Summary
מאמר זה מתאר שיטה nanoprecipitation לסנתז פולימר מבוסס חלקיקים באמצעות diblock שיתוף פולימרים. אנו נדון את הסינתזה של diblock שיתוף פולימרים, הטכניקה nanoprecipitation, יישומים פוטנציאליים.
Abstract
הננוטכנולוגיה היא ענף חדש יחסית של המדע כרוכה רתימת התכונות הייחודיות של החלקיקים הם ננומטר סולם (חלקיקים). חלקיקים יכולים להיות מהונדסים בצורה מדויקת שבה כימיה, גודל הרכב פני השטח שלהם ניתן לשלוט בקפידה. זה מאפשר חופש חסר תקדים לשנות כמה מן התכונות הבסיסיות של המטען שלהם, כגון, מסיסות diffusivity, biodistribution, מאפיינים לשחרר immunogenicity. מאז ראשית שלהם, חלקיקים כבר נוצלו בתחומים רבים של המדע והרפואה, כולל אספקת סמים, הדמיה, ביולוגיה של התא 1-4. עם זאת, לא נוצל במלואו מחוץ "מעבדות הננוטכנולוגיה" בשל מחסום טכני נתפס. במאמר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לסנתז פלטפורמה פולימר nanoparticle מבוסס כי יש מגוון רחב של יישומים פוטנציאליים.
הצעד הראשון הוא לסנתז diblock שיתוף פולימר שיש לו גם תחום הידרופובי תחום הידרופילי. שימוש PLGA ו PEG כמו פולימרים מודל תיארנו תגובה נטיה באמצעות EDC / NHS כימיה 5 (איור 1). כמו כן, אנו דנים את תהליך טיהור פולימר. Diblock מסונתז שיתוף פולימר יכול עצמית להרכיב לתוך חלקיקים בתהליך nanoprecipitation דרך הידרופובי, הידרופילי אינטראקציות.
Nanoparticle פולימר תיאר הוא מאוד תכליתי. ליבת הידרופובי של nanoparticle יכול להיות מנוצל כדי לשאת תרופות מסיס גרוע עבור משלוח הסמים experiments6. יתר על כן, חלקיקים יכולים להתגבר על הבעיה של ממיסים רעילים עבור מסיסים גרוע ריאגנטים לביולוגיה מולקולרית, כגון wortmannin, המחייב ממס כמו DMSO. עם זאת, DMSO יכול להיות רעיל לתאים ולהפריע הניסוי. תרופות אלו מסיסים גרוע ריאגנטים יכול להיות מועברת באופן יעיל באמצעות חלקיקי הפולימר עם רעילות מינימלית. חלקיקי הפולימר יכול גם להיות טעון עם צבע פלואורסצנטי מנוצל ללימודי סחר תאיים. לבסוף, אלו חלקיקים פולימר ניתן מצומדות כדי מיקוד ligands דרך PEG פני השטח. חלקיקים ממוקדת כזה יכול להיות מנוצל כדי תווית epitopes ספציפי או בתאים 7-10.
Protocol
1. סינתזה של PLGA-B-PEG פולימר
- פולי (D, L-lactide-Co-glycolide) (PLGA) עם קבוצות carboxylate מסוף (PLGA-carboxylate) מומס כלשהו ממס עבור PLGA (כאמור בסעיף חומרים) בריכוז של 5 מ"מ. PLGA יכול להיות מומס בריכוז הזה עם ערבוב עדין.
- שני NHS (משקל מולקולרי 115.09) ו EDC (משקל מולקולרי 191.7) הם מומסים בתמיסה PLGA בריכוז של 25mm. (שניהם EDC לבין NHS מתווספים עודף stoichiometric של פי 5 לעומת PLGA). PLGA-carboxylate מומר PLGA-NHS ידי הוספת EDC ו NHS לפתרון PLGA-carboxylate עם ערבוב עדין במשך שעה בערך 1.
- המוצר התגובה PLGA-NHS הוא זירז את ידי הוספת מתנול פתרון כביסה. כ 10 פעמים עודף נפח של מתנול מתווסף הפתרון. הפתרון הוא centrifuged ב 2000 XG כדי לזרז את PLGA-NHS וזורקים supernatant (מסיר את עקבות EDC ו - NHS. הליך של כביסה עם מתנול הוא חזר לפחות שלוש פעמים.
- PLGA-NHS גלולה הוא מיובש תחת בוואקום במשך 30 דקות כדי להסיר כל עקבות של פתרון הכביסה.
- PLGA-NHS גלולה כעת מחדש מומס הממס אותו בריכוז זהה ששימש בתחילה לפזר PLGA. PEG heterobifunctional (אמין-PEG-carboxylate) הוא הוסיף אז לפתרון PLGA בריכוז של 5 מ"מ (יחס stoichiometric של 1:1). הפתרון הוא תערובת מודגרות למשך 24 שעות עם ערבוב מתמיד.
- לאחר 24 שעות, המוצר התגובה PLGA-B-PEG לחסום קופולימר הוא זירז את ידי הוספת מתנול פתרון כביסה עודף. חזור על התהליך כביסה צנטריפוגה כאמור שלוש פעמים. זו תסיר את כל PEG unreacted עודף.
- קופולימר PLGA-B-PEG לחסום הוא מיובש תחת ואקום.
2. PLGA-B-PEG nanoparticle הכנה
חלקיקים עם ליבת PLGA מכוסה PEG על פני השטח ניתן להכין עם אלה קופולימרים diblock. מגוון של סמים שונים יכולים להיות הידרופובי הגלום חלקיקים כאלה. תרכובות פלורסנט ניתן הגלום חלקיקים או יכול להיות מצומדת כדי PLGA ובכך חלקיקים אלה יכולים לשמש עבור דימות פלואורסצנטי.
שיטה Nanoprecipitation משמש כדי להפוך את חלקיקי במיוחד כאשר המטען הרצוי יהיה במארז הוא הידרופובי מאוד בטבע.
- PLGA-B-PEG לחסום קופולימר ואת התרופה / מטען (להיות במארז) הם מומסים כלשהו ממס אשר מתמוסס PLGA. PLGA יכול להיות מומס על ידי ממיסים משותפים רבים, כולל אצטוניטריל, DCM, tetrahydrofuran, אצטון או אתיל אצטט. הבחירה של ממס היא קריטית, כפי שהוא משפיע על המאפיינים של nanoparticle. לפיכך, ראוי ממס אמור לשמש בשלב זה.
- תערובת פולימר / התרופה ואז הוסיף dropwise ל 3-5 כרכים של ערבוב מים נותן ריכוז הפולימר הסופי של סביב 3 מ"ג / מ"ל. (איור 2)
- ערבוב זה נמשך 2 שעות תחת לחץ מופחת, כדי לאפשר חלקיקים כדי ליצור ע"י הרכבה עצמית ולהסיר עקבות של ממיס אורגני.
- מסיק וטיהור: חלקיקים מרוכזים מכן על ידי צנטריפוגה ב 2700 x g עבור 10 דקות באמצעות מסנן Amicon (MWCO 20KDa), התרחצתי, מחדש ב-PBS. זה מסיר את כל מטען בלתי וממולכד סמים /. אפיונים biophysical יסוד, כגון גודל, משטח מטען, וטעינה יעילות התרופה ניתן לבצע כדי להבין טוב יותר את המאפיינים של חלקיקים.
3. אחסון
הקפאת ייבוש היא שיטה הנפוצה לאחסון חלקיקים 11. הקפאת ייבוש תשמור על תכונות פיסיקליות וכימיות של חלקיקים ליציבות ארוכת טווח 12. תהליך הקפאה וייבוש יכול לגרום ללחץ על חלקיקים ו לערער את הניסוח, כך cryo-protectants (הגנה מפני מתח הקפאה) ו-איו protectants (הגנה מפני מתח ייבוש) משמשים בדרך כלל. הבחירה של protectants אלה נקבע לפי אורך הזמן הרצוי אחסון 13.
- בשנת ייבוש, הקפאה, יש מיצוק הכולל של המדגם על ידי הקפאת מתחת Tg שלו.
- בשלב הייבוש, הקרח הוא הוסר על ידי סובלימציה. הטמפרטורה והלחץ צריך להיות מותאם על מנת להשיג תהליך יעיל להקפיא ייבוש.
4. נציג התוצאות:
אפיון קופולימר PLGA-B-Di-PEG לחסום
טכניקות שונות שניתן להשתמש בהם כדי לאשר את נטיה מוצלח של פולימרים. הרכב PLGA-B-PEG ניתן לאפיין באמצעות 400 MHz 1H תהודה מגנטית גרעינית (NMR). משקל מולקולרי של המוצר שנוצר (PLGA-B-PEG) ניתן לאמת באמצעות ג'ל כרומטוגרפיה חלחול (GPC). PLGA-b - PEG משקל מולקולרי distributioעקומת n זמן elution צריך להיות שונה PLGA ו - PEG לבד. בשילוב, טכניקות אלו יש לאפיין את המוצר נוצרו לקבוע אם התגובה נטיה היה מוצלח.
אפיון PLGA-B-PEG חלקיקים
גודל החלקיקים והפצה גודל ניתן למדוד על ידי פיזור אור דינאמי. פרמטרים שונים בתהליך nanoprecipitation להשפיע על גודל החלקיקים. משקולות מולקולרית של פולימרים המשמשים בתחילה (הן PLGA ו - PEG) גם השפעת חלוקת גודל החלקיקים. מעבר במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) יכול לשמש גם כדי לאשר את התפלגות גודל ומבנה של חלקיקים כפי שניתן לראות באיור 3. טווח גודל החלקיקים היא בדרך כלל בטווח ננומטר. גודל החלקיקים גדול עם התפלגות גודל אחיד יכול להצביע או שגיאה התגובה נטיה או שיטת nanoprecipitation אופטימיזציה הצרכים. בנוסף, פוטנציאל זטה פני השטח ניתן למדוד ZetaPALS.
יעילות התרופה / מטען טוען ניתן לכמת עם תקן HPLC.
החלקיקים הם מומסים אורגניים ממס HPLC ניתן לבצע כדי למדוד את ספיגת התרופה / מטען (איור 4). שחרור התרופה המחקר הקינטית ניתן לעשות בו כמויות ידוע קבוע של חלקיקים הם dialyzed ביחידות 30 Slide-A-MINI Lyzer דיאליזה. במרווחי זמן קבועים, התוכן ביחידת דיאליזה נאסף נפח שווה של ממס אורגני נוסף לפזר את חלקיקי. HPLC נעשית על דגימות אלה לכמת את התוכן סמים / מטען.
באיור 1. EDC / NHS כימיה
איור 2. שיטה Nanoprecipitation להכנת חלקיקים פולימריים. הפתרון של ממס אורגני (אצטוניטריל או DCM) המכיל את PEG-PLGA diblock ואת התרופה או מטען להיות טעון לתוך חלקיק מתווסף dropwise כדי ערבוב של 3-5 מ"ל H 2 O.
איור 3. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים של nanopartices. תמונת TEM של PEG-PLGA חלקיקים המכילים wortamin. חומצה Phosphotungstic שימש כסוכן ניגוד.
איור 4. שחרור מבוקר של התרופה מן nanoparticle. פקליטקסל שחרור חלקיקים לאחר דיאליזה ב PBS. באותה עת ציינה, חלקיקים הוצאו קלטות דיאליזה solublized ב אצטוניטריל. הפתרון היה נמדד על ידי HPLC. שני מגרשים נפרדים של חלקיקים הושוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה nanoprecipitation באמצעות diblock שיתוף פולימרים מייצג שיטה פשוטה, מהירה מהנדס חלקיקים פולימריים. חלקיקים וכתוצאה מכך מורכבים ליבה הידרופובי אשר יכול להיות מנוצל עבור משלוח של תרכובות מסיסים היטב. שכבת הקרקע הידרופילי מאפשר מסיסות מימית מעולה תוך מתן מחצית עבור נטיה נוספת פוטנציאל ליגנד מיקוד.
ישנן פלטפורמות nanoparticle רבים, כולל ליפוזומים, חלקיקים פולימריים, dendrimers, חלקיקי מתכת, נקודות קוונטיות 14. בין פלטפורמות אלה, הפלטפורמה nanoparticle פולימריות הוא אחד הקלה ביותר לגבש המגוונים ביותר מבחינת יישומים. זה דורש ציוד התקנה מינימלית ואת הטכניקה ניתן ללמוד בתוך כמה שעות. כמו כן, יש מגוון רחב של יישומים biocompatibility שלה מאפשר הן במבחנה ביישומים vivo. היכולת שלו לשאת מטען מאפשר הדמיה יכולות טיפוליות.
EDC / NHS כימיה מוצג כאן על מנת ליצור את קופולימר diblock. עם זאת, קופולימרים לחסום ניתן להפיק באמצעות זרזים שונים. זרז נוסף נפוץ הוא octoate בדילי. קבוצות הידרוקסיל הטרמינל של PEG משמשים ייזום קבוצות לסנתז קופולימרים לחסום. פילמור טבעת lactide ו glycolide ביוזמת dihydroxy PEG או monomethoxy PEG יכול להוביל ABA או לחסום AB סוג קופולימרים בהתאמה 15. שיטה זו של הכנה נותן גמישות רבה יותר בתכנון, אבל הכימיה EDC / NHS קל יותר לשימוש ויכולה לחסוך זמן באמצעות זמינים מסחרית PLGA פולימר.
בנוסף nanoprecipitation, בשיטות אחרות כדי ליצור diblock חלקיקי הפולימר יכול לשמש. חלופה נפוצה היא "שמן במים" השיטה האמולסיה 16. השיטה האמולסיה שוב מתחיל שלב אורגני המכיל את קופולימר diblock ואת השלב מימית. עם זאת, על ערבוב שני הפתרונות, חלקיקים שנוצרו באמצעות vortexing ו sonicating. שיטה זו דומה מאוד, אבל השיטה nanoprecipitaion מאפשרת שליטה רבה יותר בשלב ערבוב וכן ימנע את השימוש sonication.
ישנם יישומים פוטנציאליים רבים עבור פלטפורמה זו. ראשית, הוא יכול להיות מנוצל עבור משלוח של / תרופות הידרופובי מסיסים היטב במחקרים משלוח סמים. לדוגמה, taxanes הם מסיסים גרועים דורשים ממס עבור במחקרים vivo. חלקיקים פולימריים יכול לתמצת סמים taxane ו לבטל את הצורך ממיסים. חלקיקים יכולים גם לספק ריאגנטים ביולוגיה של התא, כי הם מסיסים גרועים, כגון wortmannin. חלקיקי הפולימר יכול גם להיות טעון עם צבע פלואורסצנטי מנוצל ללימודי סחר תאיים. אלו חלקיקי הפולימר יכולה להיות מצומדת כדי מיקוד ligands דרך PEG פני השטח. בשילוב עם תיוג פלורסנט, חלקיקים אלה ממוקד יכול לשמש תווית epitopes ספציפי או בתאים. מאז nanoparticle אחד יכול לתמצת מספר רב של מולקולות ניאון, חלקיקים יכולים לשפר את הרגישות של מחקרים ביולוגיים כאלה. חלקיקים שכותרתו פלורסנט יכול גם להיות מנוצל עבור in vivo הדמיה, כגון הדמיה של כלי הדם פלאק טרשת עורקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי גולף נגד סרטן, קרוליינה המרכז ננוטכנולוגיה אקסלנס פיילוט מענק, אוניברסיטת לחקר הסרטן הקרן בריאות ממלכתי המכון K-12 פיתוח פרס קריירה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
- Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).
- Bulte, J. W. M. Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).
- Omid, C., Farokhzad, R. L. Impact of Nanotechnology on Drug Delivery. ACS NANO. 3, 16-20 (2009).
- Li, Y. -P., Pei, Y. -Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats. Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , 2nd Edition, (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems. Nature. 388, 860-862 (1997).
- Yoo, H. S., Park, T. G. Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles. Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).
- Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery. Biomaterials. 28, 869-876 (2007).
- Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).
- Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells. J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).
- Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).
- Holzer, M., Vogel, V., Mäntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).
- Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).
- Wang, A. Z. Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. J. Control Release. 63, 155-163 (2000).
- Gref, R.
