Abstract
सेल / कण आसंजन assays रोग pathophysiology में शामिल जैव रासायनिक बातचीत को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं और उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए खोज में महत्वपूर्ण आवेदन किया है. स्थिर शर्तों का उपयोग assays में vivo वातावरण के साथ उनके सह - संबंध सीमित, कतरनी पर आसंजन की निर्भरता पर कब्जा करने में विफल. शारीरिक द्रव का प्रवाह नीचे आसंजन यों कि समानांतर थाली प्रवाह कक्षों एक कतरनी आसंजन मानचित्र की पीढ़ी के लिए कई प्रयोगों की जरूरत है. इसके अलावा, वे में विवो पैमाने और आकारिकी का प्रतिनिधित्व नहीं करते और प्रयोगों के लिए अभिकर्मकों की बड़ी मात्रा में (~ मिलीलीटर) की आवश्यकता होती है. इस अध्ययन में, हम microfluidic डिवाइस, SynVivo-SMN आधारित एक microvascular नेटवर्क का उपयोग कर एक ही प्रयोग से कतरनी आसंजन मानचित्र की पीढ़ी प्रदर्शित करता है. यह डिवाइस ज्यामितीय पैमाने, रूपात्मक तत्वों, प्रवाह सुविधाओं और एक में सेलुलर बातचीत सहित विवो वाहिका संरचना में जटिल recreatesइन विट्रो प्रारूप, जिससे बुनियादी के लिए एक biologically यथार्थवादी वातावरण प्रदान करने और सेलुलर व्यवहार, दवा वितरण, और दवाओं की खोज में अनुसंधान लागू होता है. परख माइक्रोचिप की avidin में लिपटे सतहों के साथ 2 माइक्रोन बायोटिन में लिपटे कणों की बातचीत के अध्ययन के द्वारा प्रदर्शन किया गया. microvasculature में मनाया कतरनी की संपूर्ण रेंज शारीरिक शर्तों के तहत कणों के लिए कतरनी मानचित्र बनाम एक एकल परख सक्रिय करने के आसंजन में प्राप्त की है.
Introduction
सेल सेल और कण सेल बातचीत करने के लिए अध्ययन करने के लिए वर्तमान assays आमतौर पर कणों या कोशिकाओं प्रोटीन matrices या पक्षपाती कोशिकाओं पर incubated हैं जिसमें स्थिर अच्छी तरह से थाली प्रारूप शामिल है. निर्दिष्ट ऊष्मायन समय के अंत में, पक्षपाती कणों या कोशिकाओं की संख्या माइक्रोस्कोपी 1 का उपयोग मात्रा रहे हैं. इन assays इन मुलाकातों के पीछे जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान हालांकि, एक प्रमुख सीमा (microcirculation की विशिष्ट) शारीरिक द्रव का प्रवाह की कमी और कण आसंजन पर इसके प्रभाव है.
इस सीमा को पार करने के लिए, इन विट्रो प्रवाह कक्षों हाल के वर्षों में विकसित किया गया है. इन प्रवाह कक्षों की एक आम तत्व विवो 2 में रक्त वाहिकाओं में मनाया दीवार कतरनी दर मैच को कम रेनॉल्ड्स संख्या में perfused एक पारदर्शी तंत्र है. पोत दीवार प्रवाह ग की सतह पर biomolecules की कोटिंग या कोशिकाओं के विकास को या तो द्वारा मॉडलिंग की हैhamber 3. कण 4-7 या कोशिकाओं 8-16 फिर विभिन्न कतरनी दरों के तहत कणों पालन की संख्या यों तो प्रवाह दरों के वांछित सीमा पर में प्रवाहित कर रहे हैं.
हालांकि, जैव रासायनिक घटनाओं का अध्ययन और मान्य करने के लिए समानांतर थाली प्रवाह कक्षों का उपयोग बजाय महंगी और समय लेने वाली है. यह कई प्रयोगों पालन कणों / कोशिकाओं की संख्या बनाम fluidic कतरनी का एक नक्शा पैदा करने के लिए आयोजित किए जाने की जरूरत है कि इस तथ्य के कारण मुख्य रूप से है. इसके अलावा, थाली प्रवाह कक्षों की वजह से उनके बड़े आकार (ऊंचाई> 250 माइक्रोन और चौड़ाई> 1 मिमी) को अभिकर्मकों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है. अंत में, इन उपकरणों के सही विवो में मौजूद हैं कि ज्यामितीय सुविधाओं (जैसे, bifurcations) और प्रवाह की स्थिति (जैसे, बहती अपसारी बनाम converging) मॉडल नहीं है.
लिथोग्राफी आधारित microfabrication 17-19 में हाल के अग्रिमों प्रयोगशाला-on-a-चिप के क्षेत्र त्वरित किया हैउपकरणों 20-21. इन उपकरणों सुक्ष्ममापी शासन में आयामों के साथ समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर की एक छोटी संस्करण को विकसित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. आयाम में कमी भी अभिकर्मकों, कोशिकाओं या प्रयोगों के लिए आवश्यक कण की मात्रा के संदर्भ में महत्वपूर्ण लाभ अर्जित करता है. हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध उपकरणों की एक प्रमुख सीमा vivo में मनाया जटिल microvasculature की नकल नहीं करता जो microvessels, मॉडल पर रैखिक चैनलों का इस्तेमाल होता है.
हमने हाल ही में vivo परिस्थितियों के सिंथेटिक प्रतिनिधित्व में जिसके परिणामस्वरूप डिस्पोजेबल प्लास्टिक substrates पर microvascular नेटवर्क पुनः बनाने के लिए एक उपन्यास पद्धति को विकसित किया है. इन उपकरणों SynVivo सिंथेटिक microvascular नेटवर्क (SMN) नरम लिथोग्राफी प्रक्रिया आधारित PDMS का उपयोग कर विकसित कर रहे हैं कहा जाता है. SynVivo-SMN उपकरणों सेल / कण आसंजन 22 की कतरनी आसंजन नक्शा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अध्ययन दवा वितरण 23 और ज लक्षितvivo में डेटा 24-25 खिलाफ मान्य किया गया AVE. इस पत्र में, हम 1-5 μl जिससे संसाधनों और समय के महत्वपूर्ण बचत में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में छोटे खंडों में एक ही प्रयोग से कतरनी आसंजन नक्शा पीढ़ी सक्षम बनाता है एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. भड़काना SynVivo-SMN microfluidic युक्ति
- डिवाइस के प्रत्येक बंदरगाह (इनलेट / आउटलेट) दो समानांतर बंदरगाहों के शामिल है - सतह कोटिंग moieties में बहने के लिए एक (आसंजन अणुओं, विकास matrices, आदि) और / या बोने और परख (चित्रा 1 ए को चलाने के लिए अन्य के लिए कोशिकाओं ).
- पूरी तरह से बाँझ विआयनीकृत (डी) पानी युक्त एक पेट्री डिश में SynVivo-SMN microfluidic डिवाइस (चित्रा 1 बी) डूब और एक निर्वात desiccator में पकवान. हवा के सभी डिवाइस के चैनलों से निकाल दिया जाता है जब तक desiccator चलाने की अनुमति दें. यह लगभग 15 मिनट लग चाहिए.
- पानी से युक्ति को हटाने से पहले, ठीक बिंदु संदंश के साथ डिवाइस के प्रत्येक बंदरगाह में पानी के साथ primed Tygon टयूबिंग (0.06 के आयुध डिपो "और 0.02 की आईडी") रखें. ट्यूबिंग लंबाई में लगभग 1 इंच होना चाहिए. युक्ति अब पानी से हटाया जा सकता है. चित्रा 1C devic की छवि से पता चलता हैट्यूबिंग के साथ ई.
2. वांछित प्रोटीन के साथ microfluidic डिवाइस कोटिंग (जैसे, avidin)
- एक विंदुक का प्रयोग, एक प्रवेश पोर्ट ट्यूबिंग के आधार पर चारों ओर पानी (लगभग 100 μl) की एक बूंद जगह है. ध्यान से प्रधानमंत्री डिवाइस के लिए इस्तेमाल किया ट्यूबिंग हटा दें. पानी की बूंद डिवाइस में प्रवेश करने से हवा को रोकने जाएगा.
- 20 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में avidin के साथ भरी हुई एक 1 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें. एक 24 जी स्टेनलेस स्टील सुई और टयूबिंग के लिए सिरिंज से कनेक्ट करें. डिवाइस के इनलेट बंदरगाहों में से एक के लिए ट्यूबिंग डालें. एक जबड़े क्लैंप के साथ उपयोग नहीं किया जा रहा इनलेट बंदरगाह दबाना.
- डिवाइस की पूरी छिड़काव अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए 1 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर avidin इंजेक्षन. प्रवाह समय के अंत में, जबड़े क्लैंप के साथ टयूबिंग दबाना और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर डिवाइस जगह है.
3. आसंजन प्रयोगों के लिए Biotinylated कण बहने
- डिवाइस की अनुमति देंकमरे के तापमान के लिए आते हैं. एक मोटर चालित मंच और एक उच्च प्रदर्शन कैमरा से लैस एक औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर डिवाइस रखें.
- फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 5 एक्स 10 6 कणों / एमएल के एक एकाग्रता में 2 माइक्रोन biotinylated कणों का एक समाधान तैयार करें. 1 मिलीलीटर सिरिंज में कणों लोड करें. केवल पीबीएस का एक दूसरा 1 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें. एक सिरिंज पंप पर प्रत्येक सिरिंज लोड और सुई और ट्यूबिंग से कनेक्ट.
- एक विंदुक का प्रयोग, इनलेट पोर्ट ट्यूबिंग के आधार पर चारों ओर पानी (लगभग 100 μl) की एक बूंद जगह है. ध्यान से कोट डिवाइस के लिए इस्तेमाल किया ट्यूबिंग हटा दें. पानी की बूंद डिवाइस में प्रवेश करने से हवा को रोकने जाएगा.
- ध्यान इनलेट बंदरगाहों में से प्रत्येक में 3.2 कदम से biotinylated कणों और पीबीएस के लिए ट्यूबिंग का डालें. 2A चित्रा सेट अप की छवि को दर्शाता है.
- 2.5 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर biotinylated कणों इंजेक्शन लगाने शुरू करो. माइक्रोस्कोप पर इनलेट पोर्ट मॉनिटर. पहला संकेत परकणों की, टाइमर शुरू और 3 मिनट के लिए प्रवाह जारी है.
- एक साथ 2.5 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर पीबीएस के प्रवाह को घूर जबकि 3 मिनट के अंत में, biotinylated कणों के प्रवाह को रोकने. पीबीएस अपार कणों से धोने के लिए 3 मिनट के लिए डिवाइस में प्रवाह करने की अनुमति.
4. छवियों को प्राप्त करने और इमेजिंग सॉफ्टवेयर (Nikon तत्वों) का उपयोग ब्याज (AOI) माप का क्षेत्र बना
- पूरे डिवाइस की छवि हासिल करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर में "स्कैन बड़ी छवि" समारोह का उपयोग करें.
- डिवाइस में क्रमिक संख्या bifurcations और चैनलों की दो बार व्यास के साथ एक परिपत्र AOI बना. चैनल व्यास 100 मीटर है, क्योंकि इस मामले में, 200 माइक्रोन के लिए AOI व्यास निर्धारित किया है.
- एक एमएस एक्सेल शीट के लिए प्रत्येक AOI में कणों की संख्या का निर्यात करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर में स्वचालित गिनती समारोह का प्रयोग करें.
- इसी तरह, पूरे में कणों की संख्या का निर्यात करने के लिए स्वचालित गिनती सुविधा का उपयोगडिवाइस.
5. कम्प्यूटेशनल फ्लूड डायनामिक्स (सीएफडी) मॉडल का प्रयोग कण प्रवाह विश्लेषण
- सीएफडी सिमुलेशन SynVivo-SMN डिवाइस टोपोलॉजी के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर (सीएफडी-ऐस +, ईएसआई Inc) का उपयोग कर चला रहे हैं. परिणाम प्रयोगात्मक टिप्पणियों का विश्लेषण करने के लिए एक डेटाबेस में जमा हो जाती है. दीवार कतरनी दरों, वेग, कण प्रवाह, और डिवाइस में आसंजन पर सिमुलेशन परिणाम स्टोर जानकारी.
- सिमुलेशन परिणाम एक दिया इनलेट कण एकाग्रता के आधार पर प्रत्येक AOI में प्रवेश कणों की संख्या निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
6. उत्पन्न कतरनी आसंजन नक्शा
- समीकरण 6.1 के रूप में दिखाया बंटवारे में बह कणों से बंटवारे में पालन कणों में विभाजित करके आसंजन के% की गणना.
पालन कणों और बह कणों की संख्या पी से प्राप्त कर रहे हैं, जहांrotocol क्रमश: 4.3 और 5.2 कदम. - कदम (5.1) में डेटाबेस से प्राप्त नेटवर्क और समीकरण 6.1 से प्राप्त% आसंजन मूल्यों की प्रत्येक विभाजन पर कतरनी दर का उपयोग कतरनी आसंजन नक्शा प्लॉट.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 1 ए SynVivo-SMN डिवाइस का एक योजनाबद्ध और एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि दिखाता है. चित्रा 1 बी एक गिलास स्लाइड पर घुड़सवार SynVivo-SMN डिवाइस. चित्रा 1C एक निर्वात desiccator में पानी के साथ भड़काना निम्नलिखित ट्यूबिंग साथ डिवाइस से पता चलता है दिखाता है.
2A चित्रा 2 माइक्रोन biotinylated कणों के बंधन के बाद एक ठेठ avidin में लिपटे SynVivo-SMN डिवाइस से पता चलता है प्रयोगात्मक सेट अप. चित्रा 2 बी की एक छवि को दर्शाता है. कणों preferentially नेटवर्क में bifurcations निकट पालन ध्यान दें.
चित्रा 3A SynVivo-SMN नेटवर्क में गिने bifurcations दिखाता है. चित्रा 3 बी उपकरण की सीएफडी मॉडल द्वारा उत्पन्न नमूना दीवार कतरनी के नक्शे से पता चलता है. कतरनी दर 250 सेकंड -1 से 15 सेकंड से लेकर डिवाइस में बदलता -1 vivo में microvasculature में मनाया. ध्यान दें कि इन अलगवे एक प्रवाह की दर के लिए एक निरंतर कतरनी दर प्रदान के रूप में कतरनी दरों रैखिक microfluidic चैनलों में एक साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है. चित्रा -3 सी नेटवर्क की bifurcations में से प्रत्येक में कतरनी दर के मूल्यों की एक साजिश को दर्शाता है. डेटा कतरनी दर पैटर्न जटिल हैं और रैखिक प्रवाह चैनलों के विपरीत एक सरल विश्लेषणात्मक रिश्ते के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है दिखाता है. इसके अलावा, कई bifurcations (AOIs) के आंकड़ों के सांख्यिकीय आत्मविश्वास को जोड़ने, एक ही कतरनी बिन में गिरावट है कि नेटवर्क में मौजूद हैं.
चित्रा -4 ए प्रयोगात्मक नेटवर्क की शाखाओं और bifurcations में कण अपशिष्टों की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है जो नेटवर्क में कण अपशिष्टों के लिए सीएफडी विश्लेषण का नमूना परिणामों से पता चलता है. 4B चित्रा एकल SynVivo-SMN प्रयोग से गणना कतरनी आसंजन नक्शा दिखाता है. कतरनी आसंजन नक्शे से प्राप्त कतरनी आसंजन नक्शे से मनाया के रूप में व्युत्क्रम संबंध इस प्रकार हैरेखीय चैनल प्रयोगों. हालांकि, एक SynVivo परख का उपयोग इसके विपरीत, एक ही प्रयोग समय और संसाधनों की महत्वपूर्ण बचत में जिसके परिणामस्वरूप रैखिक चैनलों से आवश्यक कई प्रयोगात्मक रन के विपरीत इस कतरनी के नक्शे की पीढ़ी की अनुमति देता है. प्रयोगों अधिक से अधिक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए triplicates में चलाए जा रहे हैं कि ध्यान दें.
चित्रा 1. SynVivo-SMN उपकरणों. वाम पैनल (चित्रा 1 ए) डिवाइस का एक योजनाबद्ध दिखाता है. राइट पैनल (चित्रा 1 ए) युक्ति के उज्ज्वल क्षेत्र छवि दिखाता है. चित्रा 1 बी खुर्दबीन गिलास स्लाइड पर घुड़सवार SynVivo-SMN डिवाइस. चित्रा 1C पानी के साथ भड़काना निम्नलिखित इनलेट / आउटलेट बंदरगाहों से जुड़ी Tygon ™ ट्यूबिंग साथ डिवाइस से पता चलता है दिखाता है.
चित्रा 2. SynVivo-SMN में विशिष्ट आसंजन परख. चित्रा 2A प्रयोगात्मक सेट अप. चित्रा 2 बी की एक छवि से पता चलता है biotinylated कणों डिवाइस में बाध्यकारी निम्न से पता चलता है. कण आसंजन नेटवर्क की शाखाओं की तुलना में विभाजन के पास स्थानीयकृत हो पाया है कि ध्यान दें.
चित्रा 3. SynVivo-SMN में कतरें विश्लेषण. चित्रा 3A नेटवर्क में गिने सभी bifurcations से पता चलता है और प्रयोगों से bifurcations के एक बढ़ाया देखने. चित्रा 3B नेटवर्क में bifurcations में गुणात्मक दीवार कतरनी नक्शा. चित्रा से पता चलता है-3 सी नेटवर्क में शाखाओं में कतरनी पर मात्रात्मक जानकारी से पता चलता है. नेटवर्क में कतरनी पैटर्न जटिल हैं और इन विवो में पाया कतरनी दर (0-240 सेकंड -1) के शारीरिक सीमाओं कि अवधि को नोट करें.
कतरनी आसंजन नक्शा चित्रा 4. पीढ़ी. चित्रा -4 ए सीएफडी अनुकरण से प्राप्त नेटवर्क में (सफेद में दिखाया गया है) कण trajectories पर प्रकाश डाला गया. इन trajectories विभिन्न शाखाओं और bifurcations में कण अपशिष्टों को प्राप्त करने के बाद संसाधित कर रहे हैं. 4B चित्रा एक एकल SynVivo-SMN प्रयोग से प्राप्त कतरनी आसंजन नक्शा दिखाता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
समानांतर थाली प्रवाह कक्षों, सेल सेल और सेल कण बातचीत में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हुए, इस तरह के उच्च अभिकर्मकों की खपत और एक कतरनी आसंजन नक्शा उत्पन्न करने के लिए कई प्रयोगात्मक रन के लिए आवश्यकता के रूप में कई सीमाओं से ग्रस्त हैं. SynVivo सिंथेटिक microvascular नेटवर्क (SynVivo-SMNs) का उपयोग vivo परिस्थितियों में नकल उतार स्थितियों में एक ही प्रयोग से एक कतरनी आसंजन नक्शा पीढ़ी सक्षम बनाता है. इसके अलावा, अभिकर्मकों में महत्वपूर्ण बचत (> 95%) भी प्राप्त की है.
SynVivo-SMN साथ कण आसंजन प्रयोगों चलाने में सबसे महत्वपूर्ण कदम से पहले प्रयोग करने के लिए चिप में बुलबुला मुक्त स्थितियां सुनिश्चित करने के लिए है. बुलबुले की शुरूआत चिप के क्षेत्र "हवा बंद" करने के लिए उपयोग की अस्थिरता और कमी प्रवाह के लिए नेतृत्व करेंगे. इसलिए, महान देखभाल डिवाइस के बंदरगाहों से tubings के सम्मिलन और एक्सट्रेक्शन के दौरान उठाए जाने की जरूरत है. वें में पाया एक बुलबुला के मामले मेंभड़काना चरण के दौरान ई डिवाइस, एक बुलबुले को दूर करने के लिए फिर से भड़काना कदम को दोहरा सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक उपकरण का बुलबुला मुक्त कण्ठ सुनिश्चित करने के लिए एक कम प्रवाह दर (0.1 μl / मिनट या उससे कम) पर मीडिया / अभिकर्मकों में प्रवाह कर सकते हैं.
प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा से हटाया नहीं जा सकता है कि एक बुलबुले की उपस्थिति निम्नलिखित व्यर्थ प्रदान की जा रही चिप है. हालांकि, सावधान अभ्यास के साथ एक के पास 100% सफलता के साथ प्रयोग कर सकते हैं. इसके अलावा, कतरनी आसंजन नक्शा पीढ़ी सीएफडी मॉडल से जानकारी की आवश्यकता है. हालांकि, विभिन्न प्रवाह की स्थिति के लिए सीएफडी परिणामों के एक पूर्व गणना डेटाबेस आसानी सीएफडी सिमुलेशन प्रदर्शन करने की जरूरत को दूर कर सकते.
यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रणाली प्रदर्शन में आसानी के लिए avidin बायोटिन प्रणाली का इस्तेमाल किया, हालांकि, कणों या कोशिकाओं पर कोई ligand-रिसेप्टर संयोजन अध्ययन कण सतह या डिवाइस में वास्तविक समय में सेल सतह बातचीत होने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, कोशिकाओं घन किया जा सकता हैकण सेल और सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए डिवाइस में ltured. कोशिकाओं की संस्कृति वांछित प्रकार की कोशिकाओं के लिए उपयुक्त मैट्रिक्स के साथ इस उपकरण के चैनलों की कोटिंग की आवश्यकता होगी. उदाहरण के लिए, endothelial कोशिकाओं fibronectin लेपित चैनलों पर संवर्धित किया जा सकता है. संगम के बाद, endothelial कोशिकाओं TNF-α या अन्य प्रासंगिक साइटोकिन्स का उपयोग कर सक्रिय किया जा सकता है. सफेद रक्त कोशिकाओं (WBCs) इंजेक्ट किया जा सकता है और सक्रिय endothelial कोशिकाओं पर उनकी बातचीत वास्तविक समय का अध्ययन किया जा सकता है. इस अध्ययन में प्रदर्शन प्रोटोकॉल के लिए इसी प्रकार, सफेद रक्त कोशिकाओं का एक कतरनी आसंजन मानचित्र आसानी से एक ही प्रयोग से उत्पन्न हो सकता है.
इस पत्र में उल्लेख किया प्रोटोकॉल में विवो स्थितियों की एक मॉडल के रूप में कण / सेल आसंजन पर नेटवर्क आकृति विज्ञान के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, शारीरिक स्थितियों मॉडलिंग के लिए कण / सेल आसंजन और सेलुलर व्यवहार पर प्रवाह का असर भी आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता. अंत में, प्रोटोकॉल हमें हो सकता हैवांछित सेलुलर आबादी को लक्षित वितरण के लिए दवा वितरण और प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एड.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
सीएफडी अनुसंधान निगम द्वारा प्रायोजित इस लेख के लिए प्रकाशन शुल्क.
Acknowledgments
SynVivo प्रौद्योगिकी NHLBI से अनुदान # 2R44HL076034 के तहत विकसित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
- Weitz-Schmidt, G., Chreng, S.
- Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte recruitment under flow conditions. Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).
- Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment. Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).
- Adriani, G., et al. The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles. Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).
- Decuzzi, P., et al. Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles. Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).
- Sakhalkar, H. S., et al. Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J Vis Exp. 66 (66), (2012).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (2012).
- Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury. Crit Care. 14, 201 (2010).
- Oh, H., Diamond, S. L. Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium. J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).
- Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions. Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).
- Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation. Microcirculation. 8, 355-364 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunology. 2, 9 (2001).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography. Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).
- Qian, T., Wang, Y. Micro/nano-fabrication technologies for cell biology. Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).
- Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects. Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- McDonald, J. C., et al.
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).
- Rosano, J. M., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).
- Prabhakarpandian, B., et al. Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
