Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Immunhistokjemiske og kalsium avbildningsmetoder i Wholemount Rat Retina

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Immunhistokjemi protokoller brukes for å studere lokalisering av et bestemt protein i retina. Kalsium imaging teknikker er ansatt for å studere kalsium dynamikk i netthinnens ganglion celler og deres aksoner.

Abstract

I denne artikkelen beskriver vi verktøy, reagenser, og de praktiske tiltak som er nødvendig for: 1) vellykket utarbeidelse av wholemount netthinne for immunhistokjemi og, 2) kalsium bildebehandling for studiet av spenning gated kalsium kanal (VGCC) mediert kalsium signalisering i retinal ganglion-celler. Den kalsium avbildningsmetode vi beskrive omgår spørsmål om uspesifikk lasting av ford amacrine celler i ganglion celle laget.

Introduction

I retina-gangliecellene (RGCs) uttrykke L, N, P / Q-og T-type VGCC som bestemt ved farmakologisk blokkade av disse Komponentene av hele cellen Ca-kanalstrøm 1,2. VGCC er transmembrane multimere proteiner som er involvert i senderen utgivelsen, gentranskripsjon, celleregulering og synaptisk plastisitet 3,4,5. Funksjonelle VGCCs består av minst tre forskjellige klasser av subenheter: store, trans α en pore forming subenheter som etablerer kanalens biofysiske og farmakologiske egenskaper, først og fremst ekstracellulære hjelpe α 2 δ subenheter og intracellulære β subenheter. De to sistnevnte skjema heteromeric komplekser med forskjellige α en subenheter og endre gating kinetikk og trafficking av kanalene til plasmamembranen seks.

Over de siste tiårene har mange teknikker blitt ansatt for å studere protein EXPREssion, slik som immunhistokjemi, enzym-bundet immunosorbent assay, western analyse og strømningscytometri. Disse teknikkene krever bruk av spesifikke antistoffer for detektering av et gitt protein av interesse, og gir kraftige verktøy for lokalisering og fordeling av spesifikke proteiner i forskjellige vev. Teknikker som brukes til å påvise og kvantifisere mRNA-ekspresjonsnivåene av et bestemt protein slik som Northern blot analyse, RT-PCR, sanntids kvantitativ RT-PCR, in situ hybridisering, cDNA mikromatriser og ribonuklease beskyttelsestest gir en alternativ tilnærming når antistoffer er ikke lett tilgjengelig, eller hvis uttrykk nivåer av et bestemt protein er lave 7. Imidlertid er en begrensning på bruken av slike molekylære teknikker er den nødvendige identifisering av gensekvensen.

Å lokalisere proteiner i netthinnen, kan immunhistokjemi utføres på wholemount netthinne. På grunn av tilgjengeligheten av RGCs, den wholemountpreparatet gir en utmerket plattform for å studere lokalisering av spesifikke proteiner til RGC somata og deres aksoner.

I tillegg til deres lokalisering, kan enkelte funksjonelle egenskaper hos de VGCCs i RGCs demonstreres gjennom bruk av kalsium-avbildningsteknikker. Vi beskriver en kalsium bildebehandling protokoll for å selektivt merke RGCs med en kalsium indikator fargestoff å måle intracellulære kalsium dynamikk. Bidraget av forskjellige VGCCs til kalsium-signalet i forskjellige cellulære avdelinger kan isoleres ved bruk av subtype-spesifikke Ca-kanalblokkere.

Kanskje et av de mest fordelaktige aspekter av kalsium avbildningsteknikk som er beskrevet her er evnen til samtidig og uavhengig av hverandre opp fra flere RGCs og deres axoner. Selv om mange fysiologiske teknikker, for eksempel hele cellen patch clamp opptak, gi høy tidsoppløsning innspillinger av membran strømninger, det somatiske eller aksonal kilde these strømninger innspilte kan ikke bli diskriminert og opptak kan kun gjøres fra en enkelt nervecelle gangen. Multielectrode arrays (MEAS) er i stand til samtidig opptak av pigger fra mange celler, men kan heller ikke detektere eller diskriminere aktivering av, for eksempel, forskjellige subtyper av kalsiumkanaler. MEAS fortrinnsvis ta opp fra celler som er plassert i umiddelbar nærhet til en gitt elektrode 8 og ta opp fra celler som genererer store pigger ni. Optiske avbildningsmetoder gi en alternativ strategi for å aktivere samtidige og uavhengige opptak av hele populasjoner av celler som kan integreres med informasjon innhentet fra én celle microelectrode og patch clamp opptak og MEA opptak. Selv om kalsium-avbildningsteknikker som er beskrevet her ble anvendt for å studere de kalsium dynamikken i RGCs, kan patch clamp og MEAs også brukes i parallell for ytterligere å belyse de ioniske strømninger og tilsetnings egenskaper RGCs.

10, målet vårt var å bruke en laste teknikk som selektivt etiketter RGCