Summary
Den här artikeln beskriver en nanoprecipitation metod för att syntetisera polymerbaserade nanopartiklar med diblock sampolymerer. Vi kommer att diskutera en syntes av diblock sampolymerer, det nanoprecipitation teknik och potentiella tillämpningar.
Abstract
Nanoteknik är en relativt ny gren av vetenskap som innebär att utnyttja de unika egenskaperna hos partiklar som är nanometer i skala (nanopartiklar). Nanopartiklar kan vara konstruerad på ett precist sätt där deras storlek, sammansättning och ytkemi kan kontrolleras noggrant. Detta möjliggör stor frihet att ändra några av de grundläggande egenskaperna hos deras last, såsom löslighet, diffusivitet, biodistribution, släpp egenskaper och immunogenicitet. Sedan starten har nanopartiklar använts på många områden inom naturvetenskap och medicin, drug delivery, imaging och cellbiologi 1-4. Det har dock inte utnyttjats fullt ut utanför "nanoteknik laboratorier" på grund av upplevda tekniska hinder. I den här artikeln beskriver vi en enkel metod för att syntetisera en polymer baserad nanopartikel plattform som har ett brett spektrum av potentiella tillämpningar.
Det första steget är att syntetisera en diblock co-polymer som har både en hydrofob domän och hydrofila domän. Använda PLGA och PEG som modell polymerer, beskrev vi en konjugering reaktion med EDC / NHS kemi 5 (Fig. 1). Vi diskuterar också polymeren reningsprocessen. Den syntetiserade diblock co-polymer kan själv montera in nanopartiklar i nanoprecipitation processen genom hydrofoba-hydrofila interaktioner.
Det beskrivna polymera nanopartiklar är mycket mångsidig. Den hydrofoba kärnan i nanopartiklar kan användas för att bära svårlösliga läkemedel för drug delivery experiments6. Dessutom kan nanopartiklar lösa problemet med giftiga lösningsmedel för svårlösliga molekylärbiologiska reagens, såsom wortmannin, vilket kräver ett lösningsmedel som DMSO. Däremot kan DMSO vara toxiska för cellerna och störa experimentet. Dessa svårlösliga läkemedel och reagenser effektivt kan levereras med hjälp av polymera nanopartiklar med minimal toxicitet. Polymer nanopartiklar kan också laddas med fluorescerande färg och används för intracellulära människohandel studier. Slutligen kan dessa polymera nanopartiklar vara konjugerad med inriktning ligander igenom ytan PEG. Sådana riktade nanopartiklar kan användas för att märka specifika epitoper på eller i celler 7-10.
Protocol
1. Syntes av PLGA-B-PEG polymer
- Poly (D, L-laktid-co-glycolide) (PLGA) med terminal karboxylat grupper (PLGA-karboxylat) löses i en vätska till PLGA (som nämns i material avsnitt) vid en koncentration av 5mm. PLGA kan upplösas vid denna koncentration med varsam omrörning.
- Båda NHS (molekylvikt 115,09) och EDC (molekylvikt 191,7) löses i PLGA lösning med en koncentration av 25mm. (Både EDC och NHS tillsatts i en stökiometrisk över 5 gånger jämfört med PLGA). PLGA-karboxylat omvandlas till PLGA-NHS genom att lägga till EDC och NHS till PLGA-karboxylat lösning med skonsam omrörning i ca 1 timme.
- Reaktionen Produkten PLGA-NHS fälls ut genom att lägga till tvättlösning metanol. Ungefär 10 gånger volymen än metanol tillsätts lösningen. Lösningen centrifugeras vid 2000 xgi att fälla ut PLGA-NHS och kassera supernatanten (tar bort spår av EDC och NHS. Detta förfarande för tvättning med metanol skall upprepas minst tre gånger.
- Den PLGA-NHS pellets torkas under vakuum i 30 minuter för att avlägsna alla spår av den tvättlösning.
- Den PLGA-NHS pellets är nu åter upplöst i samma lösningsmedel i samma koncentration som användes från början för att lösa PLGA. Den heterobifunctional PEG (amin-PEG-karboxylat) läggs sedan till den PLGA lösning med en koncentration på 5 mm (stökiometriska förhållandet 1:1). Blandningen Lösningen är inkuberas i 24 timmar under ständig omrörning.
- Efter 24 timmar är reaktionsprodukt PLGA-b-PEG segmentsampolymer fälls ut genom att lägga till tvättlösningen metanol i överskott. Upprepa tvätt och centrifugering process som nämnts ovan tre gånger. Detta tar bort allt överflödigt inte reagerat PEG.
- Den PLGA-b-PEG segmentsampolymer torkas under vakuum.
