Summary
Dit artikel beschrijft een methode om nanoprecipitation op basis van polymeren nanodeeltjes door middel van diblok co-polymeren te synthetiseren. Bespreken we de synthese van diblok co-polymeren, de nanoprecipitation techniek en mogelijke toepassingen.
Abstract
Nanotechnologie is een relatief nieuwe tak van wetenschap die inhoudt dat het benutten van de unieke eigenschappen van deeltjes die nanometer schaal (nanodeeltjes). Nanodeeltjes kunnen worden gemanipuleerd in een precieze manier waar hun omvang, samenstelling en oppervlakte chemie nauwkeurig kan worden gecontroleerd. Dit maakt ongekende vrijheid om een aantal van de fundamentele eigenschappen van hun lading, zoals oplosbaarheid, diffusie, biologische verdeling, release kenmerken en immunogeniciteit te wijzigen. Sinds hun oprichting, zijn nanodeeltjes zijn gebruikt in vele gebieden van wetenschap en geneeskunde, met inbegrip van drug delivery, imaging, en celbiologie 1-4. Er is echter nog niet volledig benut buiten "nanotechnologie laboratoria" te wijten aan de waargenomen technische barrière. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode om een polymeer op basis van nanodeeltje platform dat een breed scala van mogelijke toepassingen is te synthetiseren.
De eerste stap is het synthetiseren van een diblok co-polymeer die zowel een hydrofoob domein en hydrofiele domein heeft. Met behulp van PLGA en PEG als model polymeren, beschreven we een conjugatie reactie met behulp van EDC / NHS chemie 5 (figuur 1). We bespreken ook het polymeer zuiveringsproces. De gesynthetiseerde diblok co-polymeer kan zichzelf assembleren tot nanodeeltjes in het nanoprecipitation proces door hydrofobe-hydrofiele interacties.
De beschreven polymeer nanodeeltje is zeer veelzijdig. De hydrofobe kern van de nanodeeltjes kunnen worden gebruikt om slecht oplosbare geneesmiddelen te voeren voor drug delivery experiments6. Bovendien, de nanodeeltjes kan het probleem van de giftige oplosmiddelen te overwinnen voor slecht oplosbare moleculaire biologie reagentia, zoals wortmannin, die een oplosmiddel zoals DMSO vereist. Kan echter DMSO giftig zijn voor cellen en interfereren met het experiment. Deze slecht oplosbare geneesmiddelen en reagentia kan effectief worden geleverd met behulp van polymere nanodeeltjes met een minimale toxiciteit. Polymeer nanodeeltjes kunnen ook worden geladen met fluorescerende kleurstof en gebruikt voor intracellulaire mensenhandel studies. Ten slotte kunnen deze polymeren nanodeeltjes worden geconjugeerd aan richten liganden door bovengrondse PEG. Dergelijke gerichte nanodeeltjes kunnen worden gebruikt om specifieke epitopen op of in cellen 70-10 label.
Protocol
1. Synthese van PLGA-b-PEG polymeer
- Poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) met klem carboxylaatgroepen (PLGA-carboxylaat) wordt opgelost in een oplosmiddel voor PLGA (zoals vermeld in materialen sectie) bij een concentratie van 5 mm. PLGA kan ontbonden worden bij deze concentratie met zacht roeren.
- Zowel de NHS (moleculair gewicht 115,09) en EDC (moleculair gewicht 191.7) worden opgelost in de PLGA oplossing bij een concentratie van 25 mm. (Zowel EDC en NHS worden toegevoegd in een stoichiometrische overmaat van 5 keer ten opzichte van PLGA). PLGA-carboxylaat wordt omgezet in PLGA-NHS door het toevoegen van EDC en de NHS aan PLGA-carboxylaat oplossing met zachtjes roeren gedurende ongeveer 1 uur.
- De reactie product PLGA-NHS wordt neergeslagen door het toevoegen van de wasoplossing methanol. Ongeveer 10 keer het volume overmaat methanol wordt toegevoegd aan de oplossing. De oplossing wordt gecentrifugeerd bij 2000 xg neer te slaan uit de PLGA-NHS en de supernatant gooi (verwijdert de sporen van EDC en NHS. Deze procedure van het wassen met methanol wordt herhaald op zijn minst drie keer.
