Summary
Wir haben eine hohe Dichte Microarray-Plattform bestehend aus 3D-Nano-Biofilme von entwickelten
Abstract
Candida albicans vor der wichtigste Erreger der Candidiasis, die derzeit die vierthäufigste nosokomiale Infektion der Blutbahn in US-Krankenhäusern ein. Diese opportunistische Infektionen stellen eine wachsende Bedrohung für eine wachsende Zahl von kompromittierten Individuen und tragen inakzeptabel hohen Sterblichkeitsraten. Dies ist zum Teil aufgrund der begrenzten Arsenal von Antimykotika, sondern auch auf die Entstehung von Resistenzen gegen die am häufigsten verwendeten Antimykotika. Eine weitere Komplikation der Behandlung ist die Tatsache, dass eine Mehrheit der Manifestationen der Candidiasis mit der Bildung von Biofilmen assoziiert sind, und Zellen innerhalb dieser Biofilme zeigen erhöhte Beständigkeit gegen die meisten klinisch-Antimykotika 2 verwendet. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines High-Density-Microarray, die aus C besteht albicans Nano-Biofilme, die wir Ca BChip 3 benannt haben. Kurz gesagt, wird ein Roboter-Microarrayer t verwendeto Druck Hefezellen C albicans auf ein festes Substrat. Während des Druckens werden die Hefezellen in einer dreidimensionalen Matrix mit einem Volumen von nur 50 nl und immobilisiert auf einem Glassubstrat mit einer geeigneten Beschichtung eingeschlossen. Nach anfänglichen Druck werden die Folien bei 37 ° C für 24 Stunden inkubiert, um für Biofilmentwicklung ermöglichen. Während dieser Zeit wachsen die Flecken in voll entwickelte "Nano-Biofilme", das zeigen die typischen Struktur-und phänotypische Merkmale mit altem C verbunden albicans Biofilmen (dh morphologische Komplexität, dreidimensionale Architektur und drug resistance) 4. Insgesamt ist das Ca BChip von ~ 750 entspricht und räumlich unterschiedlichen Biofilme bestehen; mit dem zusätzlichen Vorteil, dass mehrere Chips gedruckt und verarbeitet werden können simultan. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Messen der Fluoreszenzintensität der FUN1 metabolischen Färbung unter Verwendung eines Mikroarray-Abtastvorrichtung geschätzt. Dieser Pilz-Chip eignet sich ideal für u geeignetse in echter High-Throughput-Screening für antimykotische Wirkstoffforschung. Im Vergleich zu aktuellen Standards (dh der 96-well Mikrotiterplatten-Modell der Biofilmbildung 5), sind die wichtigsten Vorteile des Pilz-Biofilm-Chip-Automatisierung, Miniaturisierung, Einsparungen bei den Mengen und Kosten der Reagenzien und Analysen Zeit, sowie die Beseitigung von Arbeitskräften intensive Schritte. Wir glauben, dass solche Chips wird erheblich beschleunigen den antimykotischen Wirkstoff-Forschung.
Protocol
1. Synthese von funktionalisierten Folien
- Legen Sie die Objektträger in einem herausnehmbaren Objektträgergestell, und waschen zweimal durch Eintauchen in eine Küvette mit 99% Ethanol (Grading). Wischen Sie die Folien mit Papiertüchern reinigen (Sicherstellung nicht um Papierstaub zu generieren), trocken und mit einem Strahl aus unter Druck stehendem Stickstoffgas.
HINWEIS: Verwenden Sie nicht Kim-Wipes, um die Folien wischen, wie es Feinpapier Staub erzeugen würde.
- Tauchen Sie die Dia-Rack mit den Objektträger in einer Küvette mit konzentrierter Schwefelsäure und inkubieren Sie bei Raumtemperatur über Nacht gefüllt.
HINWEIS: Um Berührung mit der Haut zu vermeiden, verwenden chemikalienbeständige Handschuhe und Schutzbrille beim Arbeiten mit konzentrierten Säuren und giftige und ätzende Chemikalien.
- Beschallen die Folien für 30 Minuten waschen und mit Milli-Q (18 MOhm) Wasser für 30 Minuten, mit einem weiteren Waschgang in einer folgencetone für 5 min. Diese Behandlung macht die Silanolgruppen auf der Glasoberfläche.
- Die gereinigte Objektträger mit 2,5% (vol / vol in Wasser) von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES)-Lösung, durch Eintauchen des Objektträgergestell in APTES für 30 min, 3-maligem Waschen in Milli-Q Wasser für 15 Minuten bei jedem Waschen und Backen die Folien in einem Ofen bei 110 ° C für 15 min. Backen ermöglicht Vernetzung der APTES, was zu-NH 2-Funktionalisierung der Oberfläche.
HINWEIS: Stellen Sie die APTES Lösung in einem Kunststoffbehälter seit APTES Ablagerungen bevorzugt an den Wänden der Glasbehälter.
- Verwendung einer Spinbeschichtungsvorrichtung, Beschichtung der Folien mit 1% (Gew. / Vol. in Toluol) Polystyrol-Co-Maleinsäureanhydrid (MA-PS) (Sigma), um eine Mono-Schicht aus hydrophoben Beschichtung 6 zu erreichen. Fügen Sie 2,0 ml PS-MA auf einen sauberen Objektträger aus Glas auf einem Spin-Coater und Mantel bei 3.000 rpm für 30 s montiert. Diese Bedingungen können auf Spin-Coating-Beschichtung Parameter wie variieren, sosung, Substrat, Dicke der Beschichtung und geregelt durch die folgende Gleichung 7
wobei h Dicke von Film-Beschichtung, E Verdampfungsrate sind η, C und ρ Viskosität, Konzentration und Dichte der Beschichtungslösung, jeweils, und ω die Winkelgeschwindigkeit.
HINWEIS: Toluol ist gesundheitsschädlich, wenn für eine lange Zeit und die Verwendung von einem Abzug eingeatmet wird empfohlen.
- 8 ° C - Die Dias können in einem Dia-Rack für bis zu einem Monat in trockenen, staubfreien Bedingungen bei 2
2. Herstellung von Hefe-Inokula und Collagen Encapsulation
- Bereiten Sie eine Übernachtkultur von C. albicans SC5314, in Hefe-Pepton-Dextrose [YPD; 10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton und 20 g / l Dextrose] flüssigen Medium durch Beimpfen eines einzelnen Kolonie von C albicans in 10 - 20 ml YPD-8. Inkubieren Kultur in einem Schüttler (ca. 150 bis 200 rpm) bei 30 ° C über Nacht. Ernte 1 ml Hefe Candida albicans Zellen aus Kulturen über Nacht YPD (durch Zentrifugation bei 5.000 UpM für 5-10 Minuten) und waschen zweimal für 10 min in 1 ml steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, 10 mM Phosphat-Puffer, 2,7 mM Kaliumchlorid, 137 mM Natriumchlorid, pH 7,4) (Sigma) pro Wäsche. Ernte gewaschenen Zellen auch durch Zentrifugation bei 1900 UpM für 10 Minuten. Resuspendieren der gewaschenen Zellen in 1 ml Rekonstruktion Puffer (0,2 N NaOH-Lösung mit 2,2% (Gew / Vol) Natriumbicarbonat und 4,8% (Gew / Vol) HEPES, pH 7,2).
HINWEIS: C. albicans ist ein Risk Group 1/BSL1 Mikroorganismus. Immer daran denken, gute aseptische / sterile Techniken für die Arbeit nutzen mit diesem Mikroorganismus und folgen institutionellen Verfahren für die ordnungsgemäße Entsorgung biologischer Gefahrenstoffe.
- Zählen von Zellen mit Hilfe eines hemocytBeschleunigungsaufnehmer auf einem Hellfeld-Mikroskop und stellen bis zu einer Zelldichte von 5 × 10 7 Zellen / ml.
- Weitere Die Suspension zehnmal durch Zugabe von 10 × RPMI-1640 mit L-Glutamin und gepuffert mit Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) Säure (pH 7,2).
- Kapseln der Hefezellen in Kollagen durch Mischen der Zellsuspension in RPMI-1640 mit Kollagen (1,8 mg / ml) (Typ 1 aus Rattenschwanz, BD Biosciences, Bedford, MA), um eine Endkonzentration von 4 × 10 6 Zellen / zu erhalten ml. Halten Sie die Kollagen-Zell-Suspension auf Eis, um die Gelierung von Kollagen vor dem Druck zu verhindern.
3. Herstellung von Ca BChip
- Reinigen und desinfizieren Sie alle Oberflächen des Microarrayer, einschließlich der Quelle Platte Station, Wasch-und Vakuum-Station, Vakuum und Druck Teller gleiten Kammer, durch Abreiben mit 70% Isopropanol.
- Platzieren und halten durch Vakuum die gewünschte Anzahl von PS-MA-beschichteten Glas-Objektträger auf dem Objektträger Deck des Mikrofonroarrayer.
