Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Summary

Yetişkin beyin hasat nöral kök hücreler sinir sistemi gelişiminin temel araştırma rejeneratif tıpta potansiyel klinik uygulamaları keşfetmek için çeşitli uygulamalar kullanılmaktadır artmaktadır. Bu deneysel sonuçların ses için kritik bu hücreleri büyümek için kullanılan yalıtım ve kültür koşullarında titiz kontrolü yapar.

Abstract

Son çalışma merkezi sinir sistemi (MSS) rejenerasyon ve tümörgenez kök hücre popülasyonları (AVM'ler) yetişkin beyin içinde ikamet içerdiğini göstermektedir. Ancak bu mekanizmalar normal olarak sakin hücrelerinin uygun sinir ağlarının işleyişini yanı sıra nörodejeneratif süreçlerin yaralanma ve azaltılması kurtarma rollerini sağlamak için istihdam çok az anlaşılmıştır. Bu hücreler, vasküler ve bağışıklık sistemi hem de düzenleyici sinyallerini içeren bir idame ettiren bir ortam sağlamak "niş" olarak adlandırılan bölgelerde bulunur. Bilinmeyen faktörler hariç belirlenen kültür koşulları altında MSS AVM'ler arasında izolasyon, bakım ve farklılaşma, böylece in vivo davranışları içgörü sağlayarak, farmakolojik veya genetik yollarla tedaviye onları erişilebilir kılar. Burada yetişkin beynin farklı bölgelerinden gelen MSS AVM'ler kültürlerini oluşturmak için yöntemler hakkında detaylı bilgi sunmak ve onların d değerlendirmek için yaklaşımlarnöronlar, astrositler ve in vitro oligodendrosit içine ifferentiation potansiyeli. Bu teknik, tek tek SC'ler ve döl çalışma görselleştirilebilir tek tabakalı bir kültür olarak homojen bir hücre popülasyonu elde edilir. Bundan başka, farklı hayvan modeli sistemlerinde ve klinik örnekler arasında uygulanabilir hasarlı yetişkin sinir sisteminin rejeneratif tepkileri tahmin etmek için daha önce kullanılan edilir.

Introduction

Bir yüzyıl önce Ramón Y. Cajal tarafından yapılan beyin hücre mimarisini temel gözlemler tarafından belirlenen nörobiyoloji santral dogma, ergenlik MSS ^1. bulunan sinir ağlarının karmaşıklığı verilen sonra nöron olası olduğunu düzenledi. 1960'larda Altman iş, ve sonra Kaplan, ³ H-timidin aslında nöronlar yetişkin beynin farklı bölgelerinde üretilen belirten olgun nöronlarda bulunan olabileceğini gösteren rağmen, dogma ^{2, 3} tutmaya devam etti. Kanıt songbird beyinlerinde ⁴ mevcut nöronların sayısında mevsimsel değişiklikleri açıklayan Nottebohm araştırma ile bağlamaya devam etti. 1999 yılına kadar değildi zaman sıçan ilişkisel öğrenme görevlerin performansı yanı sıra Kornack ve Rakic ​​gösteriler yo gözlemleri ile hipokampus artar nöronların nesil Gould ve ark. Yayınlanmış çalışmasıting, daha az sert, fazla plastik beyin kavramı, ⁵ kabul edilmiş yetişkin ^{makak, 6} nörogenezi devam etmiştir.

Bu de novo oluşturulan nöronlar için hücresel kaynak için arama ⁷ nişler olarak adlandırılan beyin bölgelerinde bulunan kök hücreler (SCS) ayrı bir nüfusun keşfedilmesine yol açmıştır. Subventricular bölgesi ve hipokampus alt granül bölgesi, iki ana bölge nörojenik ^8,9 olarak kabul edilir. Bu yerlerde izole hücreler klasik embriyonik veya fetal kaynaklı AVM'ler karakteristiği, kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeli göstermektedir. Nöral kök hücreler (NSC'lerde) durumunda, bu nöronlar, astrositler ve oligodendrositler farklı olabilir. Ayrıca, bu SC'ler, ara filament protein Nestin ¹⁰ fetal NSC belirteçleri için pozitif leke. Daha yeni çalışmalar AVM'ler bu t sınırlı olmayabilir vurgulamaktadıralanları wo ve aslında sıkıca damar ¹¹ ile bağlantılı bir hücre popülasyonu olarak büyük ölçüde hareketsiz beyin boyunca lokalizedir.

AVM'ler yaralanmaya yanıt olarak seferber olan gözlemler nörodejeneratif bozukluğu ve felç ^{12, 13} kurtarma yardım rejeneratif amaçlı bu hücreleri kullanmak mümkün olma olasılığını göstermektedir. Bu osteoblastlar, kıkırdaklan ve yağ hücreleri ¹⁴ olma potansiyeline sahip perivasküler hücreler olarak bulunan mezenkimal kök hücreler (MKH) bağ dokularının iyileşmesi oynadığı rol, farklı değildir. Bununla birlikte, NSC'lerde rutin aspirasyon ve yoğunluk dereceli santrifüj teknikleri ile kemik iliğinden MSC ile aynı şekilde hasat edilemez ve ardından otolog hücre bazlı terapiler olarak kullanılmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, bu tür EMB türetilen fetal NSC'lerde veya nöronal öncülerinin kullanımı gibi diğer hücre kaynakları,ryonic kök hücreler yoğun bir başarı ¹⁵ dereceleri değişen hayvan hastalık ve yaralanma modellerinde araştırılmıştır. Somatik hücre kaynakları kullanarak uyarılmış pluripotent kök hücre teknolojileri kısıtlı olduğu ve embriyonik hücre ve fetal dokular ¹⁶ kullanımı ile ilgili endişeler etik üstesinden, geniş bir uygulama yelpazesi için terapötik açıdan yararlı, hücre bazlı terapiler üretilmesi için bir diğer potansiyel bir yol sunar. Ancak, bu bulguların klinik çeviri ^17,18 yanı sıra, düzenleyici izni için dolambaçlı bir yol yaklaşımlar SC-temelli terapötik ile çeşitli nörolojik durumların tedavisi mücadelelerde gösterdiği gibi, zor bir görev olduğunu kanıtlamıştır. Alternatif bir yaklaşım olarak, belirli bir farmakolojik tedavilerin giriş NSC sayıda modüle eden ve Parkinson hastalığı ve felç ¹⁹ modellerinde kurtarma kolaylaştırabilir. Strateji, etkili bu hücreleri manipüle etmek için nasıl bir anlayış olabilir ne olursa olsunerişilebilir bir in vitro sistemi gerektirir.

NSC'lerde kültürleri, aynı zamanda olarak da bilinen neurospheres toplam kültürleri, ya bir tek tabaka ya da ^8,20 olarak gerçekleştirilebilir. Her iki teknik, yaygın multipotent öncülerinin genişletilmesi için kültür koşulları sağlamak tanımlanan, bir mitojen kaynağı olarak Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) veya bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) yani kullanım kurulması için izin kullanılmıştır. Neurosphere kültürleri, bir izole edilmiş hücre tipi klonal yayılma yeteneği eğitim için daha uygun olsa da, sistem ²¹ genişlemesi sırasında hücrelerin karışık bir popülasyonunun üretilmesi için gösterilmiştir. Buna ek olarak, neurospheres kapalı yapısı, hücrelerin manipülasyonu farmakolojik pratik hale getirir, ve bu faktörler olabilir etkisi nedeniyle yorumlanması neurosphere kendi içinde kurulmuş olan mikro için eleştirilmiştir edilebilir. Tek tabakalı kültürleri, diğer taraftan, olabilir,SC büyümesini ve farklılaşmasını düzenleyen ve özellikle bu hücre popülasyonu hedef yeni bileşikler keşfetmek için bir fırsat açılır sinyal iletim mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir araç sağlayarak, küçük molekül kütüphanelerin yüksek kapasiteli ekranlarında istihdam.

Sonuç olarak, yeniden üretilebilir beyinde ilgi farklı bölgelerinden yetişkin NSC'lerde kültürleri üretmek için yeteneği, merkezi sinir sistemi (MSS) gelişme çalışmalarından gelen yeni yaklaşımlar içinde rejeneratif ilaç kadar, araştırma uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılabilir . Burada sunulan protokol incelemek ve erişkin kemirgen beyin izole MSS AVM'ler arasında farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için nasıl gösterir.

Protocol

Iş Helsinski Deklarasyonu ve ARVO Hayvan Bildirimi yapışır. Dresden Üniversitesi Hayvan tesisin talimatlarına göre Hayvan doku toplanması için kullanıldı ve ilgili yöntem takip edildi. Hayvanlar ele ve ev sahipliği laboratuvar hayvanlarının kullanımı ve bakımı için Alman Federal kurallarına göre ve çalışma Landesdirektion Dresden tarafından onaylandı edildi. Uygun ötenazi yöntemi konusunda kurumunuzun veteriner politikası (IACUC veya diğer yönetim kurulu) danışın.

Özel stok ve reaktiflerin çalışma konsantrasyonları bu protokolü eşlik Reaktif Tablolar bulunabilir.

1.. Kültür Bulaşık Hazırlık

1. 75 ug yeterli bir hacmi ile Coat tabaklar / ml poli-L-ornitin (örneğin 2 ml / oyuk, 6 oyuklu plaka) bir karışımı, 2 gün önce, planlanan diseksiyon bugüne kadar hücre kültürü kuluçka makinesi içinde.
2. Nihai yıkama çıkarın, daha sonra plaka fibronektinin (1:250 seyreltilmiş PBS'de 4 ug / ml) ekleyin ve gece boyunca inkübatör bulaşıkları yerleştirin.
3. Diseksiyon gününde fibronektin aspire ve yemekleri PBS ile 2x yıkayın. Hala ayrışmış doku kültürü için hazır olana kadar nihai PBS inkübatör yıkayın içeren plakaları dönmek. O zaman, doku kaplama için PBS önce çıkarın.
4. Kadar 3 hafta için kuluçka poli-L-ornithinein ile kaplanmış plakalar deposu. Fibronektin ile kaplı plakalar kadar 1 hafta boyunca depolanabilir. Acil ise Fibronektin kaplama az 2 saat içinde yapılabilir. Fibronektin denatürasyona açıktır; çözüm ajitasyon ya da yemekleri kurumasını izin vermeyin.

2. Diseksiyon / Kaplama

1. Bu protokol, 3 yetişkin farelerin (yaş 3-6 ay) kullanımı için geçerlidir.
2. Chill önce sıçan ötenazi için buz üzerinde blok kesit beyin.
3. Buz üzerine eklendi bFGF ile N2 ortam 5 ml ihtiva eden bir 15 ml Falcon tüpü yerleştirin.
4. Kurumunuzun veteriner politikasına göre fareler Euthanize.
5. Başın orta hat aşağı bir kesi yaparak kafatası beyin çıkarın. Dikkatli ekstre edilecek beyin için izin kemik soyulmaya forseps kullanın.
6. Soğuk PBS içeren bir 10 cm Petri kabı içine beyin yerleştirin. Bu herhangi bir kalıntı saç ve kan kaldıracaktır. (Şekil 1A)
7. Soğutulmuş kesit bloğu içine beyin yerleştirin. (Şekil 1B)
8. Şekil 1C resimde olduğu gibi blok içine bir yeni temiz bir jilet yerleştirin.
9. Şekil 1D 'de gösterildiği gibi birinci, ikinci temiz bir traş makinesi bıçak 3 mm kaudal yerleştirin.
10. Dikkatle onlarla ilgi bölümünü alarak, blok bıçakları kaldırın.
11. Sec FloatPBS içinde daldırarak bıçağı kapalı masına neden. (Şekil 1 E)
12. Ilgi alanından hasat doku # 5 forseps kullanarak (bu örnekte biz ön komissura, (anterior) ACA, Şekil 1F kullanılan) ve bFGF içeren 1 ml N2 ortamı içeren 15 ml konik tüp içine toplamak.
13. Steril koşullar altında protokol kalan devam eden, bir laminar akış başlığı hücre kültürü içine borusunu.
14. Mekanik bir P1000 pipet bağlı 1 ml'lik bir pipet kullanarak doku ayırmak. Yukarı ve aşağı pipet birkaç kez (yaklaşık 20x saniyede 1 pipet döngüsünün bir oranda) konik tüp (Şekil 1G 1-3) tabanına karşı pipet açılışını basarken. Çözelti homojen hale geldiğinde öğütme durdurun.
15. Çözüm daha büyük herhangi nondissociated doku altına yerleşmek için izin vermek için 2 dakika bekletin. (Şekil 1G 4)
16. Homojen toplayıneous süpernatan ve N2 ortamı içinde 8.5 ml ve 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2 ve 200 nMJAK inhibitörü içeren bir konik tüp içine yerleştirin.
17. 3 seyreltilmiş hücre çözeltisinin ml / çukur kullanılarak 6-kuyulu plakanın kuyularına 3 Plate.
18. 37 ° C,% 5 _CO2,% 5 _O2 nemlendirilmiş bir hücre kuluçka makinesi içine levha yerleştirin.

3. Günlük Bakım

1. Kaplama 24 saat sonra inhibitör bFGF'yi, Ang2, Dll4, ve JAK içeren N2 Ortamı ile kültür yemekleri orta yerine.
2. BFGF, Dll4, Ang2 ve bir sonraki gün JAK inhibitörünün bir bolus ekleyin.
3. Ortam değişim ve 10-14 gün toplam etken eklemeler bu alternatif işleme devam edin.

4. Farklılaşma indüksiyon

1. Ortamı içeren inhibitörü bFGF'yi, Dll4, Ang2 ve JAK'ı çekilme ve herhangi bir ek faktörleri içermiyor N2 ortamı değiştirin.
2. Her ikinci gün orta değiştirin.
3. 10 gün sonra hücreler saptamak ve immünositokimya gerçekleştirin.

5. Immünositokimyasal Algılama

1. Ortam aspire ve 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehid, 2 ml hücre kültürü plakaları düzeltin.
2. 5 dakika her biri için, 3 ml PBS ile yıkayın 2x.
3. PBS aspire, sonra geçirgen ve 20 dakika boyunca% 5 normal eşek serumu (NDS) ve% 0.1 Triton X-100 içeren PBS içinde 2 ml ekleyerek hücreleri bloke eder.
4. % 5 NDS içeren PBS birincil antikor karışımı hazırlayın. Tuj1 (sınıf III β-tubulin), GFAP ve CNPase antikorlar farklılaşma işaretlerinin üçlü boyanması için birlikte kullanılabilir ise anti-Nestin antikoru, SC'ler belirlenmesi için de kullanılabilir.
5. Engelleme çözeltisi aspire ve de her bir birincil antikor karışımı 1.5 ml. 90 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
6. Birincil antikorlar çıkarın ve 3 ml PBS ile 2 kez yıkama, ve her biri 5 dakika boyunca 5% NDS ihtiva eden PBS içinde 3 ml 1x.
7. Prepare PBS içinde% 5 ikincil antikorlar NDS ihtiva etmektedir.
8. Nihai yıkama aspire ve de her bir sekonder antikor çözeltisi 1,5 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 40 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin.
9. İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve taze hazırlanmış bir DAPI leke 2 ml (PBS içerisinde 500 ng / ml) ilave edilmektedir. 3 dakika boyunca inkübe edin.
10. DAPI çözeltisi aspire daha sonra 5 dakika her biri için, 3 ml PBS ile 3 kez yıkayın. Hücreler artık bir floresan mikroskobu ile görselleştirilebilir.

Representative Results

Nöral kök hücreleri toplamak için hangi ilgi bölgeyi belirlenmesi kritik ilk adımdır ve bu hücrelerin birleşen bir plaka almak için gereken süreyi tanımlar. Örneğin, SVZ klasik nörojenik bir alandır ve dolayısıyla nöral kök hücre, daha yüksek bir göreceli bir oran vardır. Ancak burada sunulan teknik genellikle yetişkinlik döneminde sağlam bir nörojenik potansiyele sahip olarak tanınan değil diğer bölgelerde kullanılabilir. Bu protokolün amaçları için, ön komissura (ön kısım) kullanılır. Hücre ve döküntü bir kaplama üzerine yerleşmek da, normal olarak ortam şu toz haline hücresel malzeme miktarının bir sonucu olarak, bulanık kalır. 24 saat sonra ortam değişikliği, bu ilk olarak büyük çoğunluğunu kaldırır. Işık mikroskobu ile görselleştirildiği gibi, daha ilk ortam değişikliği, kan damarları ile birlikte, geri kalan hücre malzemesi, büyük miktarda olması görünür. Seyri boyuncaÖnümüzdeki birkaç gün, ayrı bir proliferatif hücre popülasyonu kolonileri mikroskop (Şekil 2A) altında görünür hale gelecektir. Bu bFGF, Ang2, Dll4 ve JAK inhibitörü içeren N2 ortamının kullanımı ile büyümesi için seçilmiştir nöral kök hücrelerdir. Buna ek olarak, daha uzun aks-benzeri hücre nüfusu da (Şekil 2B ve mevcut olabilir   C). Bunlar (muhtemelen radyal glial morfolojisi ve boyama dayalı) nöral kök hücreler değil, onlar sonunda daha hızlı çoğalan sinir kök hücre nüfusun gerisinde olacaktır. Onlar izdiham (Şekil 2B) ulaşıncaya kadar 14 gün için bir hafta boyunca, hücreler daha yoğun olacak. Bu kültürler Nestin, Hes3 ve Sox2 dahil kök hücre işaretleyicileri, bir dizi için pozitif leke. (Şekiller 2E-H), böylece seçilmiş ve genişletilmiştir hücre popülasyonları gerçekten sinir kök hücreleri olduğu güven sağlar.Başka bir onay da, ortamdan çekilmesi FGF yeteneği gelen hücreler nöronlar, astrositler ve oligodendrositlerin (Şekil 2I) oluşturmak üzere 10 gün boyunca ayırt etmek için izin verir.

Şekil 1: hasat yetişkin nöral kök hücrelerin sıçan beyin bölümlerinin İzolasyonu. 2 ek Jilet koronal beyin bölümleri. D) üretmek için Yerleştirme bloğu içindeki ilk tıraş bıçaklarının blok kesit bir soğutulmuş paslanmaz çelik içine yerleştirilmiştir, PBS ile yıkandıktan sonra A) yetişkin fare beyni. B) Sıçan beyni. C) Yaklaşık yerleştirme kesit blok içine. Not ince çift taraflı bıçaklar s kolay görünüm için izin gösteri amaçlı kullanılan. F) klasik nörojenik bölge olarak subventricular bölgeyi vurgulayarak Paxinos beyin atlas şematik diyagramı, ve hücreler bu protokol için hasat edildikleri ön komissura hasat edilecek alanlar içeren blok enfeksiyonların. E) Koronal beyin bölümleri. G) P1000 mikropipetöre bağlı bir 1 ml pipet kullanarak doku ayrışma sürecinin ardışık görüntüler. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2: in vitro Yetişkin nöral kök hücreler. Daha geniş iğ morfoloji hücrelerinin (yeniden A) Yetişkin sinir kök hücre kültürü, bir hafta sonra. B) ÖrneklerBu protokolde tanımlanan kültür koşullar altında nöral kök hücreler. C, D) olmayan kültürlerde bazen mevcut d oklar), nöral kök hücreler tercihen genişletin. EH) nöral kök hücre belirteçleri Anlatım vitro, Sox2 14 gün sonra (yeşil) (E), Hes 3 (kırmızı) (F), ve Nestin (mor) (G). I) nöronlar, astrositlerde ve oligodendrositler nöral kök hücrelerin farklılaşması. Mitojendir çekilmesi ardından, hücreler GFAP (yeşil) için immunohistokimyasal sonra, 10 gün boyunca ayırt etmek için izin verildi, Tuj1 (kırmızı) ve CNPase (mavi) erişkin sıçan beyninde. J) Hes3 İmmünbüyanmanın. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Discussion

Başarılı izolasyon, genişleme, ve yetişkin beyin nöral kök hücrelerin farklılaşması için kritik adımların birçok standart doku kültürü teknikleri ile ortak paylaşılır. Akılda tutulması amacı, yetişkin beyin izole NSC'lerde mümkün olduğunca in vivo özellikleri (Şekil 2J) kadar çok sayıda muhafaza gerektiğidir. Genellikle gerekli dikkat ve uygun hızı arasında bir denge vurdu gerekiyor. Kafatası beyin izolasyonu ile bakımı ilgi bölgenin tanımlanması önemli ölçüde kolaylaştıracaktır. Hayvan, ölümden Aşağıdaki kısa sürede doku çıkarılması ve hasat ve yıkama sırasında beyin soğuk tutmak tutar daha sert ve büyük ölçüde bu kalıp kesit paslanmaz çelikten konulduğunda doku alınmasında yardımcı olur. Bu da kesit işlemi sırasında doku almak için en aza indirilmektedir. Protokol ayrıca abl olmanın faydalarıBu, in vitro olarak yerleştirilir bir kez bu hücre canlılığını artırır e kadar, hızlı bir şekilde kaplama noktasına hücreleri alır. Önce kesit için uygun doku yıkama da kültürlerde kirlenme potansiyelini azaltır. Ayrışma işlemi sırasında, 1 ml pipet ucu ile toz haline güçlü olması gerekir, ancak, hücre süspansiyonuna olumsuz etkilerin, hücre yaşama aşırı kabarcıklar veya köpüklenmesini oluşturmak için değil, bir şekilde yapılır. Bu nonattached hücrelerin çoğunluğu ve kök hücre popülasyonunun başlangıç ​​hayatta kalması için zararlı faktörler içeren doku ayırma işleminden sonuçlanan bir hücre kalıntıları kaldırır Birinci ortam değişikliği de çok önemlidir. Imüno aşağıdaki görselleştirmenin geliştirilmesi için, yeni izole edilmiş hücreler, 6 oyuklu plakaların altına yerleştirilen 25 mm cam lamelleri kaplama olabilir. Poli-L-ornitin ve kaplamalarda kullanılan fibronektinin konsantrasyonu 500 ug / ml ve 20 μ için artırılmalıdırg / ml 'dir. Bir alternatif olarak, çok sayıda daha küçük lamelleri (örneğin 12 mm) her bir kuyunun içine yerleştirilebilir. Bunlar daha sonra dikkate küçük hacimleri çekmek için kullanılan boyama reaktiflerin miktarlarına küçültme, 24 oyuklu plakanın ayrı kuyularda, bağımsız bir şekilde immün için işlenebilir. Lamelleri daha sonra standart sulu bir montaj ortamı kullanılarak slaytlar üzerine monte edilir.

Erişkin beyinde NSC'lerde varlığını tanımlama nörobiyolojisinin alanında büyük önem taşımaktadır. Bir kök hücre tanımlamak için iki genel yaklaşım vardır. Birinde, söz konusu kök hücre popülasyonunun bir gen tanımlama profili dayalı biyolojik bir dizi immünohistokimya ile bir görüntü için kullanılabilir. Deneysel olarak basit olmasına rağmen, herhangi bir fonksiyonel verileri verir ne de hücreler kök hücrelerinin temel özelliklere sahip olup olmadığını belirler, kendi kendini yenileme veya birden çok farklı hücre tipleri ayırt etmek için yeteneği. Diğer bir yaklaşımda, hücre e izole edilirither saf veya heterojen kültür yerleştirilen nüfus, ve orada kendini yenileme ve multipotansiyel özellikleri canlı hücre popülasyonu kullanılarak değerlendirilir. Bu yaklaşım, fonksiyonel verileri verir, ve açık bir şekilde bu özel in vitro deney koşullarında "stemness" kanıtlamak için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücrelerin kültür içinde muhafaza ile zorluk bu ikinci işlevsel yaklaşım engellemiştir. Aslında, beynin diğer bölgelerinden NSCs büyümeye yetersizlik ikamet ettikleri birkaç özel nişler sadece orada olduğu izlenimini bıraktı.

Burada sunulan yöntem olup, merkezi sinir sisteminin pek çok farklı alanlarından NSC'lerde kültür sağlar. Bu teknik, in vitro ve in vivo olarak NSC'lerde sayısını kontrol etmek için çok önemli bir sinyal transdüksiyon yolu olarak aydınlatılamamıştır çalışmalarımız dayanır. Bu protokol dahil faktörler bir çok sinyal transdüksiyon çalışmaları temelinde seçildi, Ortak bir transkripsiyon faktörü Hes3 aracılığıyla MGK büyümeyi teşvik ettiğini gösteren. Daha önceki çalışmalar, tek tek kullanımıyla karşılaştırıldığında, bu özel kombinasyonu NSC sayı daha da büyük bir artış olduğunu göstermektedir vermiştir. Farmakolojik destek kültüre eklendiği seçimi biyoloji çalışılan bağlamında dikkate alınmalıdır. Ang2 ve Dll4 hem MGK büyüme üzerinde pozitif bir etkiye sahip iken, örneğin, bunlar damar oluşumu ^22,23 üzerinde karşıt etkileri vardır. Kültür koşulları daha da optimize sayesinde, Hes3 ötesinde ek yeni bir biyolojik muhtemelen tespit edilebilir ve daha da yetişkin beyinde NSC'lerde kabul sayısı genişleyecektir. Bu, farklı beyin bölgeleri arasındaki Hes3 + hücre popülasyonu arasında ayrım yapılabilir gözlemlerimiz ile örneklendirilir. Örneğin SVZ'unda ve ACA gelenler gibi omurilik, ikinci Hes3 + hücreleri, bu kültüre bunların sayısı birkaç misli artış gösterecektirfaktörleri. Buna ek olarak, tüm bu bölgelerden Hes3 + hücreleri, verimli bir şekilde nöronlar, astrositler ve oligodendrositlerin oluşturabilir. Bununla birlikte, farklı hücre tiplerinin morfolojisi ve gen ekspresyonu aynı değildir. Farklı Hes3 + hücre tipleri arasında ayrım ek belirteçler alana hoş bir ilave olacaktır. NSC kültürlerin verimli üretimi için izin Burada sunulan yöntem, bu amaca yönelik bir araç olarak kullanılabilir.

NSC belirteçler Nestin ve Sox2 gibi, transkripsiyon faktör Hes3 sinir sisteminin nöronları, astrositler ve oligodendrositlerin ¹¹ oluşturan ana hücre türlerine göre üzere izole üzerine hem de in vitro olarak dağıtılmasını bir hücre popülasyonunu tanımlar. Ancak, bu daha sık kullanılan belirteçler farklı olarak, Hes3 da hareketsiz NSCs tanımlayan, bir sonucu olarak, bir çok Hes3 + hücreleri homeostatik c mitoz göstergeleri ^(3H-timidin ya da BrdU) dahil değildirşartlarından (ve böylece klasik algılama teknikleri kaçınmışlardır). Burada tarif edilen protokol uygulanması bu NSC nüfusun keşfi temel oldu. In vivo ²⁴ kendi perivasküler lokalizasyonu ile tutarlı Çentik ligand DELTA4 ve Angiopoetin2 dahil olmak üzere vasküler endotel üretilen faktör ile tedavi edildiklerinde bu hücrelerin sayısı kültüründe artar.

Yetişkin beynin izole edilen bu hücrelere hazır erişimi olan deney hücreler çeşitli faktörlere sinyal transdüksiyon düzeyinde nasıl yanıt incelemek için sağlar, ve hücreler, in vivo olarak nasıl yanıt, bazı akıllı endikasyonlarını da ortaya koyar. Rejeneratif tıp ötesine baktığımızda, burada açıklanan kültür koşullarının yanı sıra kanser araştırma alaka gösterdi. Hastada, çalışma o için izin verirken, daha Glioblastomla izole kanser kök hücrelerinin deneyimi multiforme bu ortamı temsilf büyüme ³⁰ karşı manipüle edilebilir sinyal yolları. Bu tekniğin geniş uygulama araştırma ve tıp birden çok yönleri için önemli etkileri olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit