Summary
Dysfonctionnement des canaux Kv est associée à des arythmies cardiaques. Afin d'étudier les mécanismes moléculaires qui conduisent à des arythmies telles que nous utilisons un protocole systématique pour l'isolement des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires chez des souris knock-out canaux Kv auxiliaires sous-unités. Cardiomyocytes isolés peuvent alors être immédiatement utilisé pour les études électrophysiologiques cellulaires, biochimiques ou immunofluorescence (IF) essais.
Abstract
Gènes codent KCNE pour une petite famille de sous-unités de canaux Kv auxiliaires qui forment des complexes avec des sous-unités hétéromériques Kv canal alpha de modifier leurs propriétés fonctionnelles. Des mutations dans les gènes KCNE ont été trouvés chez les patients souffrant d'arythmies cardiaques telles que le syndrome du QT long et / ou la fibrillation auriculaire. Cependant, la physiopathologie moléculaire précise qui mène à ces maladies reste insaisissable. Dans des études précédentes, les propriétés électrophysiologiques de la maladie provoquant des mutations dans ces gènes ont surtout été étudiée dans des systèmes d'expression hétérologues et nous ne pouvons pas être sûr si les effets rapportés peuvent être directement traduits en cardiomyocytes natifs. Dans notre laboratoire, nous utilisons donc une approche différente. Nous étudier directement les effets de la délétion du gène KCNE dans les cardiomyocytes isolés de souris knock-out par électrophysiologie cellulaire - une technique unique que nous décrivons dans ce numéro de la Revue des expériences visualisées. Les cœurs de geneticasouris KCNE lly modifiées sont rapidement excisé et monté sur un appareil de Langendorff par canulation aortique. Ca 2 + libre dans le myocarde est lié par l'EGTA, et la dissociation des myocytes cardiaques est alors réalisée par perfusion rétrograde des artères coronaires avec un faible spécialisée Ca 2 + tampon contenant de la collagénase. Atria, paroi libre du ventricule droit et le ventricule gauche peut alors être séparés par des techniques de microchirurgie. Le calcium est ensuite ajouté lentement vers les cardiomyocytes isolés dans une étape multiple comprenant procédure de lavage. Cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires d'apparence saine sans contractions spontanées sont alors immédiatement soumis à des analyses électrophysiologiques par la technique de patch-clamp ou d'autres analyses biochimiques au cours des 6 premières heures qui suivent l'isolement.
Protocol
1. L'anesthésie des animaux et des prélèvements d'organes
- Anesthésier la souris par voie intrapéritonéale (ip) d'injection de kétamine (200 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (20 mg / kg de poids corporel).
- Pour anticoagulation injecter 250 UI d'héparine ip pour éviter la formation de thrombus et la coagulation du sang.
- Attendre jusqu'à ce que la narcose profonde est atteinte, qui est caractérisé par une aréflexie. Pour vérifier les réflexes de test aréflexie, la cornée par un léger toucher la cornée ou réflexe vol d'essai par pincement de la queue.
- Transférer la souris sur table d'opération et le fixer en position couchée.
- Inciser la peau et la paroi abdominale au-dessous de l'appendice xiphoïde et effectuer une thoracotomie preneuse: étendre la coupe de part et d'autre le long de l'arc costal et ensuite couper nervures dans la ligne axillaire médiane, dévier vers le haut la cage thoracique.
- Ouvrez le péricarde, localiser gros vaisseaux. Appuyez doucement sur caudale cœur pour mieux afficher l'aorte. Serrer l'aorte aide d'une pince.
- Placer le coeur dans la concavité d'une paire de s ciseaux et disséquer tous les navires de connexion avec une seule coupe. Assurez-vous de conserver une partie assez grande de l'aorte ascendante pour la ponction de Langendorff.
- Transfert cœur excisé immédiatement à une boîte de Pétri remplie de glace froide et pré-oxygéné solution 1 (pour les solutions, voir le tableau 1).
2. Préparation de la perfusion cardiaque et Langendorff
- Cathétériser l'aorte avec une canule en acier 1.8F. Assurez-vous d'éviter une embolie gazeuse.
- Fixer l'aorte sur la canule avec une suture chirurgicale et coronaires rincer avec 1 ml de solution à 1.
- Connectez canule avec un appareil de Langendorff.
- Assurez-vous que le temps d'une thoracotomie pour canulation Langendorff ne dépasse pas 120 secondes pour éviter prolongée d'ischémie / reperfusion du myocarde.
- Coeur perfuse avec 10 ml de solution de Ca 2 + libre 2 (4 ml / min).
- Coeur perfuser avec une solution de collagénase 3 pour 8 min (4 ml / min).
- Coeur de transfert dans un préchauffé à 100 mm boîte de Pétri contenant une faible solution de Ca 2 + 4.
- Retirez délicatement l'aorte et d'autres non cardiaque tissu avec des ciseaux et jetez-le.
- Oreillettes et les ventricules séparés et continuent à chaque chambre séparément. Gardez les cellules immergées dans la solution 4. Utilisez de petits volumes (moins de 5 ml).
4. La dissociation des cardiomyocytes plus
- Cardiomyocytes auriculaires:
- Pour individualiser les cardiomyocytes auriculaires transférer les oreillettes dans un séparé préchauffé boîte de culture de 100 mm et dissocier le tissu à travers le tirant doucement à part avec une pince fine. Veiller à une dissociation presque complète du tissu.
- Utiliser une pipette de 1 ml avec un plus polie au feu embout de pipette en plastique pour suspendre les cellules dans 1 ml de solution à 5 pendant 5 min.
- Séparer les cellules de débris à l'aide d'un filtre de cellules (200 um de maille). <li> Ajouter 5 ml de solution 5 à la suspension de cellules et centrifuger 2 min à 16 xg à température ambiante.
- Les étapes suivantes sont conduites sous une hotte de culture cellulaire. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml de solution à 6.
- Après sédimentation par gravité pendant 10 min dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 1 min à 16 xg à température ambiante. Enlever le surnageant. Remettre en suspension les cellules en fonction de leur quantité dans 1-5 ml de solution à 6.
- Disséquer la région du ventricule gauche d'intérêt avec une pince fine dans 5 ml de la solution 4.
- Suspendre les cellules en pipetant doucement jusqu'à ce que la plupart des cellules sont séparées. Transférer la solution cellule après filtrage (200 maillage um) dans un tube de 50 ml, ajouter un volume de 25 ml.
- Centrifuger pendant 2 minutes à 16 xg à température ambiante.
- Les étapes suivantes sont conduites sous une hotte de culture cellulaire. Retirer le surnageant, remettre en suspension le culot dans 25 ml d'6 solution et de permettre une sédimentation des cellules pendant 10 min.
- Compter les cellules et éliminer le surnageant, ajouter 25 à 50 ml de solution 6 sur les cellules.
5. Préparation des cardiomyocytes pour cellulaire électrophysiologie, biochimie ou si les études
- Pour les études d'électrophysiologie, garder les myocytes en solution à 6 dans un tube de 50 ml et empêcher la sédimentation.
- Pour les études biochimiques, d'imagerie de calcium, par exemple, les myocytes plaque sur la laminine plat recouvert de culture cellulaire (concentration finale 20 pg / ml de laminine dans du PBS).
- Pour immunofluorescence préparer une plaque de culture cellulaire plat avec des lamelles de verre et enduit avec une solution de laminine (concentration finale de 50 pg / ml de laminine dans du PBS).
- Retirer la solution avant de myocytes de placage. Plaque les cellules et contrôler la densité de cellules à l'aide d'un microscope.
- Laissez les myocytes adhérer à lamelle pendant 1 heure à 37 ° C dans 2% de CO 2, enlever la solutionet à lancer immédiatement un protocole procédure de coloration standard.
- Incuber avec un fixateur, par exemple 4% de PFA dans du PBS (pH 7,5) pendant 10 min à température ambiante et de suivre avec PBS trois étapes de lavage pour 5 min chacun.
- Pour perméabiliser les cellules et d'inhiber la liaison non spécifique d'anticorps incuber les myocytes avec 10% de sérum, Triton 0,3%, BSA 0,2% dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Incuber avec l'anticorps primaire pendant 1 heure à 37 ° C et laver comme indiqué auparavant.
- Incuber avec l'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante. Pour contre-coloration des noyaux et l'utilisation α-actinine fluorochrome DAPI et phalloïdine conjugué (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
- Après le lavage, transférer le couvercle en verre glisse prudemment sur des lames de microscope silane traitées et les cellules embed dans un milieu de montage fluorescence.
6. Electrophysiologie cellulaire
- Effectuer cellules entières patch-clamp sur la fréquenceshly isolé cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires à la température ambiante.
- Transférer en bonne santé cardiomyocytes apparaissant dans la chambre de perfusion remplie d'un volume défini de solution de bain extracellulaire. 117 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, 1,7 mM MgCl 2, 3 mM de CoCl 2, 10 mM HEPES, 10 mM de glucose et 0,02 mM tétrodotoxine (TTX), (pH 7,4) . Utilisez NaOH pour ajuster le pH.
- Utiliser un matériel de patch-clamp (c.-à-IX71 microscope inversé, un amplificateur Multiclamp 700B, un système d'acquisition Digidata 1440A et PC avec le logiciel pClamp10.3 (Molecular Devices)).
- N'utiliser que des pipettes de patch avec des résistances de 3-5 MQ quand il est rempli avec une solution intracellulaire contenant 130 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 11 mM HEPES, 11 mM d'EGTA 5 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na 2 GTP, 5 mM Na 2 CP et 4,9 mM de CaCl 2 (pH 7,2). Utilisez KOH pour l'ajustement du pH.
- Evoke courants K + vers l'extérieur duescaliers du ring tension de 4,5 sec pour tester des potentiels compris entre -60 et +50 mV à 10 mV par incréments de-un potentiel de maintien de -70 mV après un intervalle de 20 ms à -40 mV prepulse.
- Assurez-vous que les courants de fuite sont toujours <100 pA.
- Pour la dissection de K + différents courants utiliser des inhibiteurs spécifiques tels que le 4-aminopyridine (4-AP, ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) ou tétraéthylammonium (TEA; Sigma). Les solutions mères doivent être préparés en solution de bain extracellulaire, et appliqué directement sur le voisinage le plus proche possible de la cellule via une micropointe après «de base» des enregistrements. L'équilibrage devraient être autorisés pendant 2-3 min avant «drogue» des enregistrements.
- Pour l'analyse de normaliser les amplitudes de courant dans des cellules individuelles à la taille des cellules (capacitance de la membrane de cellule entière). Analyser les données hors connexion en utilisant le logiciel pClamp10.3 (Molecular Devices) ou un logiciel comparable.
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Representative Results
Isolement des adultes cardiomyocytes murins de souris génétiquement modifiées pour étudier la fonction des gènes spécifiques d'intérêt in vitro est devenue un outil puissant pour mieux comprendre la physiopathologie cardiaque. Cette méthode est actuellement utilisée par un nombre faible mais croissant de laboratoires de sciences fondamentales à travers le monde. Cependant, l'isolement des cardiomyocytes ventriculaires adultes murines peut être difficile et doit être fait avec soin et de façon répétitive par des mains expertes. La figure 1 montre les cardiomyocytes fraîchement isolés exemplaires auriculaires et ventriculaires. Pour cardiomyocytes ventriculaires nous vous recommandons d'utiliser uniquement en forme de bâtonnets, les myocytes ventriculaires striés d'apparence saine sans contractions spontanées. En comparaison avec les myocytes ventriculaires, myocytes auriculaires sont plus courtes et plus minces. La striation caractéristique et en forme de tige de cardiomyocytes ventriculaires qui manque dans les cardiomyocytes auriculaires adultes murines. Le rendement des cardiomyocytes ventriculaires isoléesà partir d'un cœur de souris intacte est 5x10 5 - 1x10 6. Pour les cardiomyocytes auriculaires il est beaucoup moins. Nous nous attendons généralement à isoler environ 5 - 25.000 cellules auriculaires partir d'un cœur de souris. Une fois isolés, les cardiomyocytes peuvent être soumis à différentes techniques in vitro, y compris des enregistrements électrophysiologiques (figure 1). Nous vous recommandons d'utiliser les cardiomyocytes isolés dans les 6 premières heures après l'isolement. Figure 1 montre les enregistrements exemplaires canaux Kv vers l'extérieur (à droite) de cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires provoquées par étapes dépolarisation par différentes cellules entières technique du patch clamp. La forme caractéristique du ventricule adulte murin et le canal auriculaire Kv repolarisation courants peut être vu sur un parcours de temps défini (ici 4 sec, figure 1). S'il vous plaît noter que l'amplitude du courant est nettement plus faible dans murins adultes cardiomyocytes auriculaires par rapport à cardiomyocytes ventriculaires.
| Solution | Table des matières (en mM, s'il n'est pas spécifié différemment) |
| 1 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucose |
| 2 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucose + 229,5 uM EGTA |
| 3 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucose, CaCl 2 0,1 + 0,8 g / L collagénase de type 2 (300 U / L) * |
| 4 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucose, CaCl2 0,2 + 0,8 g / L collagénase de type 2 (300 U / l) * + BSA (1 g / L) |
| 5 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucose, CaCl 2 0,5 + BSA (1 g / L) |
| 6 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucose, CaCl 2 1,0 + BSA (1 g / L) |
Tableau 1. Solutions d'isolation. Équilibré pendant 10 min avec carbogène (95% O 2, 5% de CO 2), à 37 ° C pH = 7,4 (NaOH). * Activité peut dépendre de numéro de lot, des essais de manière précédent de l'activité de la collagénase est recommandé.
Figure 1 En haut à gauche:. Exemplaire teinté cardiomyocytes ventriculaires avec du DAPI (noyaux, bleu) et Alexa Flour 488 Phalloidin (α-actinine, vert) en haut à droite:. Exemplaires des traces de pince cellule patch entierd'enregistrement bas à gauche:.. Exemplaire teinté cardiomyocytes auriculaires avec du DAPI (noyaux, bleu) et fluorochrome Phalloidin conjugué (α-actinine, vert) En bas à droite: des traces exemplaires de l'enregistrement pince cellule entière patch.
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Discussion
Avec le développement croissant de souches de souris génétiquement modifiées pour étudier la fonction cardiaque et une pathologie cardiaque liée à la délétion du gène il ya aussi un intérêt croissant pour les méthodes spécialisées pour étudier les effets de la délétion du gène spécifique in vitro. Dans notre laboratoire, nous étudions le rôle d'une famille de sous-unités de canaux Kv auxiliaires sur la repolarisation cardiaque. Les gènes KCNE comprennent une famille de 5 gènes (KCNE1-5) qui jouent des rôles importants dans ventriculaire humaine et la repolarisation auriculaire 11, 15. KCNEs sont simples transmembranaires domaine Kv sous-unités de canaux auxiliaires qui ne peuvent pas passer les courants potassiques de leur propre chef, mais ils peuvent former des complexes avec des sous-unités alpha de canaux Kv et de moduler leurs propriétés fonctionnelles telles que déclenchement, la conductance, de la pharmacologie et de la traite au sein de la cellule de manière significative. Des mutations et des polymorphismes communs dans KCNE2 par exemple, sont associés à des formes héréditaires et acquis of le syndrome du QT long (SQTL) 1, 16.
Travail de pionnier dans l'isolement et la caractérisation électrophysiologique des sous-unités alpha de canaux Kv différents et leur contribution à rat, mais aussi ventriculaire et la repolarisation auriculaire murin a été fait par le groupe du Dr Nerbonne à l'Université Washington de Saint-Louis dans les années 1990 3, 5, 7. Toutefois, beaucoup moins de données sur la contribution des sous-unités de canaux Kv auxiliaires à la repolarisation ventriculaire et auriculaire dans le myocarde contre les rongeurs. KCNEs ont été principalement étudiés dans des systèmes d'expression hétérologues telles que des cellules CHO et ovocytes de Xenopus laevis. L'utilisation de ces méthodes sous-unités KCNE ont été montré pour être très promiscuité dans la formation de complexes de canaux Kv hétéromériques identifier une gamme de sous-unités alpha de canaux Kv différents en tant que partenaires potentiels pour KCNEs 10. Cependant, nous ne pouvons pas savoir avec certitude si ces spécificités hétéromère Kv canal compléxes également se produire dans les cardiomyocytes natifs ou si les hétéromériques observées KCNE Kv partenariats de distribution sous-unité alpha 1 sont hétérologues artefacts d'expression. Nous avons donc adopté la technique d'isolement et de protocoles Kv d'enregistrement de canal du laboratoire Nerbonne et modifié les comme indiqué dans la section du protocole de cet article à disséquer les différents canaux Kv dans la repolarisation murin, qui sont contrôlés par des gènes KCNE. En utilisant cette approche, nous avons récemment constaté que le Kv voie ancillaire sous-unité KCNE2 contrôle deux courants distincts dans le Kv murin myocarde ventriculaire (Kslow I, 1 et I, f). En application des inhibiteurs spécifiques pour les différents canaux potassiques, nous avons pu montrer que la délétion du gène murin KCNE2 entraîne une réduction significative dans les deux Kv1.5 Kv4.2 et courants 14. Règlement de Kv1.5 par KCNE2 n'était pas connue auparavant, WHEréglementation reas de Kv4.2 par KCNE2 a déjà été démontrée in vitro par des études d'expression hétérologues 20.
La fibrillation auriculaire (FA) est l'arythmie la plus fréquente soutenue dans la pratique clinique et est associée à une morbidité significative et 4 de la mortalité. Des mutations dans tous les KCNEs différents ont récemment été associés à la FA chez les humains. Récemment, deux mutations non synonymes ont été trouvés dans KCNE1 chez les patients atteints de fibrillation auriculaire qui n'étaient pas présents dans le groupe témoin (Olesen et al., 2012). Mécaniste, les études d'expression hétérologues a identifié un effet de gain-de-fonction dans KCNQ1 courants que le mécanisme probable sous-jacent. En outre, il a été récemment montré que KCNE1 - / - souris souffrent d'épisodes spontanés de la FA paroxystique 17. Dans une étude évaluant 28 sans lien avec les familles chinoises AF seul, Yang et al. ont identifié une mutation dans KCNE2,qui conduit à une substitution d'arginine-à-cystéine (R27C). L'analyse fonctionnelle du canal mutant dans les études d'expression hétérologues a révélé un effet de gain-de-fonction sur KCNQ1 canaux (I Ks) 18. Cependant, KCNE2 peuvent également former des complexes avec une gamme d'autres canaux Kv sous-unités α, y compris Kv1.5, qui a également été impliquée dans la FA. Nous avons récemment montré que KCNE2 peuvent moduler les courants Kv1.5 dans le ventricule murin conduit à un allongement de l'APD ventriculaire chez la souris 15. Par conséquent, la perturbation des courants Kv1.5 auriculaire par un dysfonctionnement KCNE2 pourrait également représenter le mécanisme sous-jacent arythmogène de la FA dans notre KCNE2 - / - modèle de souris et / ou chez les patients porteurs de mutation dans KCNE2 souffrant de fibrillation auriculaire. Des mutations dans KCNE3 ont également été récemment identifiée chez un patient atteint familiale AF 8. Des enregistrements électrophysiologiques ont révélé un incrémentASED activité de Kv4.3/KCNE3 et Kv11.1/KCNE3 généré par les courants de la mutation, ce qui confère une sensibilité de porteurs de la mutation de la repolarisation cardiaque potentiel d'action plus rapide et donc la vulnérabilité aux rentrantes ondelettes dans les oreillettes. La mutation faux-sens KCNE3 V17M mais n'a eu aucun effet KCNE3/KCNQ1 courants malgré le fait que KCNE3 formes complexes fonctionnels avec KCNQ1 dans le myocarde. En outre, KCNE3 a été récemment démontré être régulée positivement dans une population humaine à valvulaire AF soutenant l'hypothèse que KCNE3 joue un rôle non seulement dans fibrillation auriculaire familiale mais aussi valvulaire AF 6. Récemment, un polymorphisme de nucléotide unique (G / T) a été identifiée dans KCNE4 résultant en un acide glutamique (Glu, E) / acide aspartique (Asp, D) substitution à la position 145 du peptide KCNE4 19. Après analyse fonctionnelle de ce polymorphisme révélé que le polymorphisme KCNE4exerce l'effet de «gain de fonction» sur les canaux KCNQ1 9. Encore une fois, ces études ont été menées dans des systèmes d'expression hétérologues et les données expérimentales de cardiomyocytes natifs fait encore défaut. Plus récemment, un cas isolé non familiale cas d'AF avec un faux-sens (L65F) mutation a été identifiée dans une cohorte danoise de 158 patients atteints de FA 12. Par ailleurs, un polymorphisme dans KCNE5 (C97T) a été identifié dans la même population d'étude, qui a été associée à un risque plus élevé de développer une FA 13. L'interaction de deux sous-unités β mutant (KCNE2 et KCNE5) avec le canal KCNQ1 produit un effet de gain-de-fonction de l'accroissement des courants Iks. Le KCNQ1 α-sous-unité du canal IKs peut associer à l'une quelconque des l'accessoire cinq sous-unités β-(KCNE1-5). Par conséquent KCNQ1 semble être un candidat probable α-unité partenaire si vous recherchez un substrat moléculaire in la pathogenèse de KCNE associée à la FA. Toutefois, étant donné la promiscuité prononcé de sous-unités KCNE autres cibles moléculaires sont possibles et nous avons donc l'intention d'enquêter sur ces éventuelles spécifiquement KCNE / Kv sous-unité alpha interactions. Les études dans notre laboratoire sont donc aussi actuellement vise à élucider les mécanismes sous-jacents KCNE associée AF en utilisant la technique que nous décrivons dans cet article - l'isolement des cardiomyocytes auriculaires murins et ultérieures des enregistrements électrophysiologiques in vitro avec l'application d'inhibiteurs spécifiques de différents sous-unités alpha de canaux Kv et analyses biochimiques des cardiomyocytes natifs de souris knock-out KCNEx.
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Disclosures
Nous n'avons rien à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung et la Charité / MDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrodotoxin | Alomone | ||
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals | ||
| Heteropodatoxin 2 | Alomone | ||
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington |
References
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