- Vortex die Zellsuspension in Kollagen und kräftig saugen 100 ul des gut gemischten Suspension in eine Vertiefung einer 96-Well Platte kurz vor dem Drucken. Legen Sie diese Quelle Platte in der Ladestation.
- Schalten Sie den Luftbefeuchter auf eine relative Luftfeuchtigkeit von 100% in der Microarray-Kammer während des gesamten Druckprozesses.
- Drucken 50 nl der Zellsuspension in einem Array von 48 Zeilen und 16 Spalten mit Flecken 1,2 mm voneinander unter Verwendung eines Mikroarray (Pyxsis Omnigrid Micro Digilab Inc., Holliston, MA) durch berührungslose Abscheidung mit konisch zulaufenden Öffnung 190 um Keramikspitzen beabstandet (Digilab).
- Prime gründlich und unter Vakuum getrocknet zweimal die Spitzen nach jeder Runde der Drucklegung.
- Unmittelbar nach dem Druck, legen Sie die Folie in einem luftdichten, feuchten Kammer (Hybridisierung Kassette, Arrayit Corporation, Sunnyvale, CA) und Inkubation bei 37 ° C für 24 h bis zur Bildung von Biofilmen zu ermöglichen.
4. Empfindlichkeitsprüfung von Preformed Biofilme in Ca BChip gegen Antimykotika
- Ab Lager Lösungen oder Pulver von Antimykotika, bereiten eine funktionierende Lösung in RPMI-1640 Medium. Typische maximale Konzentration der Arbeitslösung sind 1.024 ug / ml für Fluconazol und 16 ug / ml für Amphotericin B 5. Andere Konzentrationen können für verschiedene Mittel verwendet werden.
- Planen acht verschiedenen Konzentrationen der Verbindung, die durch Verdünnen der Stammlösung in zweifachen Verdünnungen, die einen Bereich mit dem geschätzten IC 50 der Verbindung in der Mitte.
- Nach 24 Stunden von Biofilmwachstum, verwenden Sie die Microarrayer zu 50 nL von acht verschiedenen Konzentrationen der Medikamente zu drucken, zusammen mit positiven (kein Medikament, dh Zellen, die in nur Medien) und negativen (behandelt mit Natriumhypochlorit für 20 min) Kontrollen in mindestens sechs Wiederholungen am Anfang der Biofilme.
HINWEIS: Achten Sie auf eine relative Luftfeuchtigkeit von 100% auf die Trocknung der Spots während Add verhindernÝng die Drogen.
- Bald nach der Zugabe der Medikamente, Inkubieren des Chips mit den Medikamenten in einer befeuchteten Kammer bei 37 ° C für 24 Stunden.
- Waschen der Medikamente durch Eintauchen des CaBChip 3-5 mal für 2 min jedes Mal in PBS und Flecken durch Inkubation des Ca BChip mit 0,5 uM FUN1 bei 37 ° C für 30 min 9.
- Waschen Sie den Fleck durch Eintauchen der Ca BChip 3-5 mal in PBS für 1-3 min jeden Dunk, und trocknen Sie das Ca BChip mit einem Stickstoffstrom. Lesen Fluoreszenzintensität unter Verwendung eines Mikroarray-Abtastvorrichtung (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) bei einer Wellenlänge von 532 nm mit einer PMT-Verstärkung von 380.
- Stellen Sie die Intensität der Fluoreszenz der positiven Kontrolle (kein Medikament) und tot (Bleich-behandelten) Biofilm Flecken bei 100% und 0% betragen.
- Der prozentuale Hemmung durch die Verringerung der Intensität der Fluoreszenz (F) relativ zu dem Durchschnitt der Kontrollflecken Verwendung der folgenden Gleichung
wo F, F max und F o sind rohe Fluoreszenzintensitäten von Arzneimittel-behandelten, nicht-Drogen-und Bleichmittel behandelten Flecken, jeweils. Die Scanner-Einstellungen wurden so eingestellt, C max und F o von 30000 und 4000 RFU bzw. zu erhalten.
- Berechnen Sie die 50% hemmende Konzentration oder IC 50 durch Einsetzen des variablen Steigung Hill-Gleichung unter Verwendung von GraphPad Prism Software (La Jolla, CA).
5. Repräsentative Ergebnisse
Eine repräsentative Ca BChip, bestehend aus einem 48 × 16-Anordnung von Nano-Biofilme von C. albicans, ist in 2 gezeigt. Die Hellfeld-Mikroskopie zeigt eine Gesamtansicht architektonische Merkmal des Nano-Biofilm. Die REM-Aufnahmen von dem Biofilm zeigen, dass die Hyphen in der Matrix eingebettet sindKollagenfasern, die etwa 2 um und 100 nm im Durchmesser sind, jeweils. Die FUN1-gefärbten Microarray-Scanner Bilder zeigen die Hefe und Hyphen-Formen, die charakteristisch für Pilz-Biofilmen sind. Die 2D-und 3D-konfokale Fluoreszenz-Bilder von FUN1-gefärbten Biofilmen zu sehen, dass räumliche Heterogenität aufweisen, mit Regionen von metabolisch aktiven Zellen in der extrazellulären Matrix (bestehend aus Kollagen als Einkapselungsmaterial und höchstwahrscheinlich auch von exopolymere Material hergestellt durch eingestreute Biofilm-Zellen), die nicht durch den metabolischen Farbstoff gefärbt. Die Dicke der Biofilm wurde auf etwa 50 um. Die Ca BChip wurde verwendet, um die antifungale Empfindlichkeit von zwei Medikamenten, Fluconazol und Amphotericin B zu schätzen, und die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. In Übereinstimmung mit veröffentlichten Berichten über Industriestandard 96-Well-Platte Assays sind in den Biofilmen gegen Fluconazol 10 und der berechneten IC 50 für resistente Amphotericin B ist 0,3 ug / ml 11.
Abbildung 1. Flussdiagramm für die Herstellung von Ca BChip.
Abbildung 2. Ein Bild der Hochdurch-Ca BChip, bedruckt mit einem Roboter-Microarrayer und mit 768 Punkten auf PS-MA-beschichtete Objektträger. Jeder Spot ist halbkugelförmigen 50 nl Volumen, ca. 700 um im Durchmesser und mit einem 1,2 mm Abstand zwischen Flecken. Ebenfalls gezeigt (im Uhrzeigersinn) sind die Lichtmikroskopie, Microarray-Scanner, 2D-und 3D-Fluoreszenz-Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie Bilder der einzelnen Biofilmen auf der Ca BChip. Die REM-Abbildung bei hoher Vergrößerung von 25.000 x zeigt eine Hyphen Filament mit einer Breite von 2 um.
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Abbildung 3. Ergebnisse der antimykotische Empfindlichkeitsprüfung und Bestimmung der IC 50-Werte für (A) und Fluconazol (B) Amphotericin B mit Ca BChip. Die Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen von Amphotericin B-behandelten Biofilme sind in (C) gezeigt. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardfehler für zwei separaten Chips mit 10 bedeuten Wiederholungen für jede Bedingung.
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Discussion
Wir haben eine zell-basierte High-Density-Microarrays, Ca BChip, bestehend aus Nanoliterbereich Candida albicans Biofilmen entwickelt. Der Mikroarray wurde auf modifizierten Glas-Substrate, die für robuste Befestigung Kollagengel Stellen erlaubt und gleichzeitig Hydrophobie, die für eine nicht anzulegen, halbkugelförmigen 3D-Gel gedruckt. Eine einzelne Ca BChip ersetzen etwa acht 96-Well-Platten und mehrere Chips können ausgedruckt und zur gleichen Zeit verarbeitet werden. Der Chip nutzt Nano-Kulturen, ermöglicht eine einfache und schnelle Handhabung, ist einer Automatisierung zugänglich, minimiert manuelle Arbeit und Kosten und ist voll kompatibel mit Standard-Microarray-Technologie und Ausrüstung. Darüber hinaus ist die Technologie flexibel und kann leicht auf andere Mikroorganismen angepasst werden. Trotz Miniaturisierung, die Nano-Biofilme auf Ca BChip Display Eigenschaften, die charakteristisch für die C sind gebildet albicans Biofilm Lebensstil, einschließlich 3D-Architekture und Resistenzen. Somit erlaubt die Ca BChip für echtes High-Throughput-Screening, und hat das Potenzial für einen Paradigmenwechsel in der antimikrobiellen Wirkstoffentwicklung.
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Disclosures
Jose L. Lopez-Ribot und Anand K. Ramasubramanian Eigenkapital in MicrobeHTS Technologies, Inc., die Entwicklung von Antimykotika ist. MicrobeHTS Technologies, Inc. zur Verfügung gestellt keine finanzielle Unterstützung für diese Studien.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Süden von Texas Technologiemanagement (POCrr 2009,041), das Institut für die Integration von Medizin und Wissenschaft vom National Center for Research Resources (UL 1RR025767), und vom National Institute of Dental & Kraniofaziale Forschung (gefördert 5R21DE017294).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
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