Summary
We hebben een hoge dichtheid microarray platform bestaande uit 3D nano-biofilms van
Abstract
Candida albicans blijft de belangrijkste etiologische agent van candidiasis, dat momenteel de vierde meest voorkomende nosocomiale infectie bloedstroom in Amerikaanse ziekenhuizen 1. Deze opportunistische infecties toenemende mate een bedreiging voor een toenemend aantal van gecompromitteerde individuen, en dragen onaanvaardbaar hoge sterftecijfers. Dit is gedeeltelijk door de beperkte arsenaal van antimycotica, maar ook de resistentie tegen de meest toegepaste antischimmelmiddelen. Verdere complicatie behandeling is het feit dat de meeste manifestaties van candidiasis geassocieerd met de vorming van biofilms en cellen in deze biofilm tonen verhoogde weerstand tegen klinisch meest gebruikte antischimmelmiddelen 2. Hier wordt de ontwikkeling van een hoge dichtheid microarray die bestaat uit C. albicans nano-biofilms, die we hebben genoemd Ca BChip 3. In het kort wordt een robot microarrayer gebruikt to druk gistcellen van C. albicans op een vast substraat. Tijdens het drukken worden de gistcellen ingesloten in een driedimensionale matrix, waarbij het volume zo laag als 50 NL en geïmmobiliseerd op een glazen substraat met een geschikte coating. Na de eerste drukken worden de dia geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 24 uur om voor biofilm ontwikkeling. Gedurende deze periode de vlekken uit te groeien tot volledig ontwikkelde "nano-biofilms 'die worden weergegeven typische structurele en fenotypische kenmerken die geassocieerd worden met oude C. albicans biofilms (dwz morfologische complexiteit, driedimensionale architectuur en de resistentie tegen geneesmiddelen) 4. In het algemeen wordt de Ca BChip uit ~ 750-equivalent en ruimtelijk gescheiden biofilm, met het bijkomende voordeel dat meerdere chips kunnen worden gedrukt en gelijktijdig verwerkt. Levensvatbaarheid van de cellen wordt geschat door het meten van de fluorescentie-intensiteit van FUNC1 metabole vlek met behulp van een microarray scanner. Deze schimmel chip is uitermate geschikt voor use in echte high-throughput screening voor antischimmel drug discovery. In vergelijking met de huidige normen (dat wil zeggen de 96-wells microtiterplaat model van biofilmvorming 5), de belangrijkste voordelen van de schimmel biofilm chip zijn automatisering, miniaturisatie, besparingen in hoeveelheid en kosten van de reagentia en analyse tijd, evenals de afschaffing van de arbeid intensieve stappen. Wij zijn van mening dat een dergelijke chip aanzienlijk zal versnellen van de antifungale drug discovery proces.
Protocol
1. Voorbereiding van gefunctionaliseerde Slides
- Plaats de objectglaasjes in een verwijderbare slede rek, en was twee keer door onderdompeling in een kleuring pot met 99% ethanol (histologische graad). Veeg de dia's schoon met keukenpapier (ervoor zorgen niet te papierstof te genereren), en droog met een straal gecomprimeerde stikstofgas.
OPMERKING: Gebruik geen Kim-Wipes om de dia's vegen als hij zou fijn papier stof te genereren.
- Dompel de dia rek met de glaasjes in een kleuring pot met geconcentreerd zwavelzuur en incuberen bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Om contact met de huid te vermijden, gebruik maken van chemisch bestendige handschoenen en een veiligheidsbril tijdens het werken met geconcentreerde zuren en giftige en bijtende chemicaliën.
- Sonificeer de dia gedurende 30 minuten en wassen met Milli-Q (18 MΩ) water gedurende 30 minuten, gevolgd door nog wassen in eencetone gedurende 5 minuten. Deze behandeling onthult de silanolgroepen op het glasoppervlak.
