчивости могут быть изменения в микобактериальные сенсибилизации или изменчивость в пределах уровней принимающих цитокинов, как это наблюдается во многих биопробы.
Рисунок 3. () Одноместный доноров по 12 раз за 12 месяцев. (Б) несколько (64) доноров по 2 раза более 12 мonths.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Бактерицидное анализов в контексте исследований проблемы туберкулеза, вакцина хорошо известны на животных моделях, где они применяются для отбора потенциально перспективных вакцин-кандидатов. Сокращение бактериальной нагрузки в различных функциях органов в качестве основной для чтения из иммуногенности.
Первое поколение человека бактерицидные тесты были разработаны с использованием макрофагов один, инфицированных M. туберкулезом. КОЕ служили главным считывание микобактериальные выживаемость после минимального времени 3 недели. Эти анализы полагались на подготовку РВМС, приверженцем моноцитов / макрофагов и лизису при заданных временных точках 1,2.
Как наше понимание более сложных взаимодействий между макрофагами и Т-клетки содержат M. туберкулез развивается, и разделение различных популяций клеток с использованием магнитных гранул в настоящее время это возможно, эти системы были модифицированы путем добавления Т-клетки обратно в анализы и измерения КОЕ 3,4,5. Некоторые из этих исследований использовали жить М. туберкулеза, но один из основных факторов, сдерживающих работы с М. туберкулеза в бактерицидных тестов является необходимость сдерживания объектов и тот факт, что КОЕ доступны только через 3 недели культуры. Кроме того, РВМС основе анализов требуется большое количество крови и до сих пор полагаются на КОЕ как считывания, которая занимает 3 недели.
Чтобы облегчить более быстрое чтение-аутов, основанный на метаболическую активность, новые тесты были разработаны. В этих анализов, метаболическая активность измеряется как соотносятся жизнеспособных микобактериальные и три различные системы были разработаны в последние 10 лет, используя либо урацил включения 4,5, репортер-гена меткой микобактерий 6-11 или радиометрической системы обнаружения через BACTEC / MDGIT бутылки 7,8.
Цельной крови люкс анализа является только анализ на сегодняшний день, который был успешно переведен в эндемичных по ТБ настройки и использовать у детей 9,10. Кроме того, ни другого анализа опубликовало данные внутри-доноров изменчивости за период времени.
Ограничение анализа люкс является ее зависимость от генетически модифицированных организмов и необходимостью культуры организма перед посевом. Однако из-за точного количественного организмов, можно рассчитать очень точно множественности заражения для каждой серии экспериментов и каждая партия, которая помогает сопоставимости и воспроизводимости. Инструкции должны быть внимательно следил в подготовке штаммов для достижения хорошей жизнеспособности запасов, что является необходимым для успешного выполнения теста. Так как анализ проводится на свежей крови, это срочные и хранения образцов в области не представляется возможным. В идеале, кровь нужно предоставить доступ в лабораторию в течение 4 часов. Можно было бы в будущем, чтобы еще больше сократить объем крови требуется, и наша лаборатория в настоящее время работаем над этим.
Учитывая низкую стоимость и применимость для малых выборок, это технически возможно интегрировать этот анализ в клинические испытания новых вакцин ТБ 10 или противотуберкулезных мероприятий 11. Это обеспечит дополнительную возможность оценить не только хозяин ответ на введение вакцины, как нынешняя практика с использованием массива иммунологических и молекулярных методов (например, проточной цитометрии, ELISPOT и микрочипов), но для добавления функциональных зачитал микобактериальных выживаемость после хозяин-патоген взаимодействия. Это обычная практика для оценки вакцин в доклинических исследованиях на животных моделях или с помощью бактерицидных анализы, основанные на сыворотке торможение для других инфекций, не полагаясь на клеточный иммунный ответ.
Настало время применить этот подход к новым вакцинам ТБ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась личным стипендии из Wellcome Trust, чтобы Беате Kampmann (056608, GRO77273).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCG lux | Various | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Biosciences | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC supplement | BD Biosciences | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 (20ml) | |
| N-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR international | 101077 | |
| Sterile PBS | In House | n/a | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Sterile distilled Water | In House | n/a | |
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold Technologies | ||
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning | 99445-12 | |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning | 2150329 | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD Biosciences | 367676 | |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD Biosciences | 352077 | |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR international | 99445-12 | |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| Glass beads 2mm diameter | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| 10ml pipettes and pipette boy | Any Supplier | ||
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | Any Supplier | ||
| Class II safety cabinet cabinet | |||
| Refrigerator (4°C) | |||
| Centrifuge | |||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | |||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |
References
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