2. PLGA-b-PEG nanopartiklar förberedelse
Nanopartiklar med PLGA kärna täckt med PEG på ytan kan framställas med dessa diblock sampolymerer. En mängd olika hydrofoba läkemedel kan kapslas in i sådana nanopartiklar. Fluorescerande föreningar kan kapslas in i nanopartiklar eller kan konjugerat till PLGA och därmed dessa nanopartiklar kan användas för fluorescens avbildning.
Nanoprecipitation metoden används för att göra nanopartiklar speciellt när önskad last som skall kapslas är mycket hydrofoba i naturen.
- Den PLGA-b-PEG segmentsampolymer och drog / lasten (skall kapslas) löses i lösningsmedel som löser upp PLGA. PLGA kan upplösas av många vanliga lösningsmedel, inklusive acetonitril, DCM, tetrahydrofuran, aceton eller etylacetat. Valet av lösningsmedel är kritisk, eftersom den påverkar egenskaperna hos nanopartiklar. Därför bör lämpligt lösningsmedel ska användas i detta steg.
- Polymeren / drug blandningen läggs sedan droppvis till 3-5 volymer omrörning vatten vilket ger en slutlig polymer koncentration av cirka 3 mg / ml. (Fig. 2)
- Omrörningen pågått i 2 timmar under reducerat tryck för att tillåta nanopartiklar för att bilda genom självorganisering och avlägsna spår av organiska lösningsmedel.
- Skörd och rening: Nanopartiklarna sedan koncentreras genom centrifugering vid 2700 x g i 10 min med en Amicon filter (MWCO 20KDa), tvättade och rekonstruerad i PBS. Detta tar bort alla FN-anhållna drog / last. Grundläggande biofysiska karaktäriseringar, såsom storlek, ytladdning och drog lastning effektivitet kan göras för att bättre förstå egenskaperna av nanopartiklar.
3. Förvaring
Frystorkning är en vanligt använd metod för att lagra nanopartiklar 11. Frystorkning kommer att bevara de fysiska och kemiska egenskaper hos nanopartiklar för långsiktig stabilitet 12. Frysningen torkningen kan orsaka stress på partiklar och destabilisera formulering, så kryo-protectants (skydd mot frysning stress) och Lyo-protectants (skydd mot uttorkning stress) är vanliga. Valet av dessa protectants bestäms av önskad längd av lagring tid 13.
- I frystorkning, det finns totalt stelning av provet genom frysning under sin Tg.
- I torkning steget är isen avlägsnas genom sublimering. Temperatur och tryck bör optimeras för att uppnå en effektiv frystorkning process.
4. Representativa resultat:
Karakterisering av PLGA-B-PEG Di-segmentsampolymer
Olika tekniker kan användas för att bekräfta framgångsrika konjugering av polymerer. Sammansättningen av PLGA-B-PEG kan beskrivas med hjälp av en 400 MHz-1H kärnmagnetisk resonans (NMR). Molekylvikt av de bildade produkten (PLGA-B-PEG) kan verifieras av gelfiltering (GPC). Den PLGA-B - PEG molekylvikt distribution kurva och elueringen tid bör skilja sig från PLGA och PEG ensam. I kombination bör dessa tekniker karakterisera bildade produkten och avgöra om konjugation reaktion var framgångsrik.
Karakterisering av PLGA-B-PEG nanopartiklar
Partikelstorlek och storleksfördelning kan mätas genom dynamisk ljusspridning. Olika parametrar i nanoprecipitation processen påverkar storleken på partiklarna. Molekylvikt som används polymerer början (både PLGA och PEG) effekt också fördelning av partikelstorlekar. Transition (TEM) kan också användas för att bekräfta storleksfördelning och struktur nanopartiklar som ses i figur 3. Partikelstorleken serien är i allmänhet i nm. Stora partikelstorlekar med ojämn storleksfördelning kan tyda på antingen ett fel i konjugering reaktion eller nanoprecipitation behov metoden optimering. Dessutom kan ytan zeta potential mätas med ZetaPALS.
Drogen / frakt lastas effektivitet kan kvantifieras med standard HPLC.
Partiklarna är lösta i organiska lösningsmedel och HPLC kan utföras för att mäta absorbansen av drogen / last (bild 4). Den läkemedelsdosering kinetiska studier kan göras om kända fasta kvantiteter av nanopartiklar är dialyseras i 30 Slide-A-analysatorn MINI Dialys enheter. I fasta tidsintervall, är innehållet i dialysavdelningen samlas in och lika stor volym av organiska lösningsmedel tillsätts för att lösa upp nanopartiklar. HPLC görs på dessa prover för att kvantifiera drog / last innehåll.
Figur 1. EDC / NHS kemi
Figur 2. Nanoprecipitation metod för att förbereda polymera nanopartiklar. Den organiska lösning av ett lösningsmedel (acetonitril eller DCM) som innehåller PEG-PLGA diblock och drogen eller last som ska laddas in i partikeln läggs droppvis till 3-5 ml omrörning H 2 O.
Figur 3. Transmissionselektronmikroskopi av nanopartices. TEM bild av PEG-PLGA nanopartiklar som innehåller wortamin. Fosforvolframsyra användes som ett kontrastmedel.
Figur 4. Kontrollerad frisättning av läkemedel från nanopartiklar. Utsläpp av Paclitaxel från nanopartiklar efter dialys i PBS. Vid den noterade tiden var partiklarna bort från dialys kassetter och solublized i acetonitril. Lösningen mättes med HPLC. Två separata massor av nanopartiklar jämfördes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nanoprecipitation metod med diblock sampolymerer representerar en enkel, snabb metod att konstruera polymera nanopartiklar. Den resulterande nanopartiklar består av en hydrofob kärna som kan utnyttjas för leverans av svårlösliga föreningar. Ytan hydrofila skiktet ger utmärkt löslighet i vatten samtidigt som en fraktion för eventuella ytterligare konjugering till en inriktning ligand.
Det finns många nanopartiklar plattformar, inklusive liposomer, polymera nanopartiklar, dendrimererna, partiklar metall och kvantprickar 14. Bland dessa plattformar är polymera nanopartiklar plattformen ett av de enklaste att formulera och den mest mångsidiga i form av tillämpningar. Det kräver minimal installation av utrustningen och tekniken kan läras i flera timmar. Det har också ett brett spektrum av applikationer och dess biokompatibilitet möjliggör både in vitro och in vivo-applikationer. Dess förmåga att transportera en last kan bildbehandling och terapeutiska möjligheter.
EDC / NHS kemi presenteras här för att generera diblock sampolymer. Däremot kan blockera sampolymerer syntetiseras med hjälp av olika katalysatorer. En annan vanligt förekommande katalysator är tenn octoate. Terminalen hydroxylgrupper av PEG används som inleder grupper att syntetisera block sampolymerer. Ring polymerisation av laktid och glycolide initierats av dihydroxi PEG eller monomethoxy PEG kan leda till ABA eller AB typ sampolymerer blockera respektive 15. Denna metod för förberedelse ger mer flexibilitet i utformningen, men EDC / NHS kemi är lättare att använda och kan spara tid genom att använda en kommersiellt tillgänglig PLGA polymer.
Förutom nanoprecipitation, till andra metoder generera diblock polymera nanopartiklar kan användas. Ett vanligt alternativ är en "olja i vatten" emulsion metod 16. Emulsionen Metoden börjar igen med en organisk fas innehåller diblock sampolymer och en vattenfas. Men vid blanda de två lösningarna är nanopartiklar genereras genom vortexa och sonicating. Denna metod är mycket lika, men nanoprecipitaion metod tillåter mer kontroll i blandningen steg samt undviker att använda sonication.
Det finns många potentiella tillämpningar för denna plattform. Det första kan det användas för leverans av hydrofoba / svårlösliga läkemedel i studier drug delivery. Till exempel, taxaner är svårlösliga och kräver en vätska till in vivo-studier. Polymera nanopartiklar kan kapsla in taxan droger och upphäva behovet av lösningsmedel. Nanopartiklar kan också leverera cellbiologi reagenser som är svårlösliga, t ex wortmannin. Polymer nanopartiklar kan också laddas med fluorescerande färg och används för intracellulära människohandel studier. Dessa polymer nanopartiklar kan konjugerat med inriktning ligander igenom ytan PEG. Kombinerat med fluorescerande märkning, kan dessa riktade nanopartiklar kan användas för att märka specifika epitoper på eller i celler. Eftersom varje nanopartiklar kan kapsla in ett stort antal fluorescerande molekyler, kan nanopartiklar förbättra känsligheten för sådana biologiska studier. Lysrör märkt nanopartiklar kan även utnyttjas för in vivo-avbildning, såsom visualisering av blodkärl och aterosklerotiska plack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av golfare mot cancer, Carolina Centrum för nanoteknik Excellence Pilot bidrag, University Cancer Research Fund och Folkhälsoinstitutet K-12 Career Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
- Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).
- Bulte, J. W. M. Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).
- Omid, C., Farokhzad, R. L. Impact of Nanotechnology on Drug Delivery. ACS NANO. 3, 16-20 (2009).
- Li, Y. -P., Pei, Y. -Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats. Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , 2nd Edition, (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems. Nature. 388, 860-862 (1997).
- Yoo, H. S., Park, T. G. Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles. Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).
- Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery. Biomaterials. 28, 869-876 (2007).
- Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).
- Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells. J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).
- Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).
- Holzer, M., Vogel, V., Mäntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).
- Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).
- Wang, A. Z. Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. J. Control Release. 63, 155-163 (2000).
- Gref, R.
