Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

طرق التصوير المناعى والكالسيوم في Wholemount الجرذ الشبكية

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

وتستخدم بروتوكولات المناعية لدراسة توطين بروتين معين في شبكية العين. وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم لدراسة ديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم.

Abstract

في هذه الورقة وصفنا الأدوات والكواشف، والخطوات العملية اللازمة ل: 1) إعداد الناجح لشبكية العين wholemount لالمناعية و، 2) التصوير الكالسيوم لدراسة الجهد بوابات قنوات الكالسيوم (VGCC) بوساطة إشارات الكالسيوم في شبكية العين خلايا العقدة. أسلوب التصوير الكالسيوم وصفنا القضايا الالتفاف حول تحميل غير محدد من خلايا عديم الاستطالات النازحين في طبقة الخلايا العقدية.

Introduction

خلايا الشبكية العقدة (RGCs) تعبر عن L-، N-، P / Q- وT-نوع VGCC كما هو محدد من خلال الحصار الدوائي من هذه المكونات من خلية كاملة CA القناة الحالية 1،2. VGCC هي بروتينات الغشاء multimeric التي تشارك في إطلاق الإرسال، النسخ الجيني، وتنظيم الخلايا واللدونة متشابك 3،4،5. مصنوعة VGCCs وظيفية من ثلاثة على الأقل فئات متميزة من مفارز: كبيرة، عبر الغشاء α 1 المسام تشكيل مفارز التي تحدد خصائص القناة الفيزيائية الحيوية والدوائية، α مساعد خارج الخلية في المقام الأول 2 δ مفارز وحدات فرعية داخل الخلايا β. وهذا الأخير مجمعين شكل مغايرة التغصن مع مختلف α 1 مفارز وتغير حركية النابضة والاتجار القنوات لغشاء البلازما 6.

على مدى العقود الأخيرة، وقد استخدمت العديد من التقنيات لدراسة البروتين expression، مثل المناعية، انزيم مرتبط المناعي فحص وتحليل الغربي والتدفق الخلوي. هذه التقنيات تتطلب استخدام أجسام مضادة محددة للكشف عن بروتين معين من الفائدة وتوفر أدوات قوية لتوطين وتوزيع بروتينات معينة في الأنسجة المختلفة. التقنيات المستخدمة لكشف وتحديد مستويات مرنا التعبير عن بروتين معين مثل تحليل لطخة الشمالي، RT-PCR، في الوقت الحقيقي الكمي RT-PCR، التهجين في الموقع، ميكروأرس [كدنا] وفحص حماية ريبونوكلياز تقدم نهجا بديلا عندما الأجسام المضادة ليست بسهولة مستويات التعبير المتاحة أو إذا كان من بروتين معين منخفضة 7. ومع ذلك، الحد إلى استخدام مثل هذه التقنيات الجزيئية هو تحديد المطلوب من التسلسل الجيني.

في توطين البروتينات في شبكية العين، المناعية يمكن أن يؤديها على شبكية العين wholemount. نظرا لسهولة الحصول على RGCs، وwholemountإعداد يوفر منصة ممتازة لدراسة توطين بروتينات معينة إلى somata RGC والمحاور الخاصة بهم.

بالإضافة إلى التعريب، وبعض الخصائص الوظيفية للVGCCs في RGCs يمكن البرهنة من خلال استخدام تقنيات التصوير الكالسيوم. نحن تصف بروتوكول التصوير الكالسيوم لتسمية RGCs انتقائي مع صبغة الكالسيوم مؤشر لقياس ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا. مساهمة VGCCs مختلفة للإشارة الكالسيوم في مقصورات الخلوية المختلفة يمكن أن تكون معزولة مع استخدام النوع الفرعي محددة حاصرات قنوات الكالسيوم.