- Bedek de schone dia met 2,5% (vol / vol in water) 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) oplossing door onderdompeling van de schuif rek APTES gedurende 30 minuten te wassen 3 keer in Milli-Q water gedurende 15 minuten elk wassen en bakken de glaasjes in een oven bij 110 ° C gedurende 15 minuten. Bakken kan verknoping van de APTES, waardoor-NH2-functionalisering van het oppervlak.
OPMERKING: Maak de APTES oplossing in een plastic container, omdat APTES deposito's bij voorkeur op de muren van glas container.
- Een rotatie coater, vacht de dia met 1% (gew / vol in tolueen) polystyreen-Co-maleïnezuuranhydride (PS-MA) (Sigma) een mono-laag hydrofobe bekleding 6 bereiken. Voeg 2,0 ml van de PS-MA op een schoon glasplaatje gemonteerd op een spin coater en vacht bij 3.000 toeren per minuut gedurende 30 seconden. Deze voorwaarden kunnen variëren op basis van spin-coating parameters zoals coating, zodatling, substraat, dikte van de coating en beheerst door de volgende vergelijking 7
waarbij h dikte van filmcoaten, e verdamping, η, C en ρ zijn viscositeit concentratie en dichtheid van de bekledingsoplossing, respectievelijk, en ω is hoeksnelheid.
OPMERKING: Tolueen is schadelijk bij inademing voor een lange tijd en het gebruik van een afzuigkap is aanbevolen.
- De dia's kunnen worden opgeslagen in een dia drager voor een maand in droge stof-vrije omstandigheden bij 2-8 ° C.
2. Voorbereiding van de Gist Inocula en Collageen Encapsulation
- Bereid een nachtelijke cultuur van C. albicans stam SC5314 in gist pepton Dextrose [YPD, 10 g / l gistextract, 20 g / L pepton en 20 g / L glucose] vloeibaar medium enten een kolonie C. albicans in 10 - 20 ml YPD 8. Incubeer cultuur een schudapparaat (ongeveer 150 tot 200 opm) bij 30 ° C geroerd. Oogst 1 ml Candida albicans gistcellen van nacht YPD cultures (door centrifugeren bij 5000 rpm gedurende 5-10 minuten) en tweemaal spoelen gedurende 10 minuten in 1 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 10 mM fosfaatbuffer, 2,7 mM kaliumchloride, 137 mM natriumchloride, pH 7,4) (Sigma) per wasstap. Oogst gewassen cellen ook door centrifugeren bij 1900 rpm gedurende 10 minuten. Resuspenderen de gewassen cellen in 1 ml buffer reconstructie (0,2 N NaOH oplossing met 2,2% (gew / vol) natriumbicarbonaat en 4,8% (gew / vol) HEPES, pH 7,2).
OPMERKING: C. albicans is een risicogroep 1/BSL1 micro-organisme. Denk er altijd aan om een goede aseptische / steriele technieken te gebruiken voor het werken met dit micro-organisme en institutionele procedures te volgen voor de juiste afvoer van biologisch gevaarlijk materiaal.
- Tellen cellen met behulp van een hemocytgenomen kilometer een heldere veldmicroscoop passen aan een celdichtheid van 5 x 10 7 cellen / ml.
- Verdun de suspensie tien keer door toevoeging van 10 x RPMI-1640 aangevuld met L-glutamine en gebufferd met morpholinepropanesulfonic (MOPS) zuur (pH 7,2).
- Inkapselde gistcellen collageen door mengen van de celsuspensie in RPMI-1640 met collageen (1,8 mg / ml) (Type 1 uit rattenstaart, BD Biosciences, Bedford, MA) het verkrijgen een eindconcentratie van 4 x 10 6 cellen / mL. Houd de collageen-celsuspensie op ijs om de gelering van collageen te voorkomen voordat u afdrukt.
3. Voorbereiding van Ca BChip
- Reinig en desinfecteer alle oppervlakken van de microarrayer, met inbegrip van de bron plaat station, was-en vacuüm-station, vacuüm glijbaan schotel en printen kamer, schoon met 70% isopropanol.
- Plaats en houd door een vacuüm het gewenste aantal PS-MA-gecoat glas dia's op de dia dek van de microfoonroarrayer.
