Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Summary

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Abstract

Neuere Arbeiten zeigen, dass das zentrale Nervensystem (ZNS) Regeneration und Tumorgenese beinhaltet Populationen von Stammzellen (SC) mit Wohnsitz im erwachsenen Gehirn. Aber die Mechanismen, diese normalerweise ruhenden Zellen beschäftigen, um die ordnungsgemäße Funktionsweise von neuronalen Netzwerken, sowie ihre Rolle in der Erholung von Verletzungen und Eindämmung von neurodegenerativen Prozessen sicherzustellen wenig verstanden. Diese Zellen befinden sich in Regionen als "Nischen", die eine tragende Umwelt mit modulierenden Signale sowohl von der Gefäß-und Immunsystem bieten bezeichnet. Die Isolierung, die Wartung und die Differenzierung von ZNS VZ unter definierten Kulturbedingungen, die unbekannte Faktoren auszuschließen, zugänglich macht Behandlung durch pharmakologische oder genetische Mittel, um Einblicke in ihre in vivo-Verhalten. Hier bieten wir detaillierte Informationen über die Methoden zur Erzeugung von Kulturen von ZNS-VZ aus verschiedenen Regionen des erwachsenen Gehirns und Ansätze zu ihrer d beurteilenifferentiation Potential in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in vitro. Diese Technik ergibt eine homogene Zellpopulation als eine Monokultur, die sichtbar auf einzelne SCs und ihre Nachkommen zu untersuchen. Darüber hinaus kann es in verschiedenen Tiermodellsystemen und klinischen Proben angewendet werden kann, wobei zuvor zur regenerativen Antworten in der geschädigten adulten Nervensystems vorherzusagen.

Introduction

Das zentrale Dogma der Neurobiologie, den von den grundlegenden Beobachtungen des Gehirns Zytoarchitektur von Ramón Y. Cajal vor über einem Jahrhundert gemacht gelegt, entschieden, dass die Neurogenese unwahrscheinlich war, nach der Adoleszenz angesichts der Komplexität der neuronalen Netze im ZNS ¹ gefunden. Trotz der Arbeit von Altman in den 1960er Jahren und später Kaplan, die zeigen, dass ³ H-Thymidin konnte in reifen Neuronen darauf hinweist, dass in der Tat Neuronen wurden in verschiedenen Bereichen des erwachsenen Gehirns erzeugt gefunden werden, das Dogma weiterhin halten ^{2, 3.} Evidence weiterhin mit Forschungs Nottebohms die jahreszeitlichen Veränderungen in der Anzahl der Singvogel in Gehirnen ⁴ vorhanden Neuronen beschreiben, zu montieren. Es war nicht bis 1999, als Gould et al. Veröffentlichten Arbeiten über die Erzeugung von Neuronen im Hippocampus steigt mit der Leistung der assoziativen Lernaufgaben in Ratte, sowie die Beobachtungen von Kornack und Rakic ​​DemonstrationTing fortgesetzt Neurogenese im erwachsenen Makaken, die das Konzept einer weniger starren, plastischer Gehirn wurde erkannt ^{5, 6.}

Die Suche nach der zellulären Quelle für diese de novo generierten Neuronen führen zur Entdeckung einer diskreten Population von Stammzellen (VZ), die in Bereichen des Gehirns befinden sich die als Nischen ^7. Die Subventrikularzone und Unter körnige Zone des Hippocampus gelten als die beiden wichtigsten neurogenen Regionen ^8,9 sein. Zellen aus diesen Standorten isoliert zeigen die klassische Merkmal der embryonalen oder fötalen abgeleitet VZ, Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial. Im Fall von neuralen Stammzellen (NSC), können sie in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren. Darüber hinaus sind diese VZ Fleck positive fötale NSC Marker wie der Zwischen Filamentprotein Nestin ^10. Neuere Arbeiten betont, dass SCs vielleicht nicht zu diesen t begrenzt werdenWO Bereiche auf und sind in der Tat im gesamten Gehirn lokalisiert als weitgehend ruhenden Zellpopulation fest mit dem Gefäßsystem ¹¹ verbunden.

Die Beobachtungen, die VZ in Reaktion auf eine Verletzung mobilisiert legt die Möglichkeit, in der Lage, diese Zellen für regenerative Zwecke zu nutzen, um bei der Rückgewinnung von neurodegenerativen Erkrankung und Schlaganfall ^{12, 13} zu unterstützen. Das ist nicht anders als die Rolle, die mesenchymalen Stammzellen (MSCs) bei der Heilung von Bindegewebe spielen, die als perivaskuläre Zellen, die das Potenzial haben, Osteoblasten, Chondrozyten, und Fettzellen werden ¹⁴ zu finden sind. Jedoch NSC nicht in der gleichen Weise wie MSCs aus dem Knochenmark durch Routine Aspiration und Dichtegradientenzentrifugation Techniken geerntet und anschließend in autologe Zelltherapien verwendet. Als Folge müssen auch andere Zellen, wie etwa die Verwendung von fetalen NSC oder neuronalen Vorläuferzellen abgeleitet von embryonic Stammzellen wurden ausführlich in der Tier Krankheiten und Verletzungen Modelle mit unterschiedlichem Erfolg ¹⁵ erforscht. Induzierte pluripotente Stammzellen-Technologien nutzen somatischen Zellquellen bieten eine weitere Möglichkeit dazu bietet der zur Herstellung therapeutisch nützlichen Zell-basierte Therapien für eine Vielzahl von Anwendungen, die Überwindung der begrenzten Verfügbarkeit und ethische Bedenken hinsichtlich der Verwendung von embryonalen Zellen und fetalen Gewebe ^16. Allerdings klinische Umsetzung dieser Erkenntnisse hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, wie in den Kämpfen der Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungen mit SC-basierten therapeutischen Ansätze gezeigt, ^17,18 sowie einen gewundenen Pfad zu Regulierungsfreiheit. Als Alternative kann die Einführung von spezifischen pharmakologischen Behandlungen NSC Zahlen modulieren und zu erleichtern Erholung in Modellen der Parkinson-Krankheit und Schlaganfall ^19. Was auch immer die Strategie könnte sein, zu verstehen, wie diese Zellen effektiv zu manipulierenerfordert eine in vitro-System zugänglich.

Kulturen von NSC kann entweder als Aggregatkulturen, auch bekannt als Neurosphären, oder als Monoschicht ^8,20 durchgeführt werden. Beide Verfahren sind weit verbreitet, die die Einführung von definierten Kulturbedingungen, zB die Verwendung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) oder basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) als Mitogen Quelle, die für die Expansion von multi Vorstufen bereitzustellen. Während Neurosphärenkulturen zur Untersuchung klonale Vermehrung Fähigkeit eines isolierten Zelltyp besser geeignet ist das System gezeigt, um eine gemischte Population von Zellen während der Expansion ²¹ zu erzeugen. Darüber hinaus ist die geschlossene Struktur von Neurosphären die pharmakologische Manipulation der Zellen unpraktisch, und die Interpretation der Einfluss diese Faktoren haben könnten, aufgrund der in der Neurosphäre etabliert Mikroumgebung verwechselt werden. Monolayer-Kulturen, andererseits kann seinin der Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle verwendet, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Signalübertragungsmechanismen, die SC Wachstum und Differenzierung regulieren und eröffnet die Möglichkeit, neue Verbindungen, die speziell auf diese Zellpopulation entdecken, zu erkunden.

Als Folge kann die Fähigkeit, reproduzierbar Kulturen adulter NSC aus unterschiedlichen Bereichen von Interesse im Gehirn generiert in einem breiten Spektrum von Forschungsanwendungen verwendet werden, die von Entwicklungsstudien des zentralen Nervensystems (ZNS) zu erforschen neuartige regenerative Medizin Ansätze . Die hier vorgestellte Protokoll zeigt, wie zu sezieren und bewerten die Differenzierungspotenzial von ZNS-VZ von der erwachsenen Gehirn von Nagetieren isoliert.

Protocol

Die Arbeit hält sich an die Erklärung der Helsinski und der ARVO Tiererklärung. Die Tiere wurden für die Gewebesammlung nach den Anweisungen der Tierhaltung an der Universität Dresden verwendet und alle relevanten Methoden verfolgt. Die Tiere wurden behandelt und untergebracht nach den Bundesrichtlinien für die Nutzung und Pflege von Labortieren, und die Studie wurde von der Landesdirektion Dresden genehmigt. Bitte wenden Sie sich an die Veterinärpolitik Ihrer Institution (IACUC oder andere board) zu entsprechenden Euthanasie-Methodik.

Besondere Lager-und Arbeits Konzentrationen der Reagenzien in den dieses Protokoll beigefügten Tabellen Reagenz gefunden werden.

1. Kulturschale Vorbereitung

1. Coat Gerichte mit einem ausreichenden Volumen von 75 ug / ml Poly-L-Ornithin (dh 2 ml / Well einer 6-Well-Platte) über Nacht in der Zellkultur-Inkubator 2 Tage vor dem geplanten Datum Dissektion.
2. Nehmen Sie die letzte Wäsche, dann fügen Fibronektin (1:250 verdünnt, 4 ug / ml in PBS) auf die Platte und legen die Gerichte in den Inkubator über Nacht.
3. Saugen Sie den Fibronektin am Tag der Präparation und waschen das Geschirr 2x mit PBS. Bringen Sie die Platten noch mit der endgültigen PBS zu waschen, um den Brutschrank, bis die dissoziierten Gewebe ist bereit für die Kultivierung. Zu dieser Zeit, entfernen Sie die PBS vor, um die Gewebebeschichtung.
4. Mit Poly-L-ornithinein den Inkubator für bis zu 3 Wochen beschichtet Speicher-Platten. Platten mit Fibronectin beschichtet ist, kann für bis zu 1 Woche gelagert werden. Fibronektin-Beschichtung kann in weniger als 2 Stunden durchgeführt werden, wenn dringend. Fibronektin ist anfällig für Denaturierung, nicht die Lösung zu rühren oder lassen Geschirr trocknen.

2. Dissection / Auflage

1. Dieses Protokoll gilt für die Verwendung von 3 erwachsenen Ratten (3-6 Monate alt).
2. Chill das Gehirn vor dem Einschläfern die Ratte Schnittblock auf Eis.
3. Legen Sie ein 15 ml-Falcon-Röhrchen, die 5 ml N2 Medium mit bFGF auf Eis enthält.
4. Euthanize die Ratten nach Veterinärpolitik Ihrer Einrichtung.
5. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel durch einen Einschnitt auf der Mittellinie des Kopfes. Verwenden Pinzette abziehen der Knochen so dass für das Gehirn vorsichtig herausgezogen werden.
6. Legen Sie das Gehirn in einer 10 cm Petrischale mit eiskaltem PBS. Dadurch werden alle Rest Haar und Blut zu entfernen. (1A)
7. Legen Sie das Gehirn in den Schneideblock gekühlt. (1B)
8. Stecken Sie eine neue, saubere Rasierklinge in den Block wie in 1C dargestellt.
9. Legen Sie eine zweite saubere Rasierklinge 3 mm kaudal der ersten wie in 1D dargestellt.
10. Die Blätter vorsichtig anheben aus dem Block, und mit ihnen den Abschnitt von Interesse.
11. Float der SECTion vor der Klinge durch Eintauchen in PBS. (1E)
12. Ernte Gewebe aus dem Bereich von Interesse (in diesem Beispiel verwendeten wir die vordere Kommissur (anterior) ACA, 1F) unter Verwendung von # 5 Pinzette und Sammeln in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml N2-Medium, das bFGF.
13. Bewegen des Rohres in einer laminaren Strömung Zellkulturhaube, weiterhin den Rest des Protokolls unter sterilen Bedingungen.
14. Mechanisch distanzieren das Gewebe mit einer 1 ml Pipettenspitze auf eine P1000 Pipette befestigt. Pipette nach oben und unten mehrmals (ca. 20x mit einer Rate von 1 Pipettieren Zyklus pro Sekunde), während Sie die Öffnung der Pipettenspitze an der Unterseite des konischen Rohrs (Abbildungen 1G 1-3). Verreiben stoppen, wenn die Lösung homogen.
15. Lassen Sie die Lösung für 2 Minuten ruhen lassen, damit ein größeres nondissociated Gewebe am Boden absetzen. (1G 4)
16. Sammeln Sie die homogeneous Überstand und in einen konischen Röhrchen mit 8,5 ml N2 Medien plus 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2 und 200 nMJAK Inhibitor.
17. Platten sie in drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 3 ml verdünnten Zelllösung / gut.
18. Die Platte wird in einer befeuchteten Zell Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2, 5% O _2.

3. Daily Care

1. Ersetzen Sie das Medium, auf den Kulturschalen mit N2-Medium, das bFGF, Ang2, Dll4 und JAK Inhibitor 24 Stunden nach dem Ausstreichen.
2. Fügen Sie einen Bolus von bFGF, Dll4, Ang2 und JAK-Inhibitor auf den nächsten Tag.
3. Setzen Sie diesen Wechsel Prozess der Medienwechsel und Ergänzungen Faktor für insgesamt 10-14 Tage.

4. Induktion der Differenzierung

1. Ziehen bFGF, Dll4, Ang2 und JAK-Inhibitor enthält, mittel-und ersetzen Sie es mit N2-Medium, das keine zusätzliche Faktoren enthält.
2. Ändern Sie jeden zweiten Tag das Medium.
3. Befestigen Sie die Zellen nach 10 Tagen und durchzuführen, Immunzytochemie.

5. Immunzytochemische Erkennung

1. Saugen Sie das Medium und fixieren Zellkultur-Platten mit 2 ml 4% Paraformaldehyd für 20 min.
2. Wasch 2x mit 3 ml PBS für jeweils 5 min.
3. Aspirat PBS permeabilisiert und dann blockieren die Zellen durch Zugabe von 2 ml PBS mit 5% normalem Eselserum (NDS) und 0,1% Triton X-100 für 20 min.
4. Bereiten Sie den primären Antikörper-Mix in PBS mit 5% NDS. Anti-Nestin-Antikörpers zur Identifizierung VZ verwendet werden, während TuJ1 (Klasse III β-Tubulin), GFAP und CNPase Antikörper können zusammen für eine Dreifachfärbung von Differenzierungsmarkern verwendet werden.
5. Absaugen Blockierungslösung und 1,5 ml der primären Antikörpermischung in jedes Well. Inkubieren bei Raumtemperatur für 90 min.
6. Entfernen der Primärantikörper und 2x Waschen mit 3 ml PBS, und 1x mit 3 ml PBS, enthaltend 5% NDS für jeweils 5 Minuten.
7. Prepare die Sekundärantikörper in PBS mit 5% NDS.
8. Saugen Sie den letzten Waschen und fügen Sie 1,5 ml Sekundärantikörperlösung in jede Vertiefung. Inkubieren im Dunkeln für 40 min bei Raumtemperatur.
9. Entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und 2 ml einer frisch hergestellten DAPI-Färbung (500 ng / ml in PBS). Inkubation für 3 min.
10. Saugen Sie den DAPI-Lösung dann waschen 3x mit 3 ml PBS für jeweils 5 min. Die Zellen können nun mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

Representative Results

Identifizieren des interessierenden Bereichs, von dem neuralen Stammzellen zu ernten ist die kritische erste Stufe und die Zeit, die es braucht, um einen konfluenten Platte von Zellen zu definieren. Zum Beispiel ist das SVZ eine klassische neurogener Bereich und hat daher einen höheren relativen Anteil von neuralen Stammzellen. Jedoch kann das hier vorgestellte Verfahren mit anderen Regionen nicht oft eine robuste neurogene Potential im Erwachsenenalter erkannt werden. Für die Zwecke dieses Protokolls haben wir die Commissura anterior (vorderer Teil). Während einige der Zellen und Zelltrümmer werden bei der Beschichtung zu regeln, wird das Medium in der Regel trübe bleiben als Folge der Menge von Zellmaterial, das vorhanden ist folgende Verreiben. Der erste Mediumwechsel nach 24 Stunden wird die Mehrheit der diese zu entfernen. Wie durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden scheint es eine große Menge des verbleibenden zellulären Materials, zusammen mit Blutgefäßen, auch nach dem ersten Mediumwechsel. Im Laufe vondie nächsten Tage, werden Kolonien von einer deutlichen wuchernden Zellpopulation unter dem Mikroskop (Abbildung 2A) werden sichtbar. Dies sind die neuralen Stammzellen, die für das Wachstum durch die Verwendung von N2-Medium mit bFGF, Ang2, Dll4 und JAK-Inhibitor ausgewählt wurden. Zusätzlich kann eine längliche Spindel artigen Zellpopulation vorhanden (Fig. 2B und sein   C). Diese sind nicht neuronalen Stammzellen (radiale Gliazellen wahrscheinlich auf Morphologie und Färbung basiert), werden sie schließlich durch die schnellere proliferierenden neuronalen Stammzellpopulation überholt werden. Im Verlauf von einer Woche bis 14 Tagen werden die Zellen dichter werden, bis sie Konfluenz (Fig. 2D) zu erreichen. Diese Kulturen positiv färben für eine Reihe von Stammzellmarkern, einschließlich Nestin, Hes3 und Sox2. (2E-H), wodurch das Vertrauen, dass die Zellpopulationen, die ausgewählt und erweitert worden sind, sind in der Tat neuralen Stammzellen.Eine weitere Bestätigung wird von der Fähigkeit zum Entzug FGF aus dem Medium, so dass die Zellen für 10 Tage zu unterscheiden, Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten (2I) zu erzeugen.

Figur 1: Isolierung von Rattengehirnschnitten zum Ernten adulten neuralen Stammzellen. A) Erwachsene Rattenhirn nach dem Waschen mit PBS. B) Rattenhirn in ein gekühltes Edelstahlschneideblock platziert. C) Ungefähre Positionierung der Anfangs Rasierklingen innerhalb des Blocks zu koronalen Abschnitte des Gehirns. D) Platzierung von 2 zusätzlichen Rasierklingen produzieren in den Schneideblock. Hinweis wurden dünner zweischneidiges Messer zu Demonstrationszwecken verwendet werden, um für eine einfachere Darstellung der s ermöglichenSpiegelungen in den Block. E) Koronare Hirnschnitte enthält Bereichen, geerntet werden. F) Schematische Darstellung der Hirnatlas Paxinos Hervorhebung der Subventrikularzone als klassische neurogenen Region und die vordere Kommissur, aus denen Zellen wurden für dieses Protokoll geerntet. G) Sequential Bilder der Gewebedissoziation Verfahren unter Verwendung einer 1 ml Pipettenspitze auf eine P1000 Mikropipette befestigt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2: adulten neuralen Stammzellen in vitro. A) adulten neuralen Stammzellkultur nach einer Woche. B) Beispiele für eine breitere Spindelzellen Morphologie (red Pfeile) gelegentlich in den Kulturen, die nicht neuronale Stammzellen. C, D) unter den Kulturbedingungen in diesem Protokoll definiert Derzeit sind die neuralen Stammzellen bevorzugt erweitern. EH) Expression von neuronalen Stammzellmarker nach 14 Tagen in vitro, Sox2 (grün) (E), HES 3 (rot) (F) und Nestin (violett) (G). I) Differenzierung der neuralen Stammzellen zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Nach Mitogen Rückzug wurden die Zellen erlaubt, für 10 Tage zu differenzieren, dann für GFAP (grün) immun, TuJ1 (rot), und CNPase (blau). J) Hes3 Immunfärbung im Gehirn einer erwachsenen Ratte. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Viele der Schritte für eine erfolgreiche Isolierung, Expansion und Differenzierung von neuronalen Stammzellen aus adulten Gehirn sind gemeinsam mit Standardgewebekulturtechniken geteilt. Das Ziel zu bedenken ist, dass NSCs aus dem erwachsenen Gehirn isoliert als viele ihrer in-vivo-Eigenschaften wie möglich (2J) zu halten. Oft ist eine Balance zwischen notwendigen Vorsicht und angemessener Geschwindigkeit muss gefunden werden. Pflege mit der Isolierung des Gehirn aus dem Schädel machen die Identifikation der Region von Interesse deutlich erleichtert. So schnell wie möglich Entfernen des Gewebes folgenden Tier euthanization, und halten das Gehirn Kälte während der Ernte und Waschen hält sie steifer und große Hilfe beim Umgang mit dem Gewebe, wenn es in der Edelstahl-Schnittform platziert wird. Dies minimiert auch das Potential für das Zerreißen des Gewebes während des Schneidevorgangs. Das Protokoll profitiert auch davon, dass ablE, um die Zellen zu dem Punkt schnell Beschichtung zu erhalten, als dies erhöht die Lebensfähigkeit der Zellen, wenn sie in vitro befinden. Die richtige Gewebewasch vor dem Schneiden trägt auch zur Reduzierung des Potenzials der Kontamination in den Kulturen. Während des Zersetzungsvorgangs sollte Verreiben mit einer 1 ml-Pipettenspitze kräftig sein, aber in einer Weise, um nicht überschüssige Luftblasen oder Schaumbildung der Zellsuspension, die sich negativ auf das Überleben der Zelle zu erzeugen, durchgeführt. Die erste Mediumwechsel ist auch entscheidend, wie es die meisten der nicht gebundenen Zellen und Zelltrümmern, die aus dem Gewebe Dissoziation, die Faktoren, die schädlich für die anfängliche Überleben der Stammzellen Zellpopulation enthält, ergibt entfernt. Für eine verbesserte Visualisierung folgenden Immunfärbung können die frisch isolierten Zellen auf 25 mm Glasdeckgläsern in der Unterseite der 6-well Platten plattiert werden. Die Konzentrationen an Poly-L-Ornithin und Fibronektin bei der Beschichtung verwendet auf 500 ug / ml und 20 μ erhöht werdeng / ml. Als Alternative können mehrere kleinere Deckgläser (dh 12 mm) in jede Vertiefung gegeben werden. Diese können dann für unabhängig Immunfärbung in separaten Wells einer 24-Well-Platte, der Verringerung der Mengen von Nachweisreagenzien zur Berücksichtigung der kleineren Volumina nehmen verarbeitet werden. Die Deckgläser werden dann auf Objektträger mit einem Standard-Montage wässrigen Medium montiert.

Definieren der Anwesenheit von NSCs im erwachsenen Gehirn ist von großem Interesse auf dem Gebiet der Neurobiologie. Es gibt zwei allgemeine Ansätze, um eine Stammzelle zu identifizieren. In einem, kann ein Satz von Biomarkern basierend auf einem Genexpressionsprofil der Stammzellpopulation in Frage Bild sie durch Immunhistochemie verwendet werden. Obwohl experimentell einfach, es gibt keine funktionellen Daten, noch legt fest, ob die Zellen die grundlegenden Eigenschaften von Stammzellen haben die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern oder zu differenzieren in mehreren verschiedenen Zelltypen. In dem anderen Ansatz werden die Zellen in E isoliertither eine reine oder heterogene Bevölkerung, in Kultur gebracht und dort Selbsterneuerung und multi Eigenschaften werden mit dem lebenden Zellpopulation bewertet. Dieser Ansatz gibt funktionellen Daten, und kann verwendet werden, eindeutig zu beweisen "stemness" in diesen speziellen Versuchsbedingungen in vitro werden. Allerdings hat die Schwierigkeiten mit der Aufrechterhaltung dieser Zellen in der Kultur dieses zweiten funktionalen Ansatz behindert. In der Tat hat die Unfähigkeit, NSCs aus anderen Bereichen des Gehirns wachsen den Eindruck, dass es nur wenige spezialisierte Nischen, in denen sie wohnen, links.

Das hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die Kultivierung von NSC aus vielen verschiedenen Bereichen des ZNS. Diese Technik basiert auf unserer Arbeit, die einen Signalübertragungsweg von großer Bedeutung für die Steuerung der Anzahl von NSC in vitro und in vivo erläutert berechnet. Die in diesem Protokoll enthaltenen Faktoren wurden auf der Grundlage umfangreicher Studien der Signaltransduktion ausgewähltUnd zeigt, dass sie zu fördern NSC Wachstum über einen gemeinsamen Transkriptionsfaktor Hes3. Unsere bisherigen Untersuchungen zeigen, dass diese besondere Kombination ergab einen noch größeren Anstieg der NSC Zahlen im Vergleich zu den mit ihnen individuell. Die Wahl, welche pharmakologische Träger wird zu der Kultur zugegeben wird, sollte im Zusammenhang mit der Biologie untersucht, betrachtet werden. Zum Beispiel, während sowohl Ang2 Dll4 und haben einen positiven Einfluss auf das Wachstum NSC, haben sie entgegengesetzte Effekte auf Gefäßbildung ^22,23. Durch weitere Optimierung der Kulturbedingungen, werden weitere neue Biomarker über Hes3 wahrscheinlich identifiziert werden und die Zahl der anerkannten NSCs im erwachsenen Gehirn noch weiter ausbauen. Dies wird durch unsere Beobachtungen veranschaulicht, dass Unterschiede zwischen den Hes3 +-Zellpopulation aus verschiedenen Gehirnbereichen vorgenommen werden können. Zum Beispiel Hes3 +-Zellen aus dem Rückenmark, wie die von der SVZ und ACA, zeigen einen mehrfachen Anstieg in der Anzahl, wenn mit diesen kultiviertenFaktoren. Zusätzlich kann Hes3 +-Zellen aus diesen Regionen effizient zu erzeugen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Allerdings ist die Morphologie und die Genexpression der differenzierten Zelltypen nicht identisch. Weitere Biomarker, die unter verschiedenen Hes3 + Zelltypen unterscheiden, wird eine willkommene Ergänzung zu dem Feld sein. Die hier vorgestellte so dass für die effiziente Erzeugung von NSC Kulturen Verfahren kann als Werkzeug zur Erreichung dieses Ziels verwendet werden.

Wie das NSC Marker Nestin und Sox2, der Transkriptionsfaktor Hes3 identifiziert eine Zellpopulation, die nach der Isolierung kann in vitro vermehrt werden sowie in den Hauptzelltypen, die das Nervensystem, Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten ¹¹ bilden differenziert. Doch im Gegensatz zu dieser häufig verwendeten Marker, Hes3 identifiziert auch Ruhe NSCs, als Folge, viele Hes3 + Zellen nicht Indikatoren der Mitose ⁽³ H-Thymidin oder BrdU) unter homöostatischen c integrierenie Bedingungen (und damit haben klassische Detektionstechniken vermieden). Anwendung der hier beschriebenen Protokoll wurde in der Entdeckung dieser NSC Bevölkerung fundamental. Die Anzahl der Zellen in der Kultur erhöht, wenn sie mit Faktoren aus dem vaskulären Endothel erzeugt, einschließlich des Notch-Liganden Delta4 und Angiopoetin2 Einklang mit ihrer Lokalisierung in vivo perivaskuläre ²⁴ behandelt.

Mit leichten Zugang zu diesen Zellen aus adulten Gehirn isoliert ermöglicht Experimente zu untersuchen, wie die Zellen reagieren auf die Signaltransduktion Ebene verschiedener Faktoren, und bietet einige prädiktive Hinweise darauf, wie sich die Zellen in vivo reagieren. Der Blick über regenerative Medizin, haben wir gezeigt, dass die hier beschriebenen Kulturbedingungen haben Bedeutung für die Krebsforschung als auch. Sie repräsentieren die Umwelt besser, dass Krebsstammzellen von Glioblastoma multiforme isoliert Erfahrungen während bei den Patienten, so dass für die Studie of Signalwege, die manipuliert werden können, um ihr Wachstum zu ³⁰ ablehnen können. Die breite Anwendung dieser Technik könnte erhebliche Auswirkungen auf verschiedene Aspekte der Forschung und Medizin zu haben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit