Summary
Kv通道功能障碍有关的心律失常。为了研究的分子机制，我们利用一个系统的协议，用于隔离的心房和心室的心肌细胞钾通道附属亚基基因敲除小鼠等心律失常。乳鼠心肌细胞，就可以立即用于细胞电生理研究，生化或免疫荧光法（IF）检测。
Abstract
KCNE基因编码的钾离子通道Kv通道α亚单位形成异源复合物的辅助亚基修改其功能特性的一个小型的家庭。 KCNE基因的突变已发现的心律失常，如长QT综合征和/或心房纤维颤动患者。但是，确切的分子，导致这些疾病的病理生理仍然是难以捉摸的。在以前的研究中，大多的疾病，导致这些基因突变的电生理特性研究中的异源表达系统，我们不能确定是否可以直接翻译成原生的心肌细胞的影响。因此，在我们的实验室中，我们使用了不同的方法。我们直接的影响研究中的KCNE基因缺失孤立的基因敲除小鼠的心肌细胞电生理-一个独特的技术，我们在这个问题上的杂志的可视化实验描述。从遗传学的心或LLY的设计KCNE小鼠迅速切除，主动脉插管Langendorff装置由安装在。心肌组织中的游离Ca 2 +的约束，EGTA，由一个专门的低Ca 2 +缓冲液胶原酶逆行灌注的冠状动脉和心肌细胞的分离，然后实现。心房，然后可以自由的右心室壁和左心室的显微技术分离。钙然后慢慢地在洗涤过程中的多个步骤，包括乳鼠心肌细胞。健康的外表，没有自发性收缩的心房和心室肌细胞，然后立即进行电生理分析内前6个小时后，隔离膜片钳技术或其他生化分析。
Protocol
1。动物麻醉和活摘器官
- 麻醉的小鼠腹腔注射注射氯胺酮（200 mg / kg体重）和甲苯噻嗪（20 mg / kg体重）。
- 抗凝治疗注射250 IU肝素的ip为避免血液凝固和血栓形成。
- 等待直到达到深昏迷状态，其特点是通过反射消失。轻轻地接触角膜反射的尾巴捏或飞行试验，检查无反射，角膜反射测试。
- 鼠标上手术台转移，并将其固定在仰卧位。
- 切开皮肤和腹壁剑突下和执行翻盖开胸切到双方沿肋弓，随后切断肋骨在腋前线内侧，肋骨向上偏转。
- 打开心包，找到大血管。轻轻地按压心脏的尾鳍，以更好地显示主动脉。使用镊子夹住主动脉。
- 在凹部的一对单峰，将心脏 cissors和解剖与一个单一的切断所有连接的容器。请一定要保持一个足够大的一部分，Langendorff离体主动脉插管。
- 立即切除心脏转移用冰冷和预充氧溶液1（的解决方案，请参阅表1）填充到陪替氏培养皿。
2。制备心脏和Langendorff灌流
- 导管插入主动脉与的1.8F钢套管。请一定要避免空气栓塞。
- 注视主动脉插管与1毫升溶液1与手术用缝合线和冲洗冠状动脉。
- 连接套管与Langendorff装置。
- 请确保开胸的Langendorff插管时间不超过120秒，以避免延长心肌缺血/再灌注损伤。
- 灌注心脏用10毫升的Ca 2 +免费的解决方案（4毫升/分钟）。
- 灌注心脏与胶原酶溶液3的8分钟（4毫升/分钟）。
- 转移心脏成预先温热的100毫米培养皿中含有低Ca 2 +溶液4。
- 主动脉和其他非心脏组织，用剪刀小心地取出，并将其丢弃。
- 独立的心房和心室，并继续与各室分开。保持细胞浸渍在溶液4。使用少量（小于5毫升）。
4。进一步解离的心肌细胞
- 心房心肌细胞：
- 个性化房心肌细胞心房转移到一个单独的预热的100-mm的培养皿中，用细镊子轻轻拉出，除了通过分离组织。确保几乎完全分离的组织。
- 使用1毫升吸移管，用火抛光的放大塑料移液管尖，5分钟，使细胞悬浮在1ml的溶液5。
- 从碎片中分离出细胞，通过使用细胞过滤器（200微米筛目大小）。 <李>加入5毫升溶液5的细胞悬浮液，并离心2分钟，在室温下在16×g离心。
- 下面的步骤操作下的细胞培养罩。弃去上清液并将其再悬浮的颗粒在5毫升的溶液6。
- 通过重力在一个15毫升的试管10分钟后沉淀，离心1分钟，在室温下在16×g离心。除去上清液。重新悬浮细胞根据其数量在1-5毫升的溶液6。
- 解剖左心室感兴趣区域的细钳子在5毫升的溶液4。
- 挂起轻轻移液直到大部分的细胞中分离的细胞。转移后的细胞溶液（200微米网目尺寸）过滤到50ml管中，加入25毫升的体积。
- 离心2分钟，在室温下在16×g离心。
- 下面的步骤操作下的细胞培养罩。移除上清液，沉淀重新悬浮在25毫升溶液6和允许沉降10分钟的细胞。