- Vortex de celsuspensie in collageen krachtig en zuig 100 ul van de goed gemengde suspensie in een put van een 96-wells plaat, vlak voor het afdrukken. Plaats deze bron plaat in het laadstation.
- Zet de bevochtiger met een relatieve vochtigheid van 100% in de microarray kamer gedurende het drukken te handhaven.
- Print 50 NL celsuspensie in een array van 48 rijen en 16 kolommen met vlekken 1,2 mm afstand van elkaar met behulp van een microarray spotter (Omnigrid Micro, Inc DigiLAB, Holliston, MA) door non-contact depositie met conisch taps toelopende 190 micrometer opening keramische tips (DigiLAB).
- Prime, spoel en vacuüm droog de tips twee keer na elke ronde van de boekdrukkunst.
- Onmiddellijk na het afdrukken, plaatst u de dia in een luchtdichte, vochtige kamer (hybridisatie cassette, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) en incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur mogelijk te maken biofilmvorming.
4. Gevoeligheid Testen van Preformed biofilms in Ca BChip tegen antimycotica
- Uit voorraad oplossingen of poeder van antimycotica, bereidt u een werkende oplossing in RPMI-1640 medium. Typische maximale concentraties van de werkende oplossing zijn 1.024 ug / ml voor fluconazol en 16 ng / ml voor amfotericine B 5. Andere concentraties kan worden gebruikt voor verschillende stoffen.
- Bereid acht verschillende concentraties van de verbinding door verdunning van de voorraadoplossing in tweevoudige verdunningen, verspreid over een aantal met de geschatte IC50 van de verbinding in het midden.
- Na 24 uur van biofilm, met de microarrayer 50 nL acht verschillende concentraties van het geneesmiddel af, samen met de positieve (geen geneesmiddel dwz elementen alleen media) en negatieve (behandeling met natriumhypochloriet 20 min) controles in ten minste zes identieke monsters op de top van de biofilms.
OPMERKING: Zorg voor een relatieve luchtvochtigheid van 100% tot het drogen van de vlekken te voorkomen en addING de drugs.
- Kort na het toevoegen van de geneesmiddelen incuberen van de chip met de geneesmiddelen in een bevochtigde kamer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Was de middelen uit door dunking de CaBChip 3-5 maal gedurende 2 minuten telkens in PBS en vlekken door incuberen van de Ca BChip met 0,5 pM FUNC1 bij 37 ° C gedurende 30 min 9.
- Was de vlek uit door dunken de Ca BChip 3-5 keer in PBS gedurende 1-3 minuten elke dunk, en droog de Ca BChip met behulp van een stikstofstroom. Lees fluorescentie-intensiteit met een microarray scanner (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) bij een golflengte van 532 nm met BET versterking van 380.
- Stel de fluorescentie-intensiteit van de positieve controle (geen drugs) en dode (bleekwater behandelde) biofilm vlekken op 100% en 0%, respectievelijk.
- Bepaal het percentage remming van de verlaging van de fluorescentie intensiteit (F) ten opzichte van het gemiddelde van de controle spots met de volgende formule
waarin F, C max en F o zijn rauwe fluorescentie-intensiteiten van het geneesmiddel behandeld, no-drugsbestrijding en bleekmiddel-behandelde plekken, respectievelijk. De scanner instellingen zijn aangepast aan de C max en F o van 30000 en 4000 RFU, respectievelijk te verkrijgen.
- Bereken het 50% remmende concentratie of IC 50 door het aanbrengen van de variabele helling Hill vergelijking met GraphPad Prism Software (La Jolla, CA).
5. Representatieve resultaten
Een representatieve Ca BChip, bestaande uit een 48 x 16 matrix van nano-biofilms van C. albicans, is weergegeven in figuur 2. De lichte veld microscopie blijkt dat er algemene architectonische kenmerk van de nano-biofilm. De scanning elektronen microscopisch beeld van de biofilm blijkt dat de schimmeldraden ingebed in de matrix vancollageenvezels, die ongeveer 2 micrometer en 100 nm in diameter, respectievelijk. De FUNC1-gekleurde microarray scanner beelden tonen de gist en hyfen vormen, die kenmerkend zijn voor schimmel biofilms. De 2D-en 3D-confocale beelden van fluorescentie FUNC1 gekleurde biofilm worden gezien ruimtelijke variatie hebben met gebieden van metabolisch actieve cellen afgewisseld in de extracellulaire matrix (samengesteld uit collageen als het omhullingsmateriaal en waarschijnlijk ook geproduceerd exopolymeric materiaal door biofilm cellen), die niet gekleurd door de metabole kleurstof. De dikte van de biofilm werd geschat op ongeveer 50 pm. De Ca BChip werd gebruikt om de gevoeligheid van schimmels twee geneesmiddelen, fluconazol en amfotericine B schatten en de resultaten zijn weergegeven in figuur 3. In overeenstemming met gepubliceerde rapporten over de industrie standaard 96-well plaat assays, de biofilms zijn bestand tegen fluconazol 10 en de berekende IC 50 voor amfotericine B 0,3 ug / ml 11.
Figuur 1. Stroomschema voor de vervaardiging van Ca BChip.
Figuur 2. Een foto van de high-throughput 'Ca BChip, afgedrukt met behulp van een robot microarrayer en met 768 plekken op PS-MA-gecoate glaasjes. Elke halfronde spot 50 nL in volume ongeveer 700 micrometer diameter, en met een 1,2 mm gescheiden plaatsen. Ook getoond (met de klok mee) zijn licht microscopie, microarray scanner, 2D-en 3D-fluorescentie microscopie en scanning elektronenmicroscopie beelden van de individuele biofilms op de Ca BChip. De SEM figuur bij een hoge vergrotingsfactor van 25.000 x toont een hyphal gloeidraad van breedte 2 micrometer.
Figuur 3 "src =" / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg "/>
Figuur 3. Resultaten van antifungale gevoeligheidstesten en de bepaling van IC 50-waarden voor (A) fluconazol en (B) amfotericine B met behulp van Ca BChip. De fluorescentiemicroscoop beelden van amfotericine B behandelde biofilms wordt in (C). De resultaten zijn gemiddelde ± standaard fout betekenen voor twee aparte chips met 10 herhalingen voor elke conditie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een cel op basis van high-density microarray, Ca BChip, bestaande uit nanoliter volumes van Candida albicans biofilms. De microarray werd gedrukt op gemodificeerde glazen substraten, waardoor voor robuuste bevestiging van collageen gel spots terwijl hydrofobiciteit nodig voor een niet-spreiden, halfronde 3D gel. Een Ca BChip kan vervangen ongeveer acht 96 putjes, en verschillende chips kunnen worden gedrukt en verwerkt tegelijkertijd. De chip maakt gebruik van nano-schaal culturen, maakt een eenvoudige en snelle handling, vatbaar is voor automatisering, minimaliseert de handenarbeid en de kosten en is volledig compatibel met standaard microarray technologie en apparatuur. Bovendien de technologie is flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast aan andere micro-organismen. Ondanks miniaturisatie, de nano-biofilms gevormd op Ca BChip weergave-eigenschappen die kenmerkend zijn voor de C. albicans biofilm levensstijl, inclusief 3D Architecture en resistentie tegen geneesmiddelen. Zo is de Ca BChip zorgt voor echte high-throughput screening, en heeft het potentieel voor een paradigmaverschuiving in antimicrobiële drug discovery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jose L. Lopez-Ribot en Anand K. Ramasubramanian eigen vermogen in MicrobeHTS Technologies, Inc, die zich ontwikkelt antischimmelmiddelen. MicrobeHTS Technologies, Inc mits er geen financiële steun voor deze studies.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gefinancierd door subsidies van de Zuid-Texas Technologie Management (POCrr 2009,041), het Instituut voor Integratie of Medicine en Science van de National Center for Research Resources (UL 1RR025767), en van het National Institute of Dental & Craniofaciale Onderzoek ( 5R21DE017294).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