- De PLGA-NHS pellet wordt gedroogd in een vacuüm gedurende 30 minuten om alle sporen van de wasoplossing te verwijderen.
- De PLGA-NHS pellet is nu opnieuw opgelost in hetzelfde oplosmiddel bij dezelfde concentratie die in eerste instantie gebruikt werd om PLGA te ontbinden. De heterobifunctionele PEG (amine-PEG-carboxylaat) wordt vervolgens toegevoegd aan de PLGA oplossing in een concentratie van 5mm (stoichiometrische verhouding van 1:1). Het mengsel oplossing wordt gedurende 24 uur onder constant roeren.
- Na 24 uur wordt de reactie product PLGA-b-PEG blokcopolymeer neergeslagen door het toevoegen van de wasoplossing methanol in overmaat. Herhaal het wassen en centrifugeren proces zoals hierboven vermeld drie keer. Dit verwijdert alle overtollige niet gereageerd PEG.
- De PLGA-b-PEG blokcopolymeer wordt onder vacuüm gedroogd.
2. PLGA-b-PEG nanodeeltje voorbereiding
Nanodeeltjes met PLGA kern bedekt met PEG aan de oppervlakte kan worden bereid met deze diblok copolymeren. Een verscheidenheid van verschillende hydrofobe geneesmiddelen kunnen worden ingekapseld in een dergelijke nanodeeltjes. Fluorescerende verbindingen kunnen worden ingekapseld in de nanodeeltjes of kan worden geconjugeerd aan PLGA en dus deze nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor fluorescentie beeldvorming.
Nanoprecipitation methode wordt gebruikt om nanodeeltjes te maken vooral wanneer de gewenste lading in te kapselen is zeer hydrofoob van aard.
- De PLGA-b-PEG blokcopolymeer en het medicijn / lading (te ingekapseld) worden opgelost in een oplosmiddel dat PLGA oplost. PLGA kan worden ontbonden door groot aantal gangbare oplosmiddelen, zoals acetonitril, DCM, tetrahydrofuran, aceton of ethylacetaat. De keuze van het oplosmiddel is van cruciaal belang, omdat het invloed heeft op de eigenschappen van nanodeeltjes. Daarom moet geschikt oplosmiddel worden gebruikt in deze stap.
- Het polymeer / drug mengsel wordt vervolgens druppelsgewijs toegevoegd tot 3-5 volumes roeren water geven een uiteindelijke polymeer concentratie van ongeveer 3 mg / ml. (Fig. 2)
- Het roeren wordt voortgezet gedurende 2 uur onder verminderde druk om de nanodeeltjes te vormen door zelf-assemblage en sporen van het organische oplosmiddel te verwijderen.
- Oogsten en zuivering: De nanodeeltjes worden dan geconcentreerd door centrifugatie bij 2700 x g gedurende 10 min met behulp van een Amicon filter (MWCO 20KDa), gewassen, en opgelost in PBS. Dit verwijdert alle niet-ingesloten drug / lading. Basic biofysische karakteriseringen, zoals grootte, oppervlakte lading, en drugs laden van efficiëntie kan worden uitgevoerd om beter inzicht in de eigenschappen van nanodeeltjes.
3. Opslagruimte
Vriesdrogen is een veelgebruikte methode om nanodeeltjes 11 op te slaan. Vriesdrogen wordt het behoud van de fysische en chemische eigenschappen van de nanodeeltjes voor de stabiliteit op lange termijn 12. Het vriesdrogen proces kan stress veroorzaken op de deeltjes en de destabilisatie van de formulering, zodat cryo-beschermers (bescherming tegen bevriezing stress) en lyo-beschermers (bescherming tegen uitdroging stress) worden vaak gebruikt. De keuze van deze beschermers wordt bepaald door de gewenste lengte van de bewaartermijn 13.
- In vriesdrogen, is er in totaal stollen van het monster door bevriezing onder zijn Tg.
- In de droogstap, is het ijs verwijderd door sublimatie. Temperatuur en de druk moet worden geoptimaliseerd om een efficiënte vriesdroogproces te bereiken.
4. Representatieve resultaten:
Karakterisering van PLGA-b-PEG Di-blokcopolymeer
Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om de succesvolle vervoeging van polymeren te bevestigen. De samenstelling van PLGA-b-PEG kan worden gekarakteriseerd met behulp van een 400 MHz 1H nucleaire magnetische resonantie (NMR). Moleculair gewicht van het gevormde product (PLGA-b-PEG) kan worden geverifieerd door Gelpermeatiechromatografie (GPC). De PLGA-b - PEG moleculair gewicht distribution curve en elutie tijd moet verschillen van PLGA en PEG alleen. In combinatie moeten deze technieken karakteriseren het gevormde product en bepalen of de conjugatie reactie succesvol was.
Karakterisering van PLGA-b-PEG nanodeeltjes
Deeltjesgrootte en grootteverdeling kan gemeten worden door dynamische lichtverstrooiing. Verschillende parameters in het nanoprecipitation proces van invloed op de grootte van de deeltjes. Molecuulgewicht van de gebruikte polymeren in eerste instantie (zowel PLGA en PEG) ook invloed op de verdeling van de deeltjesgrootte. Overgang elektronenmicroscopie (TEM) kan ook worden gebruikt om de grootte verdeling en de structuur van de nanodeeltjes zoals te zien in figuur 3 te bevestigen. De deeltjesgrootte assortiment ligt in het algemeen nm bereik. Grote deeltjesgrootte met ongelijke grootte-verdeling kan zowel duiden op een fout in de conjugatie reactie of de nanoprecipitation methode moet optimalisatie. Daarnaast kan het oppervlak zeta potentieel worden gemeten door ZetaPALS.
Het geneesmiddel / vracht aan boord efficiëntie kan worden gekwantificeerd met standaard HPLC.
De deeltjes zijn opgelost in organische oplosmiddelen en HPLC kunnen worden uitgevoerd om de absorptie van het geneesmiddel / vracht (afb. 4) te meten. De afgifte van geneesmiddelen kinetische studie kan worden gedaan voor zover bekend vaste hoeveelheden van de nanodeeltjes worden gedialyseerd in 30 Slide-A-Lyzer MINI Dialyse eenheden. Op vaste tijdstippen, is de inhoud van de dialyse-unit verzameld en gelijk volume van organisch oplosmiddel wordt toegevoegd aan de nanodeeltjes te ontbinden. HPLC wordt uitgevoerd op deze monsters om de drug / vracht content te kwantificeren.
Figuur 1. EDC / NHS chemie
Figuur 2. Nanoprecipitation methode voor het bereiden van polymere nanodeeltjes. De organische oplossing van een oplosmiddel (acetonitril of DCM) met de PEG-PLGA diblok en de drug of vracht te laden in het deeltje wordt druppelsgewijs toegevoegd aan 3-5 ml van roeren H 2 O.
Figuur 3. Transmissie Elektronen Microscopie van nanopartices. Een TEM beeld van PEG-PLGA nanopartikels met wortamin. Fosfowolfraamzuur werd gebruikt als een contrastmiddel.
Figuur 4. Gecontroleerde afgifte van geneesmiddel uit nanodeeltjes. Vrijgave van Paclitaxel van nanodeeltjes na dialyse in PBS. In de aangegeven tijd werden deeltjes verwijderd uit dialyse-cassettes en solublized in acetonitril. De oplossing werd gemeten met behulp van HPLC. Twee afzonderlijke percelen worden van nanodeeltjes werden vergeleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De nanoprecipitation methode met diblok co-polymeren is een eenvoudige, snelle methode om polymeren nanodeeltjes ingenieur. De resulterende nanodeeltjes bestaan uit een hydrofobe kern die kan worden gebruikt voor de levering van slecht oplosbare verbindingen. Het oppervlak hydrofiele laag kan een uitstekende oplosbaarheid in water terwijl een groep voor de mogelijke verdere conjugatie tot een gericht ligand.
Er zijn veel nanodeeltjes platforms, waaronder liposomen, polymere nanodeeltjes, dendrimeren, metaal deeltjes, en quantum dots 14. Onder deze platforms, de polymère nanodeeltje platform is een van de makkelijkste te formuleren en de meest veelzijdige in termen van applicaties. Het vereist een minimale apparatuur in te stellen en de techniek kan worden geleerd in enkele uren. Het heeft ook een breed scala aan toepassingen en de biocompatibiliteit maakt zowel in vitro als in vivo toepassingen. Haar vermogen om een lading te vervoeren maakt beeldvorming en therapeutische mogelijkheden.
EDC / NHS chemie is hier aan de diblokcopolymeer genereren. Echter, blok-copolymeren worden gesynthetiseerd met behulp van verschillende katalysatoren. Een andere veel gebruikte katalysator is tinoctoaat. De terminal hydroxylgroepen van PEG worden gebruikt als het initiëren groepen om blokcopolymeren te synthetiseren. Ring polymerisatie van lactide en glycolide geïnitieerd door dihydroxy PEG of PEG monomethoxy kan leiden tot ABA of het type AB blokcopolymeren respectievelijk 15. Deze methode van voorbereiding geeft meer flexibiliteit in het ontwerp, maar de EDC / NHS chemie is gemakkelijker te gebruiken en kan tijd besparen door gebruik te maken van een commercieel verkrijgbaar PLGA-polymeer.
In aanvulling op nanoprecipitation, met andere methoden te genereren diblok polymeer nanodeeltjes kunnen worden gebruikt. Een gemeenschappelijke alternatief is een "olie in water" emulsie-methode 16. De emulsie methode begint weer met een organische fase die het diblokcopolymeer en een waterige fase. Echter, bij het mengen van de twee oplossingen, zijn nanodeeltjes gegenereerd door vortexen en sonicating. Deze methode is zeer vergelijkbaar, maar de nanoprecipitaion methode is de controle in de meng-trede alsook vermijdt het gebruik van ultrasoonapparaat.
Er zijn veel mogelijke toepassingen voor dit platform. Ten eerste kan het worden gebruikt voor de levering van hydrofobe / slecht oplosbare geneesmiddelen in drug delivery studies. Bijvoorbeeld, taxanen zijn slecht oplosbaar en vereisen een oplosmiddel voor in vivo studies. Polymere nanodeeltjes kunnen kapselen taxaan drugs en trekt hij de behoefte aan oplosmiddelen. Nanodeeltjes kunnen ook leveren celbiologie reagentia die zijn slecht oplosbaar zijn, zoals wortmannin. Polymeer nanodeeltjes kunnen ook worden geladen met fluorescerende kleurstof en gebruikt voor intracellulaire mensenhandel studies. Deze polymeer nanodeeltjes kunnen worden geconjugeerd aan richten liganden door bovengrondse PEG. In combinatie met fluorescerende etikettering, kunnen deze gerichte nanodeeltjes worden gebruikt om specifieke epitopen op of in cellen label. Aangezien elke nanodeeltje kan een groot aantal fluorescerende moleculen in te kapselen, kunnen de nanodeeltjes verbeteren van de gevoeligheid van dergelijke biologische studies. Fluorescent gelabelde nanodeeltjes kunnen ook worden gebruikt voor in vivo beeldvorming, zoals de visualisatie van de bloedvaten en atherosclerotische plaques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Golfers Against Cancer, Carolina Center for Nanotechnology Excellence Pilot te verlenen, Universiteit Cancer Research Fund en het National Health Institute K-12 Career Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
- Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).
- Bulte, J. W. M. Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).
- Omid, C., Farokhzad, R. L. Impact of Nanotechnology on Drug Delivery. ACS NANO. 3, 16-20 (2009).
- Li, Y. -P., Pei, Y. -Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats. Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , 2nd Edition, (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems. Nature. 388, 860-862 (1997).
- Yoo, H. S., Park, T. G. Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles. Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).
- Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery. Biomaterials. 28, 869-876 (2007).
- Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).
- Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells. J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).
- Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).
- Holzer, M., Vogel, V., Mäntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).
- Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).
- Wang, A. Z. Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. J. Control Release. 63, 155-163 (2000).
- Gref, R.
