Summary
समय चूक इमेजिंग प्राथमिक preneoplastic स्तन उपकला अनुवांशिक इंजीनियर स्तन कैंसर के खतरे के माउस मॉडल से प्राप्त करने के लिए निर्धारित करती है कि वहाँ विशिष्ट व्यवहार मापदंडों और अलग आनुवंशिक घावों के बीच सहसंबंध कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
समय चूक इमेजिंग सुसंस्कृत प्राथमिक preneoplastic स्तन उपकला अलग अनुवांशिक इंजीनियर स्तन कैंसर के माउस मॉडल से ली गई कोशिकाओं के व्यवहार की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, सेल (सेल जन्मों) डिवीजनों, apoptotic सेल नंबर, morphological परिवर्तन के विकास, और कॉलोनी के गठन की व्यवस्था के बीच समय और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है विशिष्ट आनुवंशिक घावों ले कोशिकाओं की तुलना में. प्राथमिक स्तन उपकला कोशिका संस्कृतियों स्पर्शनीय ट्यूमर बिना स्तन ग्रंथियों से उत्पन्न कर रहे हैं. ग्रंथियों ध्यान बगल पेशी से स्पष्ट जुदाई के साथ resected हैं, लिम्फ नोड्स को हटा रहे हैं और समृद्ध स्तन उपकला कोशिकाओं की एकल कोशिका निलंबन enzymatic पृथक्करण और निस्पंदन द्वारा पीछा नख़रेबाज़ स्तन ऊतकों द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. एकल कक्ष निलंबन चढ़ाया और जीवित कोशिका इमेजिंग के लिए एक मशीन कक्ष के भीतर एक खुर्दबीन के नीचे सीधे रखा. सोलह 650 सुक्ष्ममापी x 700 प्रत्येक w से एक 4x4 विन्यास में सुक्ष्ममापी क्षेत्रों6-अच्छी तरह से एक थाली के पक्ष 5 दिनों के लिए हर 15 मिनट imaged. समय चूक छवियों सीधे सेलुलर व्यवहार है कि कोशिकाओं चढ़ाना के पहले 24 घंटे (एकत्रीकरण बनाम सेल प्रसार), apoptosis की घटनाओं, और morphological परिवर्तन के चरणबद्ध के भीतर और सेल कॉलोनी के गठन की व्यवस्था आवृत्ति शामिल कर सकते हैं को मापने के लिए जांच कर रहे हैं. एकल सेल ट्रैकिंग सेल व्यक्तिगत सेल जन्मों और कोशिका विभाजन पैटर्न की जांच के माप के लिए भाग्य नक्शे उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. मात्रात्मक डेटा सांख्यिकीय व्यवहार में महत्वपूर्ण मतभेद विशिष्ट आनुवंशिक घावों के साथ सहसंबद्ध के लिए आकलन का विश्लेषण कर रहे हैं.
Introduction
अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल का अध्ययन करने और समझने के लिए कैसे अलग आनुवंशिक घावों स्तन कैंसर के विकसित होने के जोखिम के लिए योगदान करने के लिए उपकरण हैं. उदाहरण के लिए, अनुवांशिक इंजीनियर चूहों से पता चला है कि तीन कारकों का संयोजन: पूर्ण लंबाई स्तन कैंसर 1, (बीआरसीए 1) जल्दी शुरुआत स्तन उपकला कोशिकाओं में जीन ट्यूमर प्रोटीन (TP53) p53 अगुणित अपर्याप्तता रोगाणु लाइन, और स्तन उपकला की हानि सेल लक्षित विनियमित एस्ट्रोजेन रिसेप्टर अल्फा (युग) बीआरसीए 1 (च) 11/f11/Mouse स्तन ट्यूमर (MMTV) वायरस -Cre/p53 + / (-/tetracycline-operator floxed की 100% में स्तन कैंसर के विकास में एक्सप्रेशन परिणाम tet सेशन) -ER/MMTV-reverse टेट्रासाइक्लिन transactivator (rtTA कम f11/f11/MMTV-Cre/p53 बीआरसीए 1 में रिपोर्ट प्रतिशत + / की तुलना में उम्र के 12 महीनों के द्वारा चूहों के बिना युग चूहों पर अभिव्यक्ति (50 ~ 60)% और बीआरसीए 1 TP53 haploinsuf बिना f11/f11/MMTV-Cre चूहोंficiency (<5%) 1.
Preneoplastic प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं के व्यवहार के गतिशील समय चूक इमेजिंग सेल व्यवहार में मतभेद है कि आसानी से कम स्थिर ऊतक वर्गों में की सराहना कर रहे हैं पता चलता है. प्रसार और भेदभाव में बदलाव मानव बीआरसीए 1 उत्परिवर्तन वाहक से प्राथमिक स्तन कोशिकाओं में मनाया जाता है और सामान्य से प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं के एकल कोशिका निलंबन और अनुवांशिक इंजीनियर चूहों के 2 निर्माण resected स्तन ग्रंथि के ऊतकों के enzymatic disassociation के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं. 3 समय चूक छवियों के लिए तंत्र और सेल कॉलोनी उपस्थिति और उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT) और apoptosis सहित कोशिकाओं में morphological परिवर्तन की घटनाओं के समय का आकलन करने के लिए देखा जाता है. सेल भाग्य नक्शे का सृजन, कोशिका (सेल जन्मों) डिवीजनों, और कोशिका विभाजन के पैटर्न के दृढ़ संकल्प के बीच समय की लंबाई की मात्रा का ठहराव एकल कोशिका ट्रैकिंग के उपयोग के द्वारा की है. Timm'ट्रैकिंग उपकरण (TTT) publically उपलब्ध सॉफ्टवेयर एकल कोशिका भाग्य नक्शे को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया है. सेल भाग्य के तंत्र elucidating में इसकी उपयोगिता 4,5 स्थापित किया गया है सामान्य hematopoietic स्टेम सेल 6-9 विकास और न्यूरॉन्स की पीढ़ी की जांच 10.
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Protocol
1. समग्र योजना
- स्तन उपकला कोशिकाओं अनुवांशिक इंजीनियर स्तन ग्रंथियों से preneoplastic प्राथमिक संस्कृतियों उत्पन्न और जंगली प्रकार चूहों पर नियंत्रण.
- जीवित कोशिका छवियों हर 5 दिनों के लिए के लिए Volocity छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (5.3.1 संस्करण, PerkinElmer, Waltham, MA) का उपयोग कर 15 मिनट पर कब्जा.
- समय चूक छवियों को सीधे समय और उपकला कोशिका कॉलोनी गठन की व्यवस्था, apoptosis की घटनाओं, और morphological परिवर्तन की चरणबद्ध का आकलन.
- कन्वर्ट उत्पन्न Volocity. झगड़ा ढेर JPG Metamorph माइक्रोस्कोपी स्वचालन और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (आण्विक डिवाइस, LLC Sunnyvale, CA) और नाम बदलने डिजिटल छवि फ़ाइलें (2.1.6 का नाम बदलें, का उपयोग फ़ाइलें. http://www.softpedia.com/get / / सिस्टम फ़ाइल प्रबंधन /-Rename.shtml ) Timm ट्रैकिंग उपकरण सॉफ्टवेयर (TTT के साथ संगतता सक्षम करने के लिए,"लक्ष्य =" tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "_blank http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index>. ) HTML.
- TTT का प्रयोग, सेल सेल (सेल जन्मों) विभाजन और कोशिका विभाजन के पैटर्न (सममित बनाम असममित) के बीच के समय का निर्धारण करने के लिए भाग्य नक्शे उत्पन्न करते हैं.
- ऊपर चरण 3 और 5 से मात्रात्मक डेटा विश्लेषण के लिए तय अगर वहाँ अलग अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल और / या जंगली प्रकार के नियंत्रण के बीच सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद हैं.
2. प्राथमिक स्तन उपकला सेल संस्कृतियों का सृजन
- एकल स्तन उपकला कोशिकाओं के निर्माता के निर्देशों (EpiCult-B माउस मध्यम किट, Stemcell टेक्नोलॉजीज, वैंकूवर, ई.पू.) के एक बदलाव के बाद अलगाव के लिए पूरी मीडिया तैयार. 450 मिलीलीटर मध्यम महामारी - पंथ - बी, 50 मिलीलीटर महामारी पंथ बी प्रसार पूरक, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 50 ग्राम / मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (PenStr गठबंधन) ep और 10 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF).
- 2.1 से 9 पूरा मीडिया भागों साथ एक 10x / Collagenase hyaluronidase मिश्रण की हिस्सा 1 संयोजन के द्वारा पृथक्करण मीडिया तैयार करो.
- माउस euthanize और तुरंत पोस्टमार्टम के लिए आगे बढ़ना है. प्लेस एक स्टायरोफोम necropsy मंच पर अपनी पीठ पर माउस और सभी चार अंगों को सुरक्षित तो उदर त्वचा तना हुआ है. उदर त्वचा और बालों कि अंग 70% इथेनॉल के साथ, overlying सहित, तर. त्वचा के माध्यम से एक midline चीरा (peritoneum में प्रवेश नहीं है) कि एक Y चीरा में प्रत्येक सामने अंग की औसत दर्जे का और त्वचा के माध्यम से बढ़ाया है बनाने के द्वारा 2 / (वक्ष) 3 और 4/5 (वंक्षण) स्तन ग्रंथियों का पर्दाफाश प्रत्येक पीछे अंग की औसत दर्जे का त्वचा के माध्यम से वाई चीरा नीचे एक ऊपर.
- कुंद विच्छेदन का उपयोग, underlyingperitoneum से त्वचा अलग है, त्वचा के दोनों पक्षों पर वापस खींच जब तक यह तना हुआ है, और यह स्टायरोफोम necropsy पिन का उपयोग कर मंच के लिए सुरक्षित हैं. बाहर की ओर से शुरू, disse के विवेकपूर्ण उपयोग के साथ कुंद विच्छेदन का उपयोगction कैंची अक्षुण्ण वंक्षण और / या अंतर्निहित संयोजी ऊतक और मांसपेशियों से वक्ष स्तन ग्रंथियों को अलग करने के लिए. एक 10 सेमी बाँझ पेट्री डिश में कोई दो से अधिक स्तन ग्रंथियों प्लेस और टिशू कल्चर हुड के लिए कदम.
- टिशू कल्चर हुड में, स्तन लिम्फ नोड्स कि छोटे एक पीले रंग के साथ अच्छी तरह से घिरा पिंड के रूप में पहचान कर रहे हैं के लिए ग्रंथियों की जांच. बाँझ स्केलपेल और संदंश का उपयोग आसपास ग्रंथि से लिम्फ नोड्स निकालें. ~ 1 मिमी 3 दो बाँझ नलियां, प्रत्येक हाथ में एक का उपयोग cubes में स्तन ऊतक क़ीमा.
- प्लेस 5 मिलीलीटर पृथक्करण मीडिया, मिश्रण में धीरे pipetting और नीचे 2-3 बार एक 10 मिलीलीटर विंदुक का उपयोग करके स्तन ऊतकों, कीमा बनाया हुआ और रातोंरात सेते हैं (अप करने के लिए घंटा ~ 16) में 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ढीला टोपी के साथ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब.
- अगली सुबह, हिस्सा 1 हैंक्स बैलेंस्ड नमक (HbSS) समाधान FBS 2% और 4 भागों से युक्त एक ठंड मिश्रण तैयार लाल बीएल को बढ़ावा देने के लिए अमोनियम क्लोराइड समाधान bufferedood सेल lysis (HFAmCl) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ठंड HbSS FBS 2% (HF) के साथ पूरक. पूर्व गर्म ट्रिप्सिन EDTA (0.25%), 5 मिग्रा / हांक संतुलित नमक समाधान मिलीलीटर Dispase में संशोधित, 1 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं, और पूरा मीडिया.
- इनक्यूबेटर से स्तन ऊतक के साथ शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब निकालें और धीरे भंवर 2-3 सेकंड दो बार पल्स. 5 मिनट (कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 450 × छ पर ट्यूब, अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- 10 मिलीलीटर HFAmCl और अपकेंद्रित्र की एक न्यूनतम में गोली 450 × छ पर 5 मिनट (कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए में Resuspend है और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- गोली 3 मिलीलीटर ट्रिप्सिन-EDTA जोड़ें और एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ 1 मिश्रण है और फिर रेशेदार (1-3 मिनट) तक P1000 micropipettor के साथ. 5 मिनट (कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 10 मिलीलीटर HF, अपकेंद्रित्र 450 पर × छ जोड़ें और तैरनेवाला त्यागें.
- 5 मिलीग्राम / एमएल Dispase 2 मिलीग्राम और 1 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं गोली और 1 मिनट के लिए एक P1000 micropipettor साथ मिश्रण के 200 μl जोड़ें. नमूना clo होना चाहिएUdy लेकिन चिपचिपा नहीं है. रेशेदार यदि DNase मैं के 100 μl जोड़ने और फिर मिश्रण.
- 5 मिनट (कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 10 मिलीलीटर ठंड HF, 450 पर एक 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी और अपकेंद्रित्र के माध्यम से तनाव × छ जोड़ें और तैरनेवाला त्यागें.
- पूरा मीडिया में अंतिम गोली Resuspend. यों कोशिकाओं की कुल संख्या (एक hemocytometer या कल्टर काउंटर का उपयोग करके). दो स्तन ग्रंथियों लगभग 1 x 10 6 से 1 x 10 7 कोशिकाओं उपज. प्लेट अच्छी तरह से प्रति 1.5 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व में प्राथमिक उपकला एक फ्लैट तली 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं.
3. जीवित कोशिका इमेजिंग
- कोशिकाओं चढ़ाना के तुरंत बाद, 6 अच्छी तरह से थाली सुरक्षित रूप से एक 5% 2 / humidity/37 संतृप्त डिग्री सेल्सियस तापमान ऊष्मायन कक्ष सीओ के भीतर एक खुर्दबीन मंच पर जगह है. Kohler रोशनी और केंद्र चरण के छल्ले के लिए संघनित्र समायोजित करें. प्रयोगों यहाँ प्रस्तुत किया, एक औंधा Nikon ग्रहण TE300/PerkinElmer स्पिनिंग डिस्क Confocalwidefield चरण विपरीत मोड में एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ माइक्रोस्कोप प्रणाली का इस्तेमाल किया गया था.
- ओपन छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर बनाने और समय चूक छवियों के लिए एक पुस्तकालय नाम, और बड़ी फ़ाइलों के लिए पर्याप्त स्थान के साथ एक स्थान को बचाने के लिए. प्रयोगों का उपयोग Volocity छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (5.3.1 संस्करण, PerkinElmer, Waltham, एमए) प्रस्तुत किया.
- थाली खुर्दबीन इनक्यूबेटर में 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए संतुलन में लाना करने की अनुमति दें. लेंस को कम करने के लिए मंच लेंस हस्तक्षेप से बचने के लिए. "स्टेज" शीर्षक के अंतर्गत, चुनें "स्टेज जांचना." फोकल हवाई जहाज़, Z = "स्टेज 'शीर्षक के तहत" जोड़ें बिंदु "का चयन करके एक्स, वाई, जेड टैब और निशान इमेजिंग अंक के तहत शून्य सेट reacquire चरण विपरीत इमेजिंग के रूप में इमेजिंग के लिए 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से बीच में जगह अंक प्लास्टिक कुओं की परिधि के आसपास विकृत हो सकती है. 4 एक्स 4 (650 सुक्ष्ममापी x 700 सुक्ष्ममापी क्षेत्रों) क्षेत्र, एक छोटे से ओवरलैप (5% के बारे में) के साथ प्रत्येक में एक वर्ग में अंक की व्यवस्था. "हरिण के तहत चयनित अंक सहेजेंई ".
- "स्टेज" के अंतर्गत चयन करें और ध्यान केंद्रित नक्शा बनाओ "का पालन प्रत्येक बिंदु का ध्यान सेट करने का संकेत देता है. छवि अधिग्रहण समय सेट करने के लिए प्रति घंटे 4 चित्र (हर 15 मिनट) पर कब्जा करने के लिए. यह विशिष्ट प्रयोग की आवश्यकताओं के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. के अंतर्गत "स्टेज" ध्यान केंद्रित नक्शा सहेजें.
- सही दाईं ओर उपकरण पट्टी "छवि अधिग्रहण" पर क्लिक करें और इमेजिंग सेटिंग्स को बचाने के. रिकॉर्ड बटन प्रेस इमेजिंग शुरू. 1 घंटे के बाद, छवियों के ध्यान की जाँच करने के लिए देखने के लिए अगर किसी भी समायोजन की जरूरत है.
- मॉनिटर और 5 दिनों के लिए रहते इमेजिंग जारी है, अंत जब कोशिकाओं सहधारा हो.
4. समय चूक छवियाँ प्रत्यक्ष देखने के लिए समय और प्रारंभिक उपकला कोशिका कालोनी गठन के तंत्र Apoptosis की घटना, और morphological परिवर्तन की चरणबद्ध का आकलन
- समय चूक छवियों के प्रत्यक्ष देखने के संगत किसी भी वीडियो देखने के सॉफ्टवेयर (जैसे का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है http:/ / Www.real.com/ realplayer या अन्य फ्रीवेयर या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर). छवियाँ. झगड़ा प्रारूप में इस कदम पर या JPG फ़ाइलें (चरण 5 देखें) रूपांतरण के बाद देखा जा सकता है.
- प्रारंभिक कॉलोनी के गठन की व्यवस्था का निर्धारण करने के लिए एक एकल छवि एक थाली पर इमेजिंग साइट का प्रतिनिधित्व ढेर के साथ शुरू करते हैं. प्रारंभिक फ्रेम में कोशिकाओं चल होगा. धारावाहिक छवियों का पालन निर्धारित करने के लिए जब पहली उपकला कोशिका प्लेट का पालन करता है. इस चरण में, उपकला कोशिकाओं और पहचाना जा सकता है और उनके अधिक cuboidal आकारिकी द्वारा fibroblasts से भेदभाव है. धारावाहिक चित्रों के माध्यम से इस एकल उपकला कोशिका का पालन करें और बाद में 24 घंटे से अधिक अपने भाग्य का पालन करें. रिकॉर्ड अगर यह अतिरिक्त उपकला कोशिकाओं से घिरा हुआ हो जाता है या कोशिका विभाजन या apoptosis आए. अगर उपकला कोशिकाओं से घिरा हुआ है, कॉलोनी के गठन की व्यवस्था देखने के द्वारा सीधे निर्धारित कर सकते हैं अगर कोशिकाओं के आसपास चल कोशिकाओं है कि फिर प्रारंभिक अनुयायी (सेल) के साथ या कुल से निकाली गई हैप्रारंभिक पक्षपाती सेल के विभाजन से. सेल एकत्रीकरण बनाम कोशिका विभाजन से पहले 24 घंटे के दौरान गठित कालोनियों की संख्या रिकार्ड.
- कि एक विशिष्ट समय अवधि में apoptosis गुजरना शुरू पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करने के लिए, apoptosis की क्लासिक सुविधाओं एक सेल कि पक्षपाती किया गया है में विकासशील की उपस्थिति के लिए धारावाहिक छवियों का पालन ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), और apoptotic कोशिकाओं इमेजिंग की पूरी अवधि के दौरान या विशिष्ट समय सीमा के भीतर की पहचान की संख्या दर्ज की गई.
- समय के साथ, संस्कृति में उपकला कोशिकाओं के एक प्रारंभिक cuboidal आकार से एक और अधिक लम्बी EMT साथ एकरूप प्रकटन उनके morphology बदल. धारावाहिक छवियों को चढ़ाना के बाद दिन / घंटा निर्धारित है जब यह होता है का पालन करें.
5. छवि फ़ाइल संशोधन
- Timm ट्रैकिंग उपकरण सॉफ्टवेयर के लिए आवश्यकताओं के अनुसार छवि फ़ोल्डर्स और फ़ाइलों का नाम बदलें नाम बदलें 2.1.6 (जैसे एक फ्रीवेयर प्रोग्राम का उपयोग http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) समूहों में फ़ाइलों का नाम बदलने के लिए. एक प्रयोग के सभी फ़ोल्डर्स और फ़ाइलों से युक्त फ़ोल्डर बनाएँ और फ़ोल्डर नाम (जैसे
- प्रत्येक बिंदु / स्थिति जहां संस्कृति imaged था के लिए एक सबफ़ोल्डर बनाएँ. सबफ़ोल्डर नाम: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. स्थिति संख्या 3 अंकों का होना चाहिए. उदाहरण: 072511RN_p001. सबफ़ोल्डर में है कि व्यक्ति की स्थिति के सभी छवि फ़ाइलें रखो.
- (5 अंक का उपयोग करते हुए) Timepoint और प्रत्येक फ़ाइल नाम के अंत में चैनल (के बाद से वहाँ केवल एक उज्ज्वल क्षेत्र चैनल है, "0" का उपयोग करने के लिए) इस प्रारूप में नंबर जोड़ें:
EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg - 1 TTT वेबसाइट से मुक्त कार्यक्रम TTTlogfileconverter डाउनलोड द्वारा प्रत्येक स्थिति के लिए एक लॉग फ़ाइल उत्पन्न करता है. TTTlogfileconverter प्रोग्राम प्रारंभ और प्रयोग फ़ोल्डर का चयन करें. इनपुट एक छवि अंतराल (सेकंड में). एक तस्वीर के लिए हर 15 मिनट लिया, 900 सेकंड दर्ज करें. फिर हरी गुप्त लॉग इन फ़ाइलों बटन दबाएँ.
6. सेल एकल कक्षों के भाग्य मैप्स TTT का उपयोग का सृजन
- सीएक TTTexport फ़ोल्डर बुलाया reate और एक subfolder TTTfiles बुलाया जहां सभी सेल ट्रैकिंग डेटा TTT सॉफ्टवेयर निर्देश के बाद संग्रहित किया जाएगा
- TTT प्रोग्राम प्रारंभ, उपयोगकर्ता के पहले अक्षर का चयन करें, और "जारी रखें." पर क्लिक करें
- प्रेस उपयोगकर्ता "TTTexport" फ़ोल्डर बनाया "सेट NAS," का चयन करें, और ठीक क्लिक करें. ब्राउज़र में, एक प्रयोग फ़ोल्डर का चयन करें, एक स्थिति फ़ोल्डर का चयन करें, और उसके बाद "लोड स्थिति" बटन दबाएँ.
- नेत्र कारक सेट "10x." लोड आवश्यक छवियों की संख्या (सभी छवियों को लोड करने के लिए पहली बार सिफारिश की है).
- सेल संपादक विंडो में, फ़ाइल मेनू के तहत "नई कॉलोनी" का चयन करें. मूवी विंडो में, "ट्रैक सेल" या F2 एक ट्रैकिंग सेल शुरू दबाएँ.
- एम में एक सेल को पहचानेंovie खिड़की और उपयोग करने के लिए सेल पर माउस कर्सर जगह है. सेल की संख्या के साथ एक चक्र के बाद F2 क्लिक किया गया है दिखाई देनी चाहिए. कुंजीपटल की संख्या पैड पर "0" कुंजी का प्रयोग करने के लिए अगली फिल्म के लिए सेल और अग्रिम के स्थान को ट्रैक करने के लिए. कर्सर को स्थानांतरित करने के लिए प्रत्येक फ्रेम के माध्यम से प्रत्येक कोशिका के स्थान का पालन. एक ट्रैक को नष्ट करने और पिछली छवि प्रेस संख्या पैड पर "डेल". सेल प्रेस नज़र रखने के बिना आगे फ्रेम को स्थानांतरित करने के लिए और "3," संख्या पैड पर प्रेस "1" नज़र रखने के बिना पिछड़े चाल.
- निशान एक कोशिका विभाजन मूवी खिड़की में "डिवीजन" बटन पर क्लिक करें. कोशिका मृत्यु चिह्नित मूवी विंडो में कोशिका मृत्यु "बटन पर क्लिक करें. एक बार एक विभाजन हुआ है, बेटी की कोशिकाओं को एक ही सेल भाग्य नक्शे में सही सेल संपादक विंडो ट्रैकिंग मोड स्वतः शुरू में नामित बेटी सेल के सर्कल प्रतीक पर क्लिक करके पता लगाया जा सकता है.
- प्रेस F10 करने के लिए पेड़ को बचाने के लिए. प्रत्येक पेड़ नामित उत्पादन गुना में बचत होगीएर (TTTExport). एक नया सेल भाग्य नक्शा शुरू करने के लिए, "" फाइल "तो सेल संपादक विंडो में" ओपन "मेनू के तहत नई कॉलोनी" का चयन करें.
- सेल संपादक विंडो में "सेल डेटा" टैब से सभा करने के बाद सेल से जीवनकाल डेटा सारणीबद्ध.
7. सांख्यिकीय विश्लेषण
- या तो छात्र टी परीक्षण का उपयोग (अगर दो जीनोटाइप की तुलना) या एनोवा (अगर> दो जीनोटाइप तुलना) निर्धारित करने के लिए अगर प्रारंभिक सेल कालोनियों, सेल जन्मों या घंटे की संख्या के रूप में इस तरह के पैरामीट्रिक डेटा में मतभेद तक अलग जीनोटाइप के बीच EMT की उपस्थिति सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है. Apoptotic आवृत्ति संख्या / कुल संख्या मढ़वाया छात्र टी परीक्षण या एनोवा कोशिकाओं का उपयोग कर के रूप में या मान - व्हिटनी या Kruskal वालिस जब पक्षपाती कोशिकाओं के एक प्रतिशत के रूप में प्राप्त के साथ तुलना की जा सकती है.
- शक्ति आरंभिक प्रयोगों के विश्लेषण से डेटा का उपयोग निर्धारित करने के कितने प्रयोगात्मक replicates परीक्षण करने के लिए की जरूरत है और प्रदर्शन पर्याप्त एस के लिए सेल भाग्य नक्शे प्रत्येक दोहराने से उत्पन्नउपलब्ध फ्रीवेयर का उपयोग करते हुए tatistical शक्ति (जैसे http://statpages.org/ ). यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों में, सेल संस्कृतियों जीनोटाइप प्रति तीन चूहों से प्राप्त निर्धारित करने के लिए अगर वहाँ सेल कॉलोनी गठन और सेल जन्मों में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद थे जब विशिष्ट आनुवंशिक संशोधन किए गए थे करने के लिए पर्याप्त थे.
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Representative Results
उपकला और fibroblast कोशिकाओं सेल आकारिकी द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है. उपकला कोशिकाओं एक cuboidal (चित्रा 1A-B) आकार और रूप सेल कालोनियों (चित्रा 1 ए) है. Fibroblasts, stromal सेल के एक प्रकार, एक लम्बी आकारिकी (चित्रा 1C) है.
कोशिकाओं गोल और इमेजिंग (चित्रा 2A-D) की शुरुआत में तैर रहे थे. थाली करने के लगाव के बाद वे फ्लैट बन गया है और एक प्रकार उपस्थिति cuboidal (चित्रा 2E, एच) का प्रदर्शन किया. EMT तरह एक आकारिकी (चित्रा 2I - एल) में लम्बी संस्कृति के 4 दिनों के उपकला कोशिकाओं के बहुमत. यह परिवर्तन सभी अध्ययन जीनोटाइप में एक ही कालक्रम के साथ हुई. कुछ डिजिटल छवियों blurry थे क्योंकि Kohler रोशनी और चरण अंगूठी संरेखण ठीक से सेट नहीं (चित्रा 2 डी, एच, एल).
अस्थायी परिभाषित व्यक्तिगत उपकला कोशिका COLONI में विकसित कोशिकाओंतों चढ़ाना के बाद 24 घंटे से (चित्रा 3 ए, बी). सीरियल छवि विश्लेषण से पता चला है कि इन कालोनियों कोशिका विभाजन के बजाय सेल एकत्रीकरण द्वारा उत्पन्न किया गया. जबकि स्वयं द्वारा बीआरसीए 1 के विघटन का गठन कालोनियों की संख्या, TP53 अगुणित अपर्याप्तता के अलावा काफी बदल नहीं किया गठन कालोनियों की संख्या कम और ERα के अलावा अधिक अभिव्यक्ति काफी का गठन (चित्रा 3C) कालोनियों की संख्या में वृद्धि हुई है.
यह डिजिटल अधिग्रहीत छवियों की निगरानी और फोकस नक्शा पहले 24 घंटे के दौरान अक्सर समायोजित के रूप में कोशिकाओं थाली करने के लिए देते हैं और फिर कम से कम दो बार करने के लिए सुनिश्चित कोशिकाओं को ध्यान में रहते हैं और संस्कृतियों को दूषित कर रहे हैं दैनिक के लिए महत्वपूर्ण है. विश्लेषण की सटीकता अगर imaged कोशिकाओं को ध्यान में नहीं कर रहे हैं (4 चित्रा) करने के लिए समझौता किया है.
प्रतिनिधि यहाँ प्रस्तुत प्रयोग में, एक महत्वपूर्ण सवाल करने के लिए निर्धारित किया गया था अगर अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तनस्तन कैंसर के खतरे (बीआरसीए 1, TP53, और एस्ट्रोजन रिसेप्टर 1 (Esr1) 1) को प्रभावित करने के लिए ज्ञात जीनों की कोशिका विभाजन (सेल जीवनकाल) के बीच घंटों की संख्या बदल या गैर कैंसर में विभाजन के पैटर्न (सममित बनाम असममित) पर असर पड़ा प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं. इसे पूरा करने के अलग - अलग सेल भाग्य नक्शे (वृक्ष) TTT उत्पन्न का उपयोग कर रहे थे. चार परीक्षण जीनोटाइप के प्रत्येक के लिए प्रतिनिधि सेल भाग्य नक्शे के उदाहरण (चित्रा 5A-D) सचित्र हैं. परीक्षण कोशिकाओं के चार जीनोटाइप जंगली प्रकार (कोई आनुवंशिक हेरफेर) (चित्रा 5A), पूर्ण लंबाई बीआरसीए 1 के नुकसान (बीआरसीए 1 f11/f11/MMTV-Cre) (चित्रा 5 ब), पूर्ण लंबाई बीआरसीए 1 के संयोजन में नुकसान (बीआरसीए 1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -) (चित्रा 5C), और पूर्ण लंबाई बीआरसीए 1 के TP53 haploinsuffici साथ संयोजन में नुकसान TP53 अगुणित अपर्याप्तता के साथency और (बीआरसीए 1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 / + -/MMTV-rtTA/tet-op-ER) Esr1 (चित्रा 5D) का लाभ. जब कोशिकाओं सहधारा एकल कक्षों के स्पष्ट ट्रैकिंग अब नहीं है कि के बाद संभव हो गया था क्योंकि (~ 3-4 पीढ़ियों) बन गया सेल भाग्य नक्शे का सृजन बंद कर दिया गया था. 0 (1 कोशिका विभाजन के लिए समय) पीढ़ी सेल जन्मों के विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया है क्योंकि की अवधि पीढ़ी 0 रह गया था और बाद की पीढ़ियों की तुलना में अधिक चर. पीढ़ियों 1, 2, 3, 4 और अंतिम विश्लेषण के लिए एक साथ रखा गया था क्योंकि वहाँ मतलब सेल जन्मों या इन पीढ़ियों के बीच मीन (SEM) के मानक त्रुटि में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे. अलग (चित्रा 5E) जीनोटाइप के बीच का मतलब सेल जन्मों की तुलना से पता चला है कि पूर्ण लंबाई बीआरसीए 1 के नुकसान कोशिका विभाजन के बीच घंटों की संख्या 21.3 से ± कम 16.5-1.6 घंटा (जंगली प्रकार) ± 1.0 घंटा (f11/f11 / बीआरसीए 1 MMTV Cre). नहींtably, हालांकि पूर्ण लंबाई बीआरसीए 1 के नुकसान के अलावा में एक TP53 एलील की हानि स्तन कैंसर development1 में एक महत्वपूर्ण वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है मतलब है, सेल जीवनकाल अपरिवर्तित रहा था बीआरसीए 1 केवल कमी चूहों की तुलना में (16.3 ± 1.2 घंटा). दिलचस्प में बीआरसीए 1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 में Esr1 का लाभ + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER चूहों बहाल सेल जीवनकाल यद्यपि इन चूहों निकट जंगली प्रकार के स्तर (19.3 ± घंटा 2.1), durations सभी मॉडलों की स्तन कैंसर के विकास की सबसे ज्यादा घटनाएं here.1 इन निष्कर्षों का अध्ययन संकेत दिया है कि पूर्ण लंबाई बीआरसीए 1 के नुकसान सदा ही एक छोटा सेल जीवनकाल, बजाय इस व्यक्त की ERα द्वारा संशोधित किया गया था के साथ जुड़ा हुआ नहीं था. संभव अगले कदम इस प्रौद्योगिकी का उपयोग प्रयोगों खुराक - प्रतिक्रिया अलग एस्ट्रोजेन, अन्य विकास कारकों, या उम्मीदवार चिकित्सा विज्ञान का उपयोग करने के लिए विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में सेल जीवनकाल पर उनके प्रभाव को मापने में प्रयोग किया जा सकता हैunds. सेल जीवनकाल अवधि पर प्रभाव के विपरीत, आनुवंशिक परिवर्तन की कोई भी यहाँ बदल कोशिका विभाजन पैटर्न का अध्ययन किया.
चित्रा 1. एक उपकला सेल कॉलोनी (ए) के रूप, उपकला सेल, (बी) और (सी) समय चूक इमेजिंग से fibroblast उपकला कोशिकाओं अधिक cuboidal दिखाई जबकि fibroblasts अधिक लम्बी दिखाई देते हैं. साइज सलाखों = 50 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2. 0 समय से धारावाहिक प्रतिनिधि समय चूक छवियों, 2 और 4 दिन के समय और साथ उपस्थिति में मतभेद और कोल के बिना सेलुलर morphology में परिवर्तन का प्रदर्शनएर रोशनी. 0 समय मढ़वाया कोशिकाओं (arrowheads ई.) चल रहे हैं, संस्कृति में दो दिनों वे पक्षपाती हैं और एक प्रकार आकारिकी cuboidal (मोटी तीर ई, एच) प्रदर्शन कर सकते हैं और संस्कृति में चार दिनों में वे बढ़ाना और एक प्रदर्शित करने के लिए EMT तरह आकारिकी (पतली तीर आईएल). Kohler रोशनी पैनल, एसी, ईजी, और इंद्रकुमार में मौजूद है. पैनलों विकास, और एच एल Kohler रोशनी के बिना छवियों वर्णन. दिखाया छवियाँ समय पर एक ही इमेजिंग बिंदु से कर रहे हैं. साइज बार = 200 सुक्ष्ममापी बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. 1 दिन में उपकला कोशिका कालोनियों की संख्या जीनोटाइप द्वारा विविध. (ए) समय चूक इमेजिंग की शुरुआत में अस्थायी कोशिकाओं गोल. (बी) के दो प्रतिनिधि उपकला कोशिका कालोनियों (तीर). (सी) epithelia के नंबरएल सेल कालोनियों / फ्रेम 24 घंटा जीनोटाइप द्वारा विविध में गठन किया था. बार रेखांकन के माध्य का मतलब है और मानक त्रुटि वर्णन. * <0.05 पी, एनोवा. साइज बार = 200 सुक्ष्ममापी. स्पर्शनीय ट्यूमर से 10 बिना स्तन ग्रंथियों से (n = 3), बीआरसीए 1 - 12 महीने की उम्र में बीआरसीए 1 (n = 4) f11/f11/MMTV-Cre, बीआरसीए 1 f11/f11 / MMTV के Cre / p53 + / - अलग कक्षों f11/f11/p53 + / (n = 3) -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA, और जंगली प्रकार चूहों (एन 3 =) के अध्ययन के लिए imaged थे. पांच स्वतंत्र इमेजिंग जंगली प्रकार और अनुवांशिक इंजीनियर चूहों के विभिन्न संयोजनों का बना प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया. मीडिया phenol लाल निहित. एस्ट्रोजन जोड़ा गया बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. बाहर का ध्यान केंद्रित छवियों सही नहीं किया जा सकताly का विश्लेषण किया. इमेजिंग थाली से पहले, प्लेट इमेजिंग इनक्यूबेटर में समभार बनाना करने के लिए 15 मिनट के लिए बैठना चाहिए. इमेजिंग के पहले दिन के दौरान और जाँच की जानी चाहिए हर कुछ घंटों समायोजित. उसके बाद यह दो बार जाँच की जानी चाहिए दैनिक, लेकिन आम तौर पर और अधिक स्थिर बनी हुई है. तीर एक बाहर का ध्यान केंद्रित उपकला सेल कॉलोनी को इंगित करता है.
चित्रा 5 सेल भाग्य एकल कोशिका ट्रैकिंग से उत्पन्न (ए) जंगली प्रकार, (बी) बीआरसीए 1 f11/f11/MMTV-Cre, (सी) बीआरसीए 1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / के लिए TTT का उपयोग नक्शे, और (डी) f11/f11/MMTV-Cre/p53 बीआरसीए 1 / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER चूहों. कक्ष कि फ्रेम या एक सहधारा सेल परत में बाहर हानि के कारण नहीं लगाया जा सकता है एक प्रश्न चिह्न द्वारा संकेत कर रहे हैं. जब कोई प्रश्न चिह्नसंकेत दिया है, जानबूझकर सेल संगम और स्पष्ट एकल कोशिका के भाग्य का पालन करने में असमर्थता की वजह से समाप्त हो गया (ई) सेल जीनोटाइप द्वारा विभिन्न जन्मों मतलब ट्रैकिंग. बार रेखांकन मतलब सेल जन्मों का मतलब है और मानक त्रुटि (कोशिका विभाजन के बीच का समय) प्रत्येक जीनोटाइप के लिए 1-4 पीढ़ियों पर वर्णन. के रूप में जंगली प्रकार के चूहों की तुलना में - मीन सेल जन्मों स्तन उपकला + / बीआरसीए 1 f11/f11/MMTV-Cre और बीआरसीए 1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 से ली गई कोशिकाओं में काफी छोटे थे. * <0.05 पी, एनोवा. स्पर्शनीय ट्यूमर से 10 बिना स्तन ग्रंथियों से (n = 3), बीआरसीए 1 - 12 महीने की उम्र में बीआरसीए 1 (n = 4) f11/f11/MMTV-Cre, बीआरसीए 1 f11/f11 / MMTV के Cre / p53 + / - अलग कक्षों f11/f11/p53 + / (n = 3) -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA, और जंगली प्रकार चूहों (एन 3 =) के अध्ययन के लिए imaged थे. पांच स्वतंत्र इमेजिंग प्रयोगों जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से उद्योगों के विभिन्न संयोजनों का बनाeered चूहों प्रदर्शन किया गया. मीडिया phenol लाल निहित. एस्ट्रोजन जोड़ा गया बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
महत्वपूर्ण कदम
यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि स्तन ग्रंथियों स्तन उपकला कोशिका व्यवहार में उम्र से संबंधित परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करने के लिए एक ही उम्र के चूहों से काटा जाता है. जब कोशिकाओं चढ़ाना, कोशिकाओं के एक ही नंबर हर प्रयोग के लिए प्रत्येक कुएं में चढ़ाया किया जाना चाहिए. कोशिकाओं अपेक्षाकृत विरल हो सकता है जब इतना है कि संस्कृतियों सहधारा भी जल्दी नहीं क्या हो गया है यह धारावाहिक चित्रों के माध्यम से संभव कई व्यक्तिगत कोशिकाओं का पालन करने के लिए कर रही है चढ़ाना चाहिए. यह जरूरी है कि थाली इमेजिंग पहले इनक्यूबेटर में equilibrated क्योंकि ध्यान के बाद थाली equilibrated है बदल जाएगा. एक बार इमेजिंग शुरू हो गया है, ध्यान अक्सर जाँच की जानी चाहिए और समायोजित के रूप में की जरूरत है, विशेष रूप से पहले 24 घंटे के भीतर. यह महत्वपूर्ण है इनक्यूबेटर विनियमित और पूर्व गर्म तापमान है. कमरे के अंदर और बाहर जा रहे लोगों की संख्या के रूप में संभव के रूप में ज्यादा सीमित होना चाहिए. हम settin के सभी पहलुओं का अभ्यास करने की अनुशंसाछ reproducibility और गुणवत्ता नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए पहले से प्रयोग करने के लिए ऊपर. सभी सेल संस्कृति प्रयोगों के साथ के रूप में, बाँझपन एक महत्वपूर्ण मुद्दा है और मानक बाँझ सेल संस्कृति प्रथाओं सभी समय पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
सहेजा जा रहा है और बड़ी छवि फ़ाइलों से छेड़छाड़ स्मृति अंतरिक्ष के एक पर्याप्त राशि की आवश्यकता है. एक साझा नेटवर्क ड्राइव या पोर्टेबल हार्ड ड्राइव का इस्तेमाल किया जा सकता है. एक बार फ़ाइलें परिवर्तित कर रहे हैं यह महत्वपूर्ण है यकीन है कि छवियों लगातार सही ढंग से नाम पर कर रहे हैं और इसी फ़ोल्डर में रखा है. डिजिटल डेटा की लगातार बचाता है और इस प्रक्रिया के दौरान प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
सीमाएं
इस पद्धति का एक संस्कृति 2-D प्रणाली का उपयोग करता है कि व्यवहार मतभेद है कि एक 3-D संस्कृति प्रणाली में स्पष्ट हो सकता है के विश्लेषण के लिए अनुमति नहीं है. सेल जन्मों की अवधियां reproducibly 1 मनाया कोशिका विभाजन के बाद ही हो सकता है मापा जा के रूप में घंटे की पहली कोशिका विभाजन के लिए संख्या के बाद initकोशिकाओं की ial चढ़ाना चर रहा है.
संभावित संशोधनों
प्रयोग की आवश्यकताओं पर निर्भर करता है, समय चूक छवियों अधिक या कम बार लिया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यदि क्षणिक सेलुलर संरचनाओं मात्रा निर्धारित किया जा रहे हैं, एक 5 सेकंड अंतराल अधिक उपयुक्त हो सकता है. अन्य प्राथमिक स्तन उपकला सेल संस्कृतियों उत्पन्न प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है. किसी भी इमेजिंग उपकरणों के लिए समय चूक इमेजिंग बनाने के लिए, के रूप में लंबे समय के रूप में यह प्रयोग की आवश्यकताओं को पूरा करने में सक्षम है करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एकल कोशिका पर नज़र रखने के लिए वैकल्पिक सिस्टम नियोजित किया जा सकता है. के लिए प्रक्रिया यहाँ वर्णित है, एक मानक प्लास्टिक फ्लैट नीचे की थाली 6 अच्छी तरह से पर्याप्त नहीं थी. प्लास्टिक व्यंजन सभी लंबी 4x, 10x, और 20x जैसे काम दूरी हवा लेंस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह महत्वपूर्ण है कि प्लास्टिक के बर्तन के केन्द्र के निकट क्षेत्रों का चयन जब चरण विपरीत इमेजिंग प्रदर्शन के बाद से प्लास्टिक ज्यादातर व्यंजनों में किनारों के पास घुमावदार है और प्रकाश distorts.Coverslip मोटाई गिलास तली कुओं सामान्य काम दूरी विसर्जन लेंस (तेल, पानी, ग्लिसरॉल, आदि), जो उच्च वृद्धि पर आम तौर पर कर रहे हैं के लिए आवश्यक हो जाएगा.
मुसीबत शूटिंग
जब कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है, मीडिया के 5 दिनों के लिए सेल के विकास को बनाए रखने के लिए मंच पर थाली से छेड़छाड़ के लिए की जरूरत को कम करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, तथापि, यदि आवश्यक हो तो, मीडिया जोड़ा जा सकता है. यह सिफारिश की है कि वाष्पीकरण एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना है. वाष्पीकरण इनक्यूबेटर अंदर बाँझ विआयनीकृत जल के तीन से चार बर्तन रखने और उन्हें refilling जब आवश्यक द्वारा प्रबंधित किया जाना चाहिए. यह संभव है बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ 6 अच्छी तरह से थाली की अप्रयुक्त कुओं को भरने के.
यदि छवियों TTT कार्यक्रम में लोड नहीं कर रहे हैं, पहले की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि फ़ाइलों और फ़ोल्डरों की व्यवस्था के नाम हैं सही ढंग से. अगले, जांच अगर लॉग फ़ाइल सही फ़ोल्डर में (5.5 कदम देखें).
Futuफिर या mastering तकनीक के बाद आवेदन दिशा
एक ही सामान्य प्रक्रिया मानव प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्तन कैंसर की कोशिकाओं सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, genotypic विशिष्ट व्यवहार और / या उम्मीदवार के उपचार के लिए प्रतिक्रिया का विश्लेषण किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल इमेजिंग (एफएसी) हल सेल आबादी प्रदर्शन किया जा सकता है या फ्लोरोसेंट लेबल के लिए विशेष सेल प्रकार की निगरानी के लिए जोड़ा.
इस तकनीक के मौजूदा तरीकों के लिए सम्मान के साथ महत्व
समय व्यतीत हो जाने और पारंपरिक सेल संस्कृति और लेबलिंग तकनीक के लिए समय पर सेल व्यवहार की इमेजिंग विश्लेषण के अलावा समय के बजाय केवल पूरी जनसंख्या गतिशीलता से अधिक एकल कक्षों से मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है. इस तकनीक को एकल कक्षों लगातार मनाया जा पारंपरिक तरीकों है कि केवल असतत timepoints में अवलोकन की अनुमति के विपरीत की अनुमति देता है. एमoreover, पारंपरिक तरीकों कोशिकाओं उन्हें लेने में और बाहर इनक्यूबेटर करने के लिए उन्हें एक खुर्दबीन के नीचे देखने जबकि दृष्टिकोण यहाँ वर्णित से परेशान करने के लिए आवश्यकता होती है कोशिकाओं को स्थानांतरित किया जा रहा है बिना मनाया जा करने की अनुमति देता है. अंत में, समय चूक इमेजिंग प्रेक्षण के तहत कोशिकाओं है कि आगे के विश्लेषण के लिए लौटा जा सकता है की एक स्थायी रिकॉर्ड प्रदान करता है. TTT व्यक्तिगत सेल व्यवहार पर नज़र रखने का उपयोग करने के कई मापदंडों के एक स्पष्ट विश्लेषण परमिट और करता है की आवश्यकता होती है एक फ्लोरोसेंट लेबल के उपयोग प्रेक्षण के तहत विशिष्ट कोशिकाओं स्थानीय बनाना नहीं है. तकनीक स्तन उपकला कोशिका व्यवहार में अंतर कि स्तन ग्रंथि का स्थिर ऊतक वर्गों में मापने के लिए मुश्किल हैं पता चलता है. सेल जीवनकाल माप mitotic घटनाओं के बीच घंटों की संख्या यों. यह माप सेल घंटे में कोशिका चक्र की लंबाई का संकेत प्रभागों के बीच घंटे की वास्तविक संख्या पर विशिष्ट डेटा प्रदान करता है. एक शोधकर्ता इस डेटा का उपयोग करने के लिए कैसे निर्धारित कर सकते हैंविशिष्ट आनुवंशिक संशोधन या संस्कृति शर्तों प्रभाव सेल चक्र लंबाई.
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Disclosures
लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
लेखकों को अपने परिचय के लिए तकनीकी सहायता और माइकल Rieger के लिए Bofan वू और ईसाई Raithel जीना सेल इमेजिंग के लिए शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. NCI, एनआईएच RO1CA112176 (पीएएफ), NCI, एनआईएच द्वारा समर्थित है. (पीएएफ) R01CA89041-10S1, Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 रेफरी. 316 (ren), रक्षा विभाग W81XWH-11-1-0,074 (ren), पीएएफ WCU कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के माध्यम से शिक्षा, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (R31 10,069) द्वारा वित्त पोषित प्रोग्राम (वर्ल्ड क्लास यूनिवर्सिटी) ( ), IG20 RR025828 01 (कृंतक बैरियर सुविधा उपकरण),, एनआईएच, और NIH NCI 5P30CA051008 (माइक्रोस्कोपी और साझा इमेजिंग और पशु संसाधन).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
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