- 计数细胞，除去上清液，添加25 - 50毫升溶液6上的细胞。
5。制备心肌细胞电生理，生化，如果研究
- 电生理学研究中，保持在50毫升的试管中的溶液6中的心肌细胞和抑制沉淀。
- 对于生化研究， 例如 ，钙成像，在层粘连蛋白涂层的细胞培养皿中（终浓度为20μg/ ml的层粘连蛋白在PBS中）的板肌细胞。
- 对于免疫荧光染色制备细胞培养皿中板与玻璃盖玻片和涂有层粘连蛋白溶液（最终浓度为50μg/ ml的层粘连蛋白在PBS中）。
- 电镀前肌细胞中取出的解决方案。板的细胞的细胞密度和控制通过使用显微镜。
- 让肌细胞坚持以盖玻片1小时，在37°C在2％CO 2，删除解决方案一个标准的染色程序协议，并立即开始。
- 与固色剂， 例如 4％PFA在PBS（pH7.5）中孵育10分钟，在室温下，并按照与3的PBS洗涤步骤，每次5分钟。
- 至细胞透性，并抑制非特异性结合的抗体孵育的心肌细胞含10％血清，0.2％BSA的PBS中，在室温下的30分钟，0.3％的Triton。
- 初级抗体孵育1小时，在37℃下洗如前所述。
- 孵育1小时，在室温下与第二抗体。染液核和α-辅肌动蛋白的利用DAPI荧光染料标记的鬼笔环肽（Invitrogen公司）的Alexa Fluor 488。
- 洗涤后，盖玻片转移仔细硅烷处理过的显微镜载玻片和嵌入细胞的荧光安装介质。
6。细胞电
- 对频率进行全细胞膜片钳记录shly分离心房和心室的心肌细胞在室温下。
- 健康出现心肌转移到充满了限定体积的细胞外灌流液灌注室。 117 mM氯化钠，4 mM KCl中，1mM的KH 2 PO 4，4毫摩尔的NaHCO 3，1.7毫摩尔MgCl 2，3 mM的氯化钴，10mM的HEPES，10mM葡萄糖，和0.02 mM的河豚毒素（TTX），（pH值7.4） 。使用NaOH溶液调节pH值。
- 使用正确的修补程序的夹紧设备（ 即 IX71倒置显微镜，一个Multiclamp的700B放大器，一个Digidata 1440A采集系统和PC，pClamp10.3软件（Molecular Devices公司））。
- 使用补丁移液管电阻为3-5MΩ时充满了细胞内液含130毫米氯化钾，2毫摩尔MgCl 2，11 MM HEPES，EGTA 11毫米，5毫米的Na 2 ATP，0.4毫米的Na 2 GTP，5毫米的Na 2 CP和4.9毫摩尔的CaCl 2（pH7.2）中。使用KOH溶液pH值调节。
- 唤起外向钾电流杜环4.5秒电压测试电位-60和+50 mV的10 mV递增，从20毫秒后，预脉冲至-40 mV的保持电位为-70 mV之间。
- 确保泄漏电流<100 pA的。
- 对于解剖不同的K +电流的使用特异性抑制剂，如4 - 氨基吡啶（4-AP，ICN Biomedicals，尔湾，加利福尼亚州，美国），2 Heteropodatoxin（HpTx2; Alomone）或四乙基铵（TEA，Sigma公司）。联合解决方案应编制外沐浴液，并通过微尖“基线”的录音后，直接应用到最接近的可能的细胞附近。平衡应该被允许的“毒”录音的前2-3分钟。
- 对于分析，在各个细胞的细胞尺寸（全细胞的膜电容）的电流幅值正常化。脱机使用pClamp10.3软件（Molecular Devices公司）或类似的软件进行数据分析。
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Representative Results
从遗传工程小鼠的功能研究特定基因在体外的兴趣成年小鼠心肌细胞的分离已经成为一个强大的工具，以进一步了解心脏的病理生理机制。这种方法是目前使用的只有一小，但越来越多的全球基础科学实验室。但是，隔离成人心室鼠心肌细胞的可能会非常棘手，需要做彻底和反复的由经验丰富的手。 图1显示了新鲜分离的典范心房和心室的心肌细胞。心室肌细胞，我们建议只使用杆状，横纹心室肌细胞健康的外观没有自发性收缩。心房肌细胞与心肌细胞相比，短，更薄。心室心肌细胞的特性的条形和棒状缺少成年心房小鼠心肌细胞。心室肌细胞分离出产量从一个完整的小鼠心脏为5×10 5 - 1×10 6。对于心房心肌细胞，它是显着少。我们普遍预期5 - 25000心房细胞从一个小鼠心脏分离。一旦分离，心肌细胞可以进行不同的体外技术，包括电生理记录（ 图1）。我们建议您在使用前6小时后，隔离乳鼠心肌细胞内。 图1所示的典范Kv通道向外录音（在右边）诱发的心房和心室的心肌细胞去极化不同的步骤，全细胞膜片钳技术。成年小鼠心室和心房Kv通道复极化电流的特征形状可以看出，在定义的时间过程（这里是4秒， 图1）。请注意，电流的幅值是在显着较低的小鼠成人心房心肌心室心肌细胞相比。
| 解 | 目录（的MM，如果没有指定不同的） |
| 1 | 4 117氯化钠，氯化钾，10 HEPES，1 KH 2 PO 4，4的NaHCO 3，1.7的MgCl 2，10葡萄糖 |
| 2 | 4 117氯化钠，氯化钾，10 HEPES，1 KH 2 PO 4，4的NaHCO 3，1.7的MgCl 2，10葡萄糖+ 229.5μMEGTA |
| 3 | 117氯化钠，氯化钾，10 HEPES，1 KH 2 PO 4，碳酸氢钠 ，1.7 氯化镁 ，10葡萄糖， 氯化钙 0.1 + 0.8克/ L的胶原酶2型（300 U / L）* |
| 4 | 117 4氯化钠，氯化钾，10 HEPES，1 KH 2 PO 4，4的NaHCO 3，1.7的MgCl 2，10葡萄糖，CaCl 2的 0.2 +0.8克/ L的胶原酶类型2（300 U /升）* + BSA（1克/ L） |
| 5 | 4 117氯化钠，氯化钾，10 HEPES，KH 2 4，4的NaHCO 3，1.7的MgCl 2，10葡萄糖，CaCl 2的 0.5 + BSA（1克/升） |
| 6 | 117氯化钾，氯化钠，4 10 HEPES，KH 2 PO 4，4的NaHCO 3，1.7的MgCl 2，10葡萄糖，CaCl 2的 1.0 + BSA（1克/升） |
表1中。隔离解决方案。时平衡与Carbogen增（95％O 2，5％CO 2）10分钟，在37℃，pH = 7.4的氢氧化钠（NaOH）。 *活动可能取决于批号的胶原酶活性，所以以前的测试。
图1左上：模范心室心肌细胞染色与DAPI（核，蓝）和Alexa面粉488鬼笔环肽（α-辅肌动蛋白，绿色）。 右上的典型痕迹全细胞膜片钳记录。 左下：作为心房心肌细胞染色，DAPI（核，蓝）和荧光标记的鬼笔环肽（α-辅肌动蛋白，绿色）。 右下：全细胞膜片钳记录的典型痕迹。
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Discussion
随着越来越多的发展遗传工程小鼠心脏功能和心肌病变相关的基因缺失株的研究也有一个专门的方法来研究在体外的特定基因缺失的影响越来越大的兴趣。在我们的实验室中，我们研究一个家庭的钾通道附属亚基对心肌复极的角色。的KCNE基因包括一个家庭的5个基因（KCNE1 - 5），发挥重要的作用在人的心室和心房复极11，15。KCNEs是一个跨膜域千伏通道辅助亚基，可以不通过任何钾电流对自己的，但他们可以与Kv通道α亚单位形成复合物，并调节其功能特性，如细胞内的门控，导学，药理学和贩运显着。在KCNE2的突变，共同多态性例如与继承和收购形式Øf为长QT综合征（LQTS），16。
的先驱工作在分离及电生理特性的不同Kv通道α亚单位对大鼠和所作出的贡献，但也已经做了小鼠心室和心房复极的博士Nerbonne组在圣路易斯华盛顿大学在20世纪90年代3，5， 7。然而，显着少被称为心房和心室复极有关的贡献Kv通道附属亚基内的啮齿动物心肌。KCNEs主要研究了在异源表达系统中，如CHO细胞和爪蟾卵母细胞。已经示出了使用这些方法KCNE亚基高度混杂在形成异聚的Kv通道复合物的识别的范围内的不同的Kv通道α亚基作为KCNEs 10的潜在的合作伙伴。但是，我们不能确定是否这些特定的异源钾通道补的XES也出现在本机的心肌细胞或所观察到的异源KCNE Kv通道α亚基的伙伴关系是异源表达文物1。因此，我们采用的隔离技术和Kv通道记录协议从Nerbonne实验室和修改他们的指示在解剖不同的Kv通道控制KCNE基因在小鼠复极，这是本文的协议部分。使用这种方法，我们最近发现的钾通道附属亚基KCNE2控制两个不同的的Kv电流在对小鼠心室肌（I Kslow，1和I，F）。通过应用不同的钾离子通道的特异性抑制剂，我们是能显示小鼠KCNE2基因的缺失会导致显着的减少Kv1.5和非洲爪蟾卵母细胞上表达的Kv4.2通道电流14。调节KV1.5 KCNE2以前不知道，磨片私人轿车调节非洲爪蟾卵母细胞上表达的Kv4.2通道KCNE2已经被证明在体外异源表达研究20。
心房纤维性颤动（AF）是最常见的持续性心律失常在临床实践中具有显着的发病率和死亡率4。突变最近已与所有不同的KCNEs中的AF在人类身上。最近，有两个非同义突变被发现在KCNE1房颤患者，不存在对照组（欧莱森等人 ，2012）。机械地，异源表达研究确定了有可能的潜在机制KCNQ1电流增益功能的影响。此外，最近，它表明，KCNE1 - / -小鼠患有自发性发作的阵发性AF 17。在孤立性房颤，杨等人的研究，评估28个不相关的中国家庭。确定的突变KCNE2这导致在一个精氨酸-半胱氨酸取代（R27C）。功能分析的突变通道在异源表达的研究发现KCNQ1通道（I Ks）的18的增益功能的影响。然而，KCNE2也可以形成复合物与一系列的其他Kv通道α-亚单位，包括KV1.5，这也被牵连在AF。我们最近的研究表明KCNE2可以调节KV1.5电流的小鼠心室导致的延续，在小鼠的心室APD 15。因此，KCNE2功能障碍的心房KV1.5电流中断，也可以代表我们KCNE2 AF基础心律失常的机制- / -小鼠模型和/或窝藏突变在KCNE2痛苦从AF患者。 KCNE3突变也于近日确定在家族性房颤患者8。电生理记录显示增量的ASED活动的Kv4.3/KCNE3和Kv11.1/KCNE3产生电流的突变，从而赋予易感性的基因突变携带者，更快的心肌动作电位复极，从而在心房重入小波的脆弱性。然而KCNE3 V17M突变尽管事实上，并无起KCNE3/KCNQ1电流KCNE3形式配合KCNQ1在心肌功能。此外，KCNE3最近被证明是上调在人口与瓣膜AF支持这一假设，KCNE3扮演的角色，不仅在家族性房颤，但也瓣膜AF 6。最近，一个单核苷酸多态性（G / T）被确定在KCNE4导致在一个谷氨酸（Glu，E）/天冬氨酸（Asp，D）的取代的KCNE4肽19位的145。后续功能的多态性分析表明，KCNE4多态性KCNQ1通道9施加影响的“增益功能”。同样，这些研究进行了异源表达系统，并从本地的心肌细胞的实验证据仍然缺乏。最近，一个孤立的情况下，AF的错义突变（L65F）非家族已发现的158例患者与AF 12日在丹麦队列。此外，在KCNE5多态性（C97T）被确定在同一个研究人口，这是一个高风险的发展AF 13。两个突变体与β-亚基（KCNE2和KCNE5），KCNQ1通道的相互作用产生了增加IKs通道电流增益功能的影响。 IKs通道信道的KCNQ1α-亚基可与β-亚基（KCNE1 5）中任一项的5配件相关联。因此KCNQ1似乎是一个可能的候选α-亚基伴侣搜索的分子基板时，我n的发病的KCNE相关的自动对焦。然而，由于明显的滥交KCNE亚基其他分子的目标是可能的，因此，我们打算专门调查这些的可能KCNE / KVα-亚基相互作用。因此，在我们的实验室研究目前还旨在阐明KCNE相关AF背后的机制，利用我们在本文中描述的技术-隔离的小鼠心房心肌细胞，并随后在体外的电生理记录与应用程序的专一性抑制剂不同的Kv通道α亚单位和本地KCNEx基因敲除小鼠心肌细胞的生化分析。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由德意志研究联合会（DFG），弗里茨·蒂森基金会和查理特/ MDC补助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrodotoxin | Alomone | ||
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals | ||
| Heteropodatoxin 2 | Alomone | ||
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington |
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