ربما يكون واحدا من أكثر الجوانب المفيدة للتقنية التصوير الكالسيوم الموصوفة هنا هو القدرة على تسجيل في وقت واحد وبشكل مستقل عن RGCs متعددة والمحاور الخاصة بهم. على الرغم من أن العديد من التقنيات الفسيولوجية، مثل خلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك، وتوفير تسجيلات عالية الدقة الزمنية التيارات الغشاء، وجسدية أو مصدر محور عصبي من تساالتيارات البريد المسجل لا يمكن أن يكون هناك تمييز والتسجيلات لا يمكن إلا أن تكون مصنوعة من الخلايا العصبية واحدة في وقت واحد. صفائف Multielectrode (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) قادرة على تسجيل المسامير وقت واحد من العديد من الخلايا، ولكن يمكن أن لا يكشف ولا تميز تفعيل، على سبيل المثال، أنواع فرعية مختلفة من قنوات الكالسيوم. مياس تسجيل تفضيلي من الخلايا التي تقع على مقربة من قطب معين 8 و سجل من الخلايا التي تولد طفرات كبيرة 9. توفر أساليب التصوير الضوئي استراتيجية بديلة لتمكين التسجيلات في وقت واحد ومستقلة للسكان كامل من الخلايا التي يمكن أن تكون متكاملة مع المعلومات التي تم الحصول عليها من مسرى مكروي خلية واحدة والتصحيح تسجيل المشبك وتسجيل MEA. على الرغم من أن تقنيات التصوير الكالسيوم الموصوفة هنا كانوا يعملون لدراسة ديناميات الكالسيوم من RGCs، المشبك التصحيح والاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف يمكن أن تستخدم أيضا بشكل متواز لزيادة توضيح التيارات الأيونية وارتفاعه خصائص RGCs.

10، كان هدفنا لاستخدام تقنية تحميل أن تصف بشكل انتقائي RGCs مع صبغة مؤشر الكالسيوم الاصطناعية في إعداد wholemount. على الرغم من الأصباغ الاصطناعية مؤشر الكالسيوم توفر منصة ممتازة لدراسة ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا، وقد أعاق استخدام على نطاق واسع من عدم القدرة على تحميل فعال مجموعات سكانية محددة من الخلايا العصبية ضمن شبكة معينة. وقد أجريت العديد من التقنيات مثل معظم العملية 11 و electroporation 8،12 لتحميل جميع السكان من الخلايا، لكن هذه التقنيات لا تميز بين أنواع معينة من الخلايا. المشفرة وراثيا توفر مؤشرات الكالسيوم القدرة على تسمية انتقائي فئات معينة من السكان من الخلايا، لكن هذه الأساليب تتطلب جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 13. تصف تقنية لدينا methoد انتقائي لتسمية RGCs في إعداد wholemount عبر العصب البصري جدعة حقن صبغة مؤشر الكالسيوم.

أخذت معا، والتقنيات الهيكلية والفسيولوجية الموضحة في هذه المقالة توفر منبرا لدراسة توطين ومساهمة VGCCs إلى إشارة الكالسيوم في RGCs والمحاور الخاصة بهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية من أجل رفاهية حيوانات التجارب الصادرة عن سياسة دائرة الصحة العامة الأميركية على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية وجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (UCLA) لجنة البحوث الحيوانية. واستخدمت الذكور والإناث الكبار الفئران سبراغ داولي (معمل نهر تشارلز، ويلمنجتون، MA) تتراوح أعمارهم بين 3-5 أسابيع.

1. الحيوانية والأنسجة التحضير لWholemount الشبكية وبروتوكول المناعية

  1. إعداد المواد والأدوات التالية: مجهر تشريح، 2 ملقط مع نصائح جيدة جدا، مقص، ورقة الترشيح السليلوز، ماصة بلاستيكية وشريحة المجهر.
  2. الموت ببطء الفئران في غرفة مغلقة من قبل التخدير العميق الحيوان مع 1-3٪ الأيزوفلورين تليها قطع الرأس مع المقصلة. إزالة العينين مع زوج من مقص القزحية وضعها في طبق بتري تحتوي على حل خارج الخلية. السبات A، أميس البياناتينصح المتوسط ​​أبعد أو حلول الفسيولوجية.
  3. [خطوة اختيارية إذا كان المطلوب ردمها من RGCs مع فلوو-4]. أداء العلامات فلوو-4 كما هو موضح في الخطوات 2،3-2،4.
  4. باستخدام مجهر تشريح (شدة الضوء: 1.6 × 10 8 الفوتونات / مم 2 ⋅sec)، وإزالة القرنية عن طريق قطع الجزء الأمامي من كرة العين. إزالة العدسة والجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلية بالملقط. لإزالة الجسم الزجاجي، تحقيق الاستقرار في مقلة العين من خلال عقد الصلبة بحزم مع forcep واحد. قشر بلطف قاعدة زجاجي باتجاه مركز الشبكية مع forcep الأخرى. ويسمى في هذه المرحلة إعداد فنجان العين، والذي يستخدم لcryosections. مزيد من التفاصيل حول cryosections يمكن العثور عليها في المراجع 14،15.
  5. إزالة الشبكية من فنجان العين. ثم، وجعل أربعة تخفيضات للسماح الشبكية لوضع مسطح. جبل بلطف شبكية العين على شريحة المجهر مع مبصرة طبقة فوق. إضافة قطرة واحدة من حل لشبكية العين ووضع مورق الترشيح llulose على شبكية العين. وبمجرد تولي الشبكية إلى ورقة الترشيح، ووضع شبكية العين مرة أخرى في الحل. إذا لزم الأمر، تتسطح في شبكية العين مع فرشاة أو ملقط.
  6. وضع شبكية العين wholemounted إلى 4٪ PFA لمدة 10-15 دقيقة لتثبيت.
  7. غسل شبكية العين wholemounted ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في 0.1 م العازلة الفوسفات (PB)، ودرجة الحموضة 7.4. منع شبكية العين مع 5٪ مصل الماعز العادي أو مصل حمار في 0.1 PB تحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 و 0.1٪ نان 3 في 4 درجات مئوية خلال الليل. نوصي الحجم النهائي من 500 ميكرولتر لكافة الخطوات لإنقاذ عرقلة الحلول والأجسام المضادة.
  8. اليوم التالي، واحتضان wholemounts الشبكية مع الأجسام المضادة الأولية 5-7 أيام في 4 درجات مئوية. يجب تحديد التخفيفات الأمثل من قبل المستخدم.
  9. غسل شبكية العين 3 × 30 دقيقة في PB 0.1 M واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الضد الثانوية-fluorophore مترافق المقابل الموجه ضد هذا النوع من الأجسام المضادة الأولية (تركيز 1: 1،000).
  10. بعد ثلاثة يغسل النهائية من 30 دقيقة لكل منهما مع PB، تركيب شبكية العين في تصاعد المتوسطة. ختم لل coverslips مع طلاء الأظافر للتخزين لفترة طويلة. تخزين العينات في 4 درجات مئوية، وحماية من الضوء.

2. وصفها من خلايا العقدة والمحاوير في الجرذ Wholemount شبكية العين مع الكالسيوم صبغ المؤشر

  1. إعداد 1،000 مل من الثدييات التي تحتوي على قارع الأجراس (مم) 125 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل، 2 CaCl 2، 1.25 ناه 2 ص 4، 1 MgCl 2 و 25 NaHCO 3، و 10 الجلوكوز فقاعات مع 95٪ O 2/5٪ CO ­ 2.
  2. إجراء تشريح كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.4.
  3. لتحميل خلايا الشبكية العقدة (RGCs) ومحاور مع مؤشر صبغ الكالسيوم، وضخ 0.5 ميكرولتر من فلوو-4 pentapotassium الملح (40 ملي الأسهم في H 2 O) في جذع العصب البصري حوالي 1 ملم الخلفي لمقلة العين باستخدام حقنة . لقياس ارتفاع ديناميكية في الخلايا العقدية [كا 2+ ط مؤشرا مع تقارب عالية، مثل فلوو-4 مع د K لها من 345 نانومتر، هو الأمثل. فلوو-4 تقدم فائدة إضافية تتمثل في وجود كفاءة الكم عالية جدا مما أدى إلى زيادة انبعاث> 100 أضعاف عندما يتجهون إلى الكالسيوم.
  4. وضع فنجان العين في الثدييات رينغر فقاعات مع 95٪ O 2/5٪ CO ­ 2 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

بروتوكول التصوير 3. الكالسيوم لخلايا الشبكية العقدة ومحاور عصبية.

  1. إزالة العين والعدسة والجسم الزجاجي كما هو موضح في الخطوات 1،1-1،4. عزل الشبكية من فنجان العين وتقسيمها إلى أجزاء. جبل الجانب الخلايا العقدية رباعي واحد حتى على شريحة زجاجية واستخدام شبكة شريحة القيثارة لتحقيق الاستقرار فيه. الحفاظ على القطع الأخرى داكنة تكييفها في الثدييات رينغر فقاعات مع 95٪ O 2/5٪ CO ­ 2 على الجليد لاستخدامها لاحقا.
  2. Superfuse غرفة تسجيل مع الثدييات حل رينغر والحفاظ على حل محتدما باستمرار مع 95٪ O 2/5٪ CO 2.
  3. صورة الأنسجة تحت المجهر. تجارب السلوك في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية) أو تحقيق درجات الحرارة الفسيولوجية التي كتبها الاحترار المرحلة، تسخين حمام الماء تحت عينة أو تطبيق الهواء الدافئ على سطح العينة.
    ملاحظة: من المهم أن نلاحظ أن العديد من الوظائف الخلوية وينظم درجة الحرارة، والتي تلعب دورا أساسيا في الحفاظ على توازن بين الخلايا 16. ومع ذلك، اتخاذ تدابير الاحتباس الحراري قد يزيد من معدل photobleaching من، تبخر الانجراف المتوسطة والتركيز الناجم عن التمدد الحراري 17. استخدام درجة حرارة الغرفة بين الخلايا يقلل تجزئة فلوو-4 18.
  4. إجراء السيطرة على اثنين تقرن عالية K + البقول في غياب المخدرات. يزيل الاستقطاب RGCs وRGC محاور عصبية من خلال رفع [K +] س من 3 ملم إلى 60 ملم لمدة 33 ثانية خلال كل نبضة لتفعيلVGCCs مع نظام superfusion مدفوعة ثمانية الجاذبية القنوات. تقليل الصوديوم بنسبة 57 مم للحفاظ على isosmolarity في ارتفاع الحل K +.
  5. تقييم مساهمة VGCCs مختلفة للإشارة الكالسيوم مع استخدام عامة أو محددة حاصرات قناة الكالسيوم. على سبيل المثال، انخفاض في إشارة الكالسيوم التالية إدارة غير محددة حاصرات قنوات الكالسيوم والكوبالت، بشرط إجراء شبه الكمية للمساهمة VGCCs إلى K + عالية إشارة الكالسيوم -evoked.
  6. اكتساب القيم كثافة مضان عن طريق وضع المنطقة ذات الاهتمام (ROI) حول RGCs الفائدة (الشكل 2).
  7. تطبيع التغير في كثافة مضان التي تنتجها عالية K + الثاني الذروة إلى التغيير التي تنتجها الأول K + عالية الذروة. ثم، لاختبار محددة حاصرات قنوات الكالسيوم، وتطبيق المخدرات فقط خلال ارتفاع K + نبض الثاني من زوج وتطبيع هذه الذروة ضدقيمة الذروة الأولى. لقياس تأثير الدواء على ارتفاع K + الذروة، تقسيم اتساع K + الثاني الذروة من أن من الأولى. يجب إجراء تحليل على هذه القيم فيما يتعلق مطابقة الضوابط المستمدة من تقرن K + قمم عالية تقاس في غياب المخدرات.
  8. الحصول على صور في 5 فترات ثانية. لتجنب الصور تبيض، والحفاظ على الإثارة ليزر عند أدنى مستوى ممكن. تقديم الإثارة من قبل خط 488 نانومتر ليزر الأرجون، في حين أن أنبوب مضخم يجمع الانبعاثات الفلورسنت من خلال مرشح LP 505 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunolabeling مع الأجسام المضادة المحددة توفر منصة لدراسة توطين بروتينات معينة من الاهتمام في الشبكية وأسلوب التصوير الكالسيوم يسمح دراسة مساهمة VGCCs لديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم.

باستخدام الأجسام المضادة ضد RBPMS بروتين الخلايا العقدية (RNA بروتين ملزمة مع الربط المتعدد) التي تصف بشكل انتقائي RGCs 19، تمكنا من إظهار أن وضع العلامات فلوو-4 يقتصر على خلايا العقدة (الشكل 1). لا يؤدي حقن الجذع إلى وضع العلامات من جميع خلايا العقدة كما يمكن أن يتوقع من هذه التقنية.

وتكونت الأجسام المضادة بولكلونل الأرنب ضد N-محطة للببتيد RBPMS (RBPMS 4-24)، GGKAEKENTPSEANLQEEEVR، من قبل بائع التجاري (الجدول 1). يتم حفظها RBPMS كبيرة بين الثدييات والتسلسل ببتيد استخدمت للتحصين غير متطابقة في الماوس، الفئران، القرد والإنسان (البنك البروتين NCBI، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). وقد تم جمع الأرانب الأمصال التالية التحصين وتقارب تنقيته باستخدام RBPMS العمود ببتيد تقارب. وقد تبين المطهرون تقارب الأجسام المضادة لخلايا العقدة immunostain في الفأر والفئران شبكية العين. لتقييم خصوصية المناعية RBPMS، تم تنفيذ عنصر تحكم preabsorption مع الأجسام المضادة أرنب. لفترة وجيزة، تم تخفيفه الأجسام المضادة في RBPMS 0.1 M PB تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100 ويخلط مع ببتيد RBPMS بتركيز نهائي من 1 ميكروغرام / مل لمدة 2 ساعة على RT. لم يكن المناعية RBPMS موجودة في أقسام الأنسجة حضنت مع الأجسام المضادة preabsorbed أرنب لRBPMS ومعالجتها بواسطة تقنيات المناعى القياسية.

s.jpg و"العرض =" 600 "/>
الشكل 1: بعد خاصة مع المناعية أجسام مضادة ضد بروتين RBPMS RGC (الحمراء) لإظهار فلوو-4 (الأخضر) الترجمة إلى خلايا العقدة تم استخدام اليكسا 568 الماعز المضادة للأرنب الضد الثانوية. شريط النطاق: 20 مم.

وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم لدراسة مساهمة VGCCs إلى إشارة الكالسيوم في RGCs والمحاور الخاصة بهم. تم الحصول على قيم شدة الفلورسنت من خلال وضع رويس على RGCs الفائدة (الشكل 2).

الشكل 2
الشكل 2: من أجل الحصول على قيم شدة الفلورسنت، وضعت رويس على somata الخلايا العقدية و / أو محاور شريط مقياس: 50 مم.

تم استخدام فلوو-4 pentapotassium الملح لتسمية RGCs ومحاور لها (الشكل 3).

"jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الرقم 3
الشكل 3: أنواع فرعية VGCC التي تساهم في إشارة الكالسيوم في الخلايا العقدية somata ومحاور بهم. (A) صورة متحد البؤر من wholemount الشبكية عند مستويات خط الأساس. RGCs وRGC محاور عصبية يمكن أن ينظر إليه المسمى مع فلوو-4 (B) إشارات الفلورسنت من somata RGC واحد مما يدل على زيادة في متوسط ​​كثافة مضان التي تسببها نبضات تقرن من عالية + K (60 ملم) حل الاستحمام وتخفيض لاحق في مضان في وجود الكوبالت خلال نبض الثاني. شريط النطاق لA: 20 مم.

تم تعيين نظام زايس LM5 باسكال لالتقاط الصور بمعدل إطار 5 ثانية واستغرق كل إطار مسح كامل 1.57 ثانية في الإعدادات المستخدمة. وأدرج مجال جمع 318 ميكرومتر X 318 ميكرون في المنطقة الممسوحة من 512 X 512 بيxels إعطاء مساحة 0.385 ميكرون 2 لكل بكسل. يجوز تغيير هذه الإعدادات تبعا للقرار المطلوب. يستخدم النظام 25 ميغاواط ليزر الأرجون لإثارة 488 نانومتر. استخدمنا هذا الخط في السلطة 3٪. تم تصغير التشبع عن طريق تحديد أولا أدنى تركيز الصبغة مؤشر الكالسيوم التي أسفرت عن استجابات قوية لتحفيز إزالة إستقطاب ثم عن طريق الحد من مكاسب الانتاج. وساعد خفض قوة الليزر لتجنب التبييض. لم يتم قياس تركيز المؤشر. معايرة التصوير غير ratiometric ممكنة مع استخدام ionophores الكالسيوم، ولكن قد تعمل هذه التقنية ردمها مع الأصباغ ratiometric كذلك. لتحديد تركيز مؤشر الأمثل، قارنا التغيير أثار الاستقطاب في مضان مع تركيزات حقن جذع فلوو-4 تتراوح 1-40 ملم. ووضعت رويس دائرية وبيضاوية حول RGCs ومحاور، على التوالي التي عرضت مستقرة كثافة مضان. RGCs والمحاور التي جنحت منالتركيز بسبب الحركة الناجمة عن superfusion لم تكن مختارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، التي وصفناها اثنين من تقنيات مختلفة: 1) المناعية لإظهار فلوو-4 التوطين إلى خلايا العقدة في wholemounts الشبكية، و 2) التصوير الكالسيوم لتحليل ديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم.

المناعية باستخدام wholemounts قد استخدمت للكشف عن توطين البروتينات في القوارض الشبكية 20-23. ومع ذلك، هناك عدد قليل من القيود. نوعية تلطيخ تعتمد بشكل كبير على قدرة الأجسام المضادة على الاعتراف مستضد الخاصة به وقدرته على اختراق أنسجة الشبكية لطبقة معينة من الفائدة. ويمكن تحسين هذه القضايا عن طريق زيادة فترة الحضانة في الأجسام المضادة الأولية بنسبة تصل إلى سبعة أيام، وزيادة تركيز تريتون-X و / أو احتضان شبكية العين دون ورقة الترشيح للسماح للنشر من الأجسام المضادة من خلال طبقة الخلايا العقدية و مبصرات. الحد الآخر هو duratiوالتركيز على التثبيت. بعض الأجسام المضادة تعمل بشكل أفضل عندما يتم إصلاح الأنسجة لساعة واحدة، في حين تتطلب الأجسام المضادة الأخرى أقصر فترة التثبيت. وبالمثل، في حين أن بعض الأجسام المضادة تعمل على أفضل وجه في 4٪ PFA التثبيت، والبعض الآخر يعمل على نحو أفضل في تركيزات منخفضة. نوصي أن المستخدم تحديد المدة المثلى والتركيز التثبيت، ومدة الحضانة، وتركيز تريتون-X، فضلا عن تركيز الأجسام المضادة الأولية لأفضل النتائج.

وقد استخدم التصوير الكالسيوم لدراسة ديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم. Superfusion من VGCC منع وكلاء يسمح تقييم فعالية حجب النسبية للمخدرات ووجود أنواع فرعية مختلفة قناة الكالسيوم. في حال RGCs ومحاور عصبية لا تستجيب لارتفاع K +، حاول تقليل تركيز الصبغة مؤشر الكالسيوم، وتركيزات عالية يمكن أن يؤدي إلى التشبع. إزالة كاملة من الجسم الزجاجيقد أيضا بمثابة الحاجز، ومنع مرتفعة K + من الوصول إلى RGCs والمحاور الخاصة بهم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الفشل في جبل القيثارة بشكل صحيح على رأس شبكية العين يسبب الحركة، مما أدى إلى عدم القدرة على اكتساب القيم كثافة مضان. إذا استمرت شبكية العين على التحرك، وإزالة بعناية القيثارة، تجفيف المنطقة المحيطة شبكية العين وجبل لإعادة القيثارة بإضافة المزيد من الشحوم لمحيطه. الإزالة الكاملة للحركة زجاجي والحد الأدنى من wholemount في شبكية العين هي حاسمة لنجاح التجربة.

من منبهات مستقبلات الغلوتامات الكالسيوم نفاذية التي أعربت عنها RGCs مثل N-ميثيل مد اسبارتاتي (NMDA)، 24،25 α -amino-3-هيدروكسي-5-methylisoxazole-4-بروبيونات (أمبا) ومستقبلات من نوع kainate ionotropic مستقبلات الغلوتامات 26-29، ويمكن استخدامها لاستحضار الدخول المباشر من الكالسيوم وكذلك توفير الحوافز إزالة إستقطاب الذي ينشط VGCCs. استخدام هذه منبهات قد يؤدي إلى غيراستجابة -uniform بسبب التعبير التفاضلية للفرعية مستقبلات الغلوتامات إلى أنواع مختلفة من RGCs. يمكن أيضا أن تستخدم ثنائي الفوتون المجهري للتحقيق إشارات الكالسيوم أثار ضوء في RGCs 30 و 31 من التشعبات.

وقد تحقق وضع العلامات الانتقائي للRGCs بسبب غشاء خصائص impermeant من pentapotassium الملح مؤشر الكالسيوم صبغ فلوو-4. كما استخدمت الأصباغ مؤشر الكالسيوم ديكستران مترافق لتسمية RGCs انتقائي والمحاور الخاصة بها عن طريق الحقن داخل الشبكية في الفئران والأرانب 32 33. في كلتا الدراستين، وقد تحقق وضع العلامات الانتقائي للRGCs والمحاور الخاصة بها عن طريق الحقن داخل الشبكية للمؤشر الكالسيوم صبغ ديكستران مترافق، تليها الحضانة 2 ساعة في 32 أرنب أو الحضانة 7 ساعات في الفئران 33. على الرغم من تقديم فترة حضانة كافية لضمان وضع العلامات موحد في شبكية العين، مثل هذه الأساليب تؤدي إلى زيادة وضع العلامات من RGCs والخاصةمحاور أقرب موقع الحقن مقارنة مع وضع العلامات متفرق في المناطق البعيدة إلى موقع الحقن. كما نوقش في بالدريدج (1996)، ووضع العلامات غير موحدة في موقع الحقن قد نسبت إلى وضع العلامات الأنتشارى من سوما نتيجة لامتصاص الصبغة على المكشوف (قطع) التغصنات، في حين وضع العلامات في المناطق البعيدة من المحتمل بسبب النقل إلى الوراء من امتصاص الصبغة في محور عصبي يتعرض 32. توفر تقنية لدينا أساليب محسنة لزيادة الوسم موحد للRGCs ومحاور وتقليل فترة الحضانة المطلوبة.

يوفر الحاضر طريقة صبغ تحميل استراتيجية بديلة إلى التقنيات التقليدية مثل تحميل البضائع السائبة و electroporation التي تؤدي إلى تحميل غير محدد من خلايا عديم الاستطالات النازحين في طبقة الخلايا العقدية. مع توافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا معربا عن tdTomato أو EGFP تحت سيطرة المروجين التي هي في السكان الخلايا العقدية محددة 34-38، تطبيق والمستقبليةإضافات لهذه التقنية قد تشمل دراسات التصوير الكالسيوم من الخلايا العقدية فرعية محددة الشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم الإفصاحات.

Acknowledgments

نشكر الدكتور S. ستيلا وهيلين فونج للمساهمات في بروتوكول التصوير الكالسيوم. نشكر صفائح الدكتور ك لتصوير مشاهد المقابلة. نشكر الدكتور أرلين هيرانو لتعليقاتها على المخطوطة. وأجري هذا المشروع البحث والتطوير من قبل المؤلفين في كلية ديفيد جيفن للطب في جامعة كاليفورنيا ويتم بفضل اتفاق العقد الذي منحت ويديرها البحوث الطبية وقيادة العتاد في الجيش الأميركي (USAMRMC) والتطبيب عن بعد والتكنولوجيا المتقدمة مركز الأبحاث (TATRC)، في فورت ديتريك بولاية ميريلاند تحت رقم العقد: W81XWH-10-2-0077. كما جاء الدعم لهذه الدراسات من المعاهد الوطنية للصحة EY04067 وVA الاستحقاق مراجعة (ملحوظة). الأهلي هو VA الوظيفي عالم أبحاث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

علم الأعصاب، العدد 92، المناعية، الأجسام المضادة، فلوو-4، والتصوير الكالسيوم وخلايا العقدة، شبكية العين، الفئران
طرق التصوير المناعى والكالسيوم في Wholemount الجرذ الشبكية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter