Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Summary

Imagerie time-lapse est utilisé pour évaluer le comportement des principaux pré-néoplasiques des cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de risque de cancer du sein afin de déterminer s'il existe des corrélations entre certains paramètres comportementaux et génétiques distinctes des lésions.

Abstract

En accéléré d'imagerie peut être utilisé pour comparer le comportement de culture primaire des cellules épithéliales mammaires néoplasiques provenant de différents modèles de souris transgéniques de cancer du sein. Par exemple, le temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules), le nombre de cellules apoptotiques, l'évolution des changements morphologiques, et le mécanisme de formation de colonies peuvent être quantifiés et comparés dans les cellules portant lésions génétiques spécifiques. Primaires de cellules épithéliales mammaires cultures sont produites par les glandes mammaires sans tumeur palpable. Glandes sont soigneusement réséquée avec une séparation claire de muscle adjacent, les ganglions lymphatiques sont enlevés, et les suspensions monocellulaires de cellules épithéliales mammaires enrichis sont générées par hachage tissu mammaire suivie par dissociation enzymatique et filtration. Simple suspensions de cellules sont ensemencées et placé directement sous un microscope dans une chambre d'incubation pour imagerie des cellules vivantes. Seize 650 um um champs x 700 dans une configuration 4x4 de chaque well d'une plaque à 6 puits sont imagés toutes les 15 minutes pendant 5 jours. Time-lapse images sont directement examinés pour mesurer les comportements cellulaires qui peuvent inclure des mécanismes et la fréquence de la formation de colonies de cellules dans les 24 premières heures d'étalement des cellules (agrégation contre la prolifération des cellules), l'incidence de l'apoptose, et l'échelonnement des changements morphologiques. Une seule cellule de suivi est utilisé pour générer des cartes du destin cellulaire pour la mesure de la durée de vie des cellules individuelles et les enquêtes sur les modèles de division cellulaire. Les données quantitatives sont analysées statistiquement pour évaluer des différences significatives dans le comportement en corrélation avec lésions génétiques spécifiques.

Introduction

Modèles de souris génétiquement modifiées sont des outils pour étudier et comprendre comment les différentes lésions génétiques augmentent le risque de développer un cancer du sein. Par exemple, des souris génétiquement modifiées ont montré que la combinaison de trois facteurs: la perte de la poitrine pleine longueur cancer 1, l'apparition précoce (BRCA1) de gènes dans les cellules épithéliales mammaires, la protéine p53 de tumeur (TP53) haplo-insuffisance de la lignée germinale, et épithéliales mammaires cellule ciblée régulation à la hausse alpha récepteurs d'œstrogènes résultats d'expression (EER) dans le développement du cancer mammaire chez 100% des Brca1 ^{floxé (f) Virus 11/f11/Mouse tumeur mammaire (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tétracycline transactivateur (RTTA} souris par âge de 12 mois par rapport aux pourcentages inférieurs rapportés dans Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + /} - souris sans ERa sur-expression (~ 50 - 60%) et les souris BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} sans TP53 haploinsufcacité (<5%). ¹

Dynamique imagerie time-lapse de la conduite de pré-néoplasiques primaires cellules épithéliales mammaires révèle des différences dans le comportement des cellules qui sont moins facilement apprécié dans des coupes de tissus statiques. Modifications dans la prolifération et la différenciation sont observées dans les cellules mammaires primaires de l'homme porteuses d'une mutation du gène BRCA1. ² Création d'une seule cellule suspensions primaires de cellules épithéliales mammaires à la normale et des souris génétiquement modifiées sont générés par dissociation enzymatique du tissu réséqué glande mammaire. ³ Time-lapse les images sont vues à évaluer mécanisme de synchronisation et de l'apparence colonie de cellules et l'incidence des modifications morphologiques dans les cellules y compris transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et l'apoptose. Génération de cartes du destin cellulaire, la quantification de la longueur de temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules), et la détermination des modes de division cellulaire sont facilitées par l'utilisation d'une seule cellule de suivi. TimmOutil de suivi de l '(TTT) est un logiciel disponible publiquement utilisé pour générer des cartes destin unicellulaires. Son utilité dans la compréhension des mécanismes de destin cellulaire a été établi ^4,5 examiner le développement normal de cellules souches hématopoïétiques ^6-9 et la génération de neurones. ¹⁰

Protocol

1. Schéma général

1. Générer des cultures primaires de cellules épithéliales mammaires précancéreuses de glandes mammaires de génie génétique et de contrôler souris de type sauvage.
2. Capturez cellules vivantes images toutes les 15 min en utilisant un logiciel d'acquisition d'image Volocity (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) pour un maximum de 5 jours.
3. Voir le time-lapse images directement pour évaluer le calendrier et le mécanisme de la formation de colonies de cellules épithéliales, l'incidence de l'apoptose, et l'échelonnement des changements morphologiques.
4. Autre Volocity généré. Piles TIFF. Fichiers JPG l'aide d'Automation Microscopie MetaMorph et logiciels d'analyse d'images (Molecular Devices, Sunnyvale, CA LLC) et renommer des fichiers d'images numériques (THE Rename 2.1.6, http://www.softpedia.com/get / Système / Fichier-Gestion / LA Rename.shtml- ) pour permettre la compatibilité avec les logiciels Timm outil de suivi (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
5. Utiliser TTT, de générer des cartes du destin cellulaire pour la détermination du temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules) et les modèles de la division cellulaire (symétrique par rapport asymétrique).
6. Analyser les données quantitatives des étapes 3 et 5 ci-dessus afin de déterminer s'il existe des différences statistiquement significatives entre les différents modèles de souris génétiquement modifiées et / ou de type sauvage contrôles.

2. Génération des primaires cultures de cellules épithéliales mammaires

1. Préparer les médias complètes pour l'isolement de simples cellules épithéliales mammaires suite à une variation d'instructions du fabricant (EpiCult-B Kit Souris moyen, StemCell Technologies, Vancouver, Colombie-Britannique). Mélanger 450 ml Epi-Cult-B moyenne, 50 ml Epi-Cult B prolifération supplément, 5% de sérum fœtal bovin (FBS), 50 ug / ml de pénicilline / streptomycine (PenStrep) et 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF).
2. Préparer dissociation des médias en combinant 1 partie d'un 10x collagénase / hyaluronidase mélange avec 9 parties complètes de médias 2.1.
3. Euthanasier souris et procéder immédiatement à une autopsie. Placer la souris sur le dos sur une plate-forme autopsie mousse de polystyrène et de sécuriser les quatre membres pour une peau ventrale est tendue. Saturer la peau ventrale et les cheveux, y compris celle recouvrant les jambes, avec de l'éthanol à 70%. Exposer # 2/3 (thoracique) et n ° 4/5 (inguinal) des glandes mammaires en faisant une incision médiane à travers la peau (ne pas entrer dans le péritoine) qui se prolonge dans un Y-incision à travers la peau médiale de chaque membre antérieur et une incision à l'envers Y à travers la peau médiale de chaque patte arrière.
4. Utilisation dissection, séparer la peau de underlyingperitoneum, tirez sur les deux côtés de la peau jusqu'à ce qu'elle soit bien tendue, et le fixer à la plate-forme autopsie polystyrène en utilisant des épingles. A partir de la face externe, utilisez dissection avec une utilisation judicieuse des dissection ciseaux pour isoler le inguinal intact et / ou thoraciques glandes mammaires de tissu conjonctif sous-jacent et le muscle. Placer pas plus de deux glandes mammaires d'un 10 cm boîte de Petri stérile et à déplacer le capot de culture tissulaire.
5. En hotte de culture de tissus, d'examiner les glandes mammaires pour les ganglions lymphatiques qui sont identifiés comme de petits nodules bien circonscrites avec une couleur jaunâtre. Enlever les ganglions lymphatiques de la glande qui entoure l'utilisation scalpel stérile et une pince. Mince tissu mammaire dans ~ 1 mm ³ cubes en utilisant deux scalpels stériles, un dans chaque main.
6. Lieu hachée tissu mammaire dans 5 ml de dissociation des médias, mélanger doucement par pipetage de haut en bas 2-3 fois à l'aide d'une pipette de 10 ml et incuber pendant la nuit (jusqu'à ~ 16 h) dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO ₂ dans un 50 ml avec bouchon tube conique desserré.
7. Le lendemain matin, préparer un mélange froid de la solution 1 partie «saline équilibrée de Hanks (HBSS) contenant 2% de FBS et 4 parties une solution tamponnée de chlorure d'ammonium à promouvoir rouge blla lyse des cellules ood (HFAmCl) ainsi que HBSS froid additionné de 2% de FBS (HF). Préchauffer trypsine-EDTA (0,25%), 5 mg / ml dans une solution de dispase saline équilibrée de Hank jour, 1 mg / ml de DNase I et Media complètes.
8. Retirer le tube de centrifugation conique avec le tissu mammaire de l'incubateur et doucement impulsion tourbillonnaire 2-3 Sec deux fois. Centrifuger le tube à 450 g pendant 5 min (température ambiante ou à 4 ° C) et jeter le surnageant.
9. Remettre en suspension le culot dans un minimum de 10 ml HFAmCl et centrifuger à 450 g pendant 5 min (température ambiante ou à 4 ° C) et éliminer le surnageant.
10. Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA au culot et mélanger d'abord avec une pipette de 5 ml, puis avec une micropipette P1000 jusqu'à filandreuse (1-3 min). Ajouter 10 ml de HF, centrifuger à 450 × g pendant 5 min (température ambiante ou à 4 ° C) et éliminer le surnageant.
11. Ajouter 2 ml de 5 mg / ml Dispase et 200 pi de 1 mg / ml de DNase I au culot et mélanger avec une micropipette P1000 pendant 1 min. L'échantillon doit être cloudy mais pas filandreuse. Si filandreux, ajouter 100 ul de DNase I et mélanger à nouveau.
12. Ajouter 10 ml HF à froid, de la souche à travers une passoire cellule 40 um et centrifuger à 450 g pendant 5 min (température ambiante ou à 4 ° C) et éliminer le surnageant.
13. Remettre en suspension le culot final dans les médias complètes. Quantifier le nombre total de cellules (à l'aide d'un hémocytomètre ou un compteur Coulter). Deux glandes mammaires obtenir environ 1 x 10 ⁶ à 1 x 10 ⁷ cellules. Plate cellules primaires épithéliales dans un fond plat à 6 puits plaque à une densité de 1,5 x 10 ⁵ cellules par puits.

3. Imagerie des cellules vivantes

1. Immédiatement après l'étalement des cellules, placez la plaque à 6 puits en toute sécurité sur une platine de microscope dans un 5% de CO ₂ / saturé humidity/37 ° C chambre d'incubation de la température. Réglez le condenseur pour éclairage de Köhler et le centre des anneaux de phase. Pour les expériences présentées ici, inversé Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc ConfocalSystème de microscope à contraste de phase en mode grand champ avec une lentille d'objectif 10x a été utilisé.
2. Ouvrez le logiciel d'acquisition d'images, créez et nommez une bibliothèque pour les images à intervalles de temps, et enregistrer dans un emplacement avec suffisamment d'espace pour les fichiers volumineux. Les expériences présentées ici utilisé le logiciel d'acquisition d'image Volocity (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
3. Laisser la plaque s'équilibrer dans l'incubateur microscope pour un minimum de 15 minutes. Abaissez les lentilles afin d'éviter les interférences stade-lentille. Dans le cadre du «Stage» rubrique, sélectionnez "Calibrer scène." Réacquérir le plan focal, série Z = zéro dans les points d'imagerie x, y, z onglet et en sélectionnant la marque "Ajouter point" dans le "Stage" rubrique. Points de place dans le milieu de chaque puits de la plaque à 6 puits pour l'imagerie comme l'imagerie à contraste de phase peut être déformé à proximité de la périphérie du puits en plastique. Organiser des points dans un carré de 4 x 4 champs (650 um x 700 um champs), chacune avec un léger chevauchement (environ 5%). Enregistrez les points sélectionnés sous "Stage ».
4. Sous la rubrique «Stage» sélectionnez «Make carte focus" et suivez les instructions pour placer le focus sur chaque point. Définir le calendrier d'acquisition d'image pour capturer 4 photos par heure (toutes les 15 min). Ce peut être ajustée en fonction des besoins spécifiques de l'expérience. Enregistrer la carte sous point "Stage".
5. Faites un clic droit sur l'outil côté "Image Acquisition" right bar et enregistrer les paramètres d'imagerie. Appuyez sur le bouton d'enregistrement pour commencer l'imagerie. Après 1 heure, vérifiez l'orientation des images pour voir si un ajustement est nécessaire.
6. Surveiller et continuer imagerie en temps réel pendant 5 jours, se terminant lorsque les cellules deviennent confluentes.

4. Affichage direct de Time-lapse Images pour évaluer calendrier et le mécanisme de formation initiale des colonies de cellules épithéliales, l'incidence de l'apoptose, et mise en phase de changements morphologiques

1. L'observation directe du time-lapse images peuvent être réaliser en utilisant n'importe quel logiciel de visualisation vidéo compatible (par exemple http:/ / Www.real.com/ realplayer ou autre logiciel freeware ou disponible dans le commerce). Images peuvent être visualisées en format. TIFF à cette étape ou après conversion en fichiers JPG. (Voir étape 5).
2. À déterminer mécanisme de formation de colonies initial, commencer par un empilement d'une seule image représentant une place sur la plaque de formation d'image. Dans les trames initiales, les cellules seront flottante. Suivre images de série pour déterminer si la cellule épithéliale première adhère à la plaque. À cette étape, les cellules épithéliales peuvent être identifiés et différenciés à partir de fibroblastes par leur morphologie cubique plus. Suivez cette seule cellule épithéliale à travers des images en série et suivre son destin sur la suivante 24 h. Notez s'il devient entouré par d'autres cellules épithéliales ou subit la division cellulaire ou l'apoptose. Si entouré par les cellules épithéliales, le mécanisme de formation de colonies peut être déterminée directement en regardant si les cellules environnantes sont dérivées de cellules flottantes qui agrègent ensuite à la cellule initiale adhérent (s) oude division de la cellule initiale adhérente. Notez le nombre de colonies formées par agrégation cellulaire et la division cellulaire au cours des 24 premières heures.
3. Pour déterminer le nombre de cellules initialement adhérentes qui subissent l'apoptose au cours d'une période de temps spécifique, suivez images en série de l'apparition de caractéristiques classiques de l'apoptose en développement dans une cellule qui a été adhérente ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), et le nombre de cellules apoptotiques identifiés au cours de toute la durée de la formation d'image ou dans des délais spécifiques enregistrés.
4. Au fil du temps, les cellules épithéliales en culture de modifier leur morphologie d'une forme cubique initiale à un aspect plus allongé conforme aux EMT. Suivez images en série pour déterminer le jour / heure après le plaquage lorsque cela se produit.

5. Modification du fichier image

1. Renommez les dossiers d'images et de fichiers en fonction des besoins pour le logiciel Timm outil de suivi Utilisez un programme freeware comme LE 2.1.6 Renommer ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) pour renommer les fichiers en groupes. Créer un dossier contenant tous les dossiers et fichiers de l'expérience et nommez le dossier (par exemple,
2. Créer un sous-dossier pour chaque point / position où la culture a été mis en image. Nommez les sous-dossiers: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Le numéro de position doivent avoir 3 chiffres. Exemple: 072511RN_p001. Mettez tous les fichiers image de cette position individuelle dans le sous-dossier.
3. Ajouter le point temporel (avec 5 chiffres) et le numéro de canal (puisqu'il n'y a qu'un seul canal à fond clair, utilisez «0») à la fin de chaque nom de fichier dans ce format:
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. Générer un fichier journal pour chaque poste en téléchargeant d'abord le programme TTTlogfileconverter gratuitement sur le site TTT. Démarrez le programme TTTlogfileconverter et sélectionnez le dossier expérience. Entrez un intervalle d'image (en secondes). Pour une photo prise toutes les 15 minutes, entrez 900 sec. Puis appuyez sur le bouton vert journal clandestin fichiers.

6. Génération de cartes du destin cellulaire des cellules isolées à l'aide TTT

1. Créer un dossier appelé TTTexport et un sous-dossier appelé TTTfiles où toutes les données de suivi de cellules seront stockées selon les instructions du logiciel TTT
2. Démarrez le programme TTT, sélectionnez initiales de l'utilisateur, puis cliquez sur "Continuer".
3. Appuyez sur la touche "Set NAS», sélectionnez l'utilisateur créé "TTTexport" dossier et cliquez sur OK. Dans le navigateur, sélectionnez un dossier expérimentation, sélectionnez un dossier de position, puis appuyez sur "position Charger".
4. Réglez le facteur oculaire à "10x". Chargez le nombre d'images requises (chargement de toutes les images est recommandé pour la première fois).
5. Dans la fenêtre éditeur de cellule, sélectionnez «colonie Nouveau" dans le menu Fichier. Dans la fenêtre Film, appuyez sur la "cellule Track" ou F2 pour commencer à suivre une cellule.
6. Identifier une cellule de la Movie fenêtre et utiliser la souris pour placer le curseur sur la cellule. Un cercle avec le numéro de la cellule doit apparaître après F2 a été cliqué. Utilisez la touche "0" du pavé numérique du clavier pour suivre la mise en place de la cellule et passer à la photo suivante. Déplacez le curseur de suivre la mise en place de chaque cellule dans chaque cadre. Pour supprimer une piste et revenir à l'image précédente appuyez sur "Suppr" sur le pavé numérique. Pour déplacer des cadres avant sans suivre la presse cellule "3", et pour revenir en arrière sans suivi appuyez sur "1" sur le pavé numérique.
7. Pour marquer une division cellulaire cliquez sur la «Division» dans la fenêtre Film. Pour marquer la mort cellulaire cliquez sur le "mort cellulaire" dans la fenêtre Film. Une fois une division s'est produite, les cellules filles peuvent être suivis dans la carte des territoires présomptifs même cellule par un clic droit sur le symbole du cercle de la cellule fille désignée dans la fenêtre de l'éditeur de cellules de commencer à suivre le mode automatique.
8. Appuyez sur F10 pour sauvegarder l'arbre. Chaque arbre permettra d'économiser dans le pli de sortie désignéer (TTTExport). Pour démarrer une nouvelle cellule destinée carte, sélectionnez «colonie de la Nouvelle" sous le menu "Fichier" puis "Ouvrir" dans le menu fenêtre de l'éditeur Cell.
9. Classifier les données de durée de vie des cellules après avoir recueilli de «cellule de données" onglet dans la fenêtre de l'éditeur Cell.

7. Analyses statistiques

1. Utilisez t de Student-test (si on compare deux génotypes) ou ANOVA (si comparant> deux génotypes) afin de déterminer si les différences dans les données paramétriques comme le nombre de colonies de cellules initiales, les durées de vie des cellules ou des heures jusqu'à l'apparition d'EMT entre différents génotypes sont statistiquement significative. Fréquence apoptotique peut être comparé au nombre / nombre total de cellules plaquées à l'aide de Student t-test ou analyse de la variance ou de Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis lorsque calculée comme un pourcentage de cellules adhérentes.
2. Effectuer des tests de puissance en utilisant les données de l'analyse des premières expériences pour déterminer combien expérimental reproduit devez effectuée et cartes du destin cellulaire générée par chaque répétition pour s adéquateSTATISTIQUES pouvoir utiliser freeware disponible (par exemple http://statpages.org/ ). Dans les expériences présentées ici, les cultures cellulaires dérivées de trois souris par génotype étaient suffisantes pour déterminer s'il y avait des différences statistiquement significatives dans la formation de colonies de cellules et la durée de vie des cellules spécifiques lorsque des modifications génétiques ont été faites.

Representative Results

Les cellules épithéliales et fibroblastes peuvent être distingués par la morphologie des cellules. Les cellules épithéliales ont une forme parallélépipédique (figure 1A-B) et forment des colonies de cellules (figure 1A). Fibroblastes, un type de cellules stromales, ont une morphologie allongée (figure 1C).

Les cellules ont été arrondies et flottant à l'apparition de l'imagerie (figure 2A-D). Après la fixation de la plaque plate et ils sont devenus un aspect cubique démontré type (figure 2E, H). En 4 jours de culture la majorité des cellules épithéliales allongées dans une morphologie EMT-like (figure 2I-L). Ce changement est intervenu avec la même chronologie dans tous les génotypes étudiés. Certaines images numériques étaient flous parce éclairage de Köhler et l'alignement anneau de phase n'a pas été réglé correctement (figure 2D, H, L).

Les cellules flottantes développées en cellule individuelle définie colonisation épithélialees de 24 h après étalement (figure 3A, B). L'analyse d'image de série a révélé que ces colonies ont été générés par l'agrégation des cellules plutôt que la division cellulaire. Alors que la perturbation de Brca1 par elle-même ne modifie pas le nombre de colonies formées, plus de TP53 haplo-insuffisance considérablement réduit le nombre de colonies formées et plus de ERa surexpression considérablement augmenté le nombre de colonies formées (figure 3C).

Il est essentiel de surveiller les images numériques acquises et ajuster la carte accent fréquemment pendant les 24 premières heures en tant que cellules s'attachent à la plaque, puis au moins deux fois par jour pour s'assurer que les cellules restent au foyer et les cultures ne sont pas contaminés. Précision des analyses est compromise si les cellules sont imagés pas mis au point (figure 4).

Dans l'expérience présentée ici représentant, une question essentielle était de déterminer si les changements dans le niveau d'expressions de gènes connus pour avoir un impact risque de cancer du sein (BRCA1, TP53, et 1 récepteur des oestrogènes (Esr1) ¹⁾ a modifié le nombre d'heures entre les divisions cellulaires (durée de vie cellulaire) ou un impact sur ​​les modes de division symétrique par rapport à (asymétrique) en non-cancéreuse primaires des cellules épithéliales mammaires. Pour ce faire, différentes cartes du destin cellulaire (arbres) ont été générés à l'aide TTT. Des exemples de cartes représentatives du destin cellulaire pour chacun des quatre génotypes testés sont illustrées (figure 5A-D). Les quatre génotypes des cellules testées étaient de type sauvage (pas de manipulation génétique) (figure 5A), la perte de pleine longueur Brca1 (Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre)} (figure 5B), la perte de pleine longueur Brca1 en combinaison TP53 avec haplo-insuffisance (Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -)} (Figure 5C), et la perte de pleine longueur Brca1 en combinaison avec TP53 haploinsufficiparence et le gain de Esr1 (Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER)} (figure 5D). Génération de cartes du destin cellulaire a été arrêté lorsque les cellules confluentes (~ 3-4 générations) depuis un suivi sans équivoque de cellules individuelles n'était plus possible par la suite. Génération 0 (temps de première division cellulaire) n'a pas été inclus dans les analyses de la durée de vie des cellules, car la durée de génération 0 est plus longue et plus variables que les générations suivantes. Générations 1, 2, 3, et 4 ont été regroupés pour les analyses finales parce qu'il n'y avait aucune différence significative dans la durée de vie des cellules moyennes ou erreur type de la moyenne (SEM) entre ces générations. La comparaison des durées de vie moyennes de cellules entre les différents génotypes (figure 5E) a révélé que la perte de pleine longueur Brca1 réduit le nombre d'heures entre les divisions cellulaires de 21,3 ± 1,6 heures (de type sauvage) à 16,5 ± 1,0 h (Brca1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre).} Aucuntamment, bien que la perte d'un allèle du gène TP53, en plus de la perte de pleine longueur du gène BRCA1 est associée à une augmentation significative de développement1 le cancer du sein, durée de vie moyenne de cellules est resté inchangé (16,3 ± 1,2 h) par rapport à des souris dépourvues Brca1 seulement. Il est intéressant de gagner de Esr1 dans Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} souris restauré vie cellulaire durées de près de niveaux de type sauvage (19,3 ± 2,1 h), bien que ces souris ont la plus forte incidence de cancer du sein au développement de tous les modèles étudiés ici1 Ces résultats indiquent que la perte de pleine longueur Brca1 n'était pas toujours associée à une durée de vie raccourcie de cellules, au lieu de cette a été modifié par surexprimé ERa. Possibles de la prochaine étape des expériences utilisant cette technologie pourrait être dose-réponse des expériences utilisant des oestrogènes, différents autres facteurs de croissance ou thérapeutiques candidats pour mesurer leur impact sur la durée de vie de la cellule backgro génétique différentonds. Contrairement à l'impact sur la durée de vie des cellules, aucune des altérations génétiques étudiées ici altérés motifs de division cellulaire.

Figure 1. Apparition d'une colonie de cellules épithéliales (A), des cellules épithéliales (B) et des fibroblastes (C) à partir imagerie time-lapse. Cellules épithéliales cubiques semblent plus tout fibroblastes semblent plus allongés. Taille des bars = 50 um.

Figure 2. Représentant série time-lapse images du temps 0, 2 et 4 jours démontrer les changements dans la morphologie cellulaire au cours du temps et les différences dans l'apparence avec et sans Kohléclairage er. A l'instant 0 les cellules étalées sont flottantes (AD pointes de flèches), par deux jours de culture, ils sont adhérentes et peuvent présenter une morphologie cubique de type (flèches épaisses E, H) et par quatre jours de culture, ils allongés et démontrer une EMT-morphologie (mince IL flèches). Kohler éclairage est présent dans les panneaux AC, EG, et IK. Panneaux D, H et L illustrer des images sans éclairage de Köhler. Les images présentées sont du point imagerie même au fil du temps. Barres size = 200 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Le nombre de colonies de cellules épithéliales à 1 jour varié selon le génotype. (A) Arrondi cellules flottantes au début du imagerie time-lapse. (B) Deux colonies représentatives de cellules épithéliales (flèches). (C) les numéros d'épithéliumscolonies de cellules l / châssis formé à 24 h varié selon le génotype. Les graphiques à barres illustrent la moyenne et l'écart type de la moyenne. * P <0,05, ANOVA. Taille des bars = 200 um. Des cellules isolées de glandes mammaires sans tumeur palpable de 10 - à 12-month-old Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), Brca1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), Brca1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), et de type sauvage (n = 3) des souris ont été imagées pour les études. Cinq expériences d'imagerie indépendantes composées de différentes combinaisons de souris de type sauvage et transgéniques ont été réalisées. Media contenue rouge de phénol. Pas d'oestrogène a été ajouté. Cliquez ici pour agrandir Figure .

Figure 4. Out-of-focus images peuvent ne pas être exactsment analysés. Avant d'imagerie de la plaque, la plaque doit s'asseoir dans l'incubateur d'imagerie pendant 15 min à s'équilibrer. Au cours de la première journée de l'imagerie, l'accent devrait être contrôlé et réglé toutes les quelques heures. Après cela, il doit être vérifiée deux fois par jour, mais reste généralement plus stables. La flèche indique une colonie out-of-focus cellules épithéliales.

Figure 5 cartes du destin cellulaire générés par une seule cellule de suivi à l'aide de TTT (A) de type sauvage, (B) Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre,} (C) Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -.,} et (D) Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} souris. Des cellules qui ne peuvent pas être suivis par la perte de trame ou dans une couche de cellules confluentes sont indiqués par un point d'interrogation. En l'absence de point d'interrogationindiqué, le suivi a été délibérément pris fin en raison de la confluence des cellules et l'incapacité à suivre sans équivoque à cellule unique destin. (E) Moyenne vies cellulaires varie selon le génotype. Les graphiques à barres illustrent la moyenne et l'écart type des durées de vie moyennes de cellules (temps entre divisions cellulaires) au fil des générations 1-4 pour chaque génotype. Durée de vie moyenne de cellules étaient significativement plus court dans les cellules épithéliales mammaires provenant de Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} et Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -} par rapport aux souris de type sauvage. * P <0,05, ANOVA. Des cellules isolées de glandes mammaires sans tumeur palpable de 10 - à 12-month-old Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), Brca1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), Brca1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), et de type sauvage (n = 3) des souris ont été imagées pour les études. Cinq expériences d'imagerie indépendantes composées de différentes combinaisons de type sauvage et génétiquement engineered souris ont été réalisées. Media contenue rouge de phénol. Pas d'oestrogène a été ajouté. Cliquez ici pour agrandir Figure .

Discussion

Les étapes critiques

Il est important de veiller à ce que les glandes mammaires sont récoltées à partir des souris du même âge à contrôler la variabilité liée à l'âge dans le comportement des cellules épithéliales mammaires. Lorsque l'étalement des cellules, le même nombre de cellules doivent être déposées dans chaque puits pour chaque expérience. Les cellules doivent être relativement rares lorsque le placage de sorte que les cultures ne deviennent confluentes trop rapidement ce qui permet de suivre plusieurs cellules individuelles à travers des images en série. Il est essentiel que la plaque soit équilibrée dans l'incubateur avant d'imagerie parce que l'accent va changer après que la plaque est équilibrée. Une fois que l'imagerie a commencé, l'accent devrait être vérifié fréquemment et ajustée au besoin, en particulier dans les 24 premières heures. Il est important d'avoir la température de l'incubateur et réglementé préchauffé. Le nombre de personnes qui entrent et sortent de la salle devrait être limitée autant que possible. Nous vous recommandons de pratiquer tous les aspects de setting jusqu'à l'expérience préalable pour assurer la reproductibilité et de contrôle qualité. Comme pour toutes les expériences de culture cellulaire, la stérilité est un problème important et standards stériles pratiques de culture cellulaire doit être utilisé à tout moment.

Enregistrement et manipuler les fichiers image volumineux nécessite une quantité importante d'espace mémoire. Un lecteur réseau partagé ou les disques durs portables peuvent être utilisés. Une fois que les fichiers sont convertis, il est important de s'assurer que les images sont constamment nommés correctement et placés dans des dossiers correspondants. Des sauvegardes fréquentes des données numériques doivent être effectués tout au long du processus.

Limites

Cette méthode utilise un système de culture 2-D qui ne permet pas une analyse des différences de comportement qui devient apparent dans un système de culture en 3-D. Durées de vies cellulaires ne peuvent être reproductible mesurée après la division cellulaire observée d'abord comme le nombre d'heures de première division cellulaire à la suite d'initialisationial placage des cellules est variable.

D'éventuelles modifications

Selon les besoins de l'expérience, time-lapse images peuvent être prises plus ou moins fréquemment. Par exemple, si transitoire structures cellulaires doivent être quantifiés, un intervalle de 5 sec peut être plus approprié. D'autres procédures pour générer primaires cultures de cellules épithéliales mammaires peuvent être utilisés. Tout l'équipement d'imagerie peut être utilisé pour créer l'imagerie time-lapse, tant qu'il est en mesure de répondre aux exigences de l'expérience. Les systèmes alternatifs pour une seule cellule de suivi peuvent être utilisés. Pour la procédure décrite ici, une norme fond plat en plastique à 6 puits plaque était adéquat. Vaisselle en plastique peut être utilisé pour toutes les lentilles de travail longues distances telles que l'air 4x, 10x, 20x et. Il est important de choisir les régions près du centre de la vaisselle en plastique lors de l'exécution d'imagerie à contraste de phase, car le plastique est courbée à proximité des bords de la plupart des plats et déforme la lumière.Puits lamelle de verre d'épaisseur à fond serait nécessaire pour normales de travail à distance (lentilles à immersion d'huile, l'eau, le glycérol, etc), qui sont généralement à plus fort grossissement.

Dépannage

Lorsque les cellules sont plaquées, les médias devraient être suffisants pour maintenir la croissance des cellules pendant 5 jours pour réduire le besoin de manipuler la plaque sur la scène, mais, si nécessaire, les médias peuvent être ajoutés. Il est recommandé que l'évaporation est réduite au minimum. L'évaporation doit être géré en plaçant trois à quatre plats d'eau déminéralisée stérile à l'intérieur de l'incubateur et les remplir si nécessaire. Il est possible de remplir les puits non utilisés de la plaque à 6 puits avec de l'eau déminéralisée stérile.

Si les images ne se chargent pas dans le programme de TTT, vérifiez d'abord et assurez-vous que les fichiers et dossiers sont disposés et nommé correctement. Ensuite, vérifiez si le fichier journal se trouve dans le dossier correct (voir l'étape 5.5).

Futudemande de ré ou la direction technique de maîtrise après

La même procédure générale pourrait être utilisée pour analyser le comportement des autres types de cellules primaires humaines, y compris les cellules épithéliales mammaires ainsi que des cellules de cancer du sein. Par exemple, le comportement spécifique génotypique et / ou la réponse aux traitements candidats peuvent être analysés. Populations de cellules Alternativement, l'imagerie de cellules activé par fluorescence (FAC) triées peut être effectuée ou marqueurs fluorescents ajouté à suivre les types cellulaires spécifiques.

Importance de cette technique par rapport aux méthodes existantes

Ajout d'imagerie time-lapse et d'analyses du comportement des cellules au fil du temps à la culture cellulaire traditionnel et les techniques de marquage fournit des données quantitatives à partir des cellules individuelles dans le temps plutôt que seulement la dynamique des populations entières. Cette technique permet aux cellules simples à observer en continu, contrairement aux méthodes traditionnelles qui permettent une observation seulement à timepoints discrets. Mar ailleurs, les méthodes traditionnelles nécessitent les cellules à être dérangé par les prendre dans et hors de l'incubateur de les voir sous un microscope tandis que l'approche décrite ici permet aux cellules d'être observé sans être transférés. Enfin, imagerie time-lapse fournit un dossier durable des cellules sous observation qui peuvent être renvoyés à d'autres analyses. L'utilisation de TTT pour suivre le comportement de cellules individuelles permet une analyse de plusieurs paramètres non équivoque et ne nécessite pas l'utilisation d'un marqueur fluorescent pour localiser les cellules spécifiques dans le cadre d'observation. La technique révèle des différences dans le comportement des cellules épithéliales mammaires qui sont difficiles à mesurer dans des coupes de tissus statiques de la glande mammaire. Mesures de durée de vie des cellules de quantifier le nombre d'heures entre les événements mitotiques. Cette mesure fournit des données précises sur le nombre réel d'heures entre les divisions cellulaires indiquant la longueur du cycle cellulaire en quelques heures. Un chercheur peut utiliser ces données pour déterminer commentmodifications génétiques spécifiques ou la culture de cellules d'impact conditions la durée du cycle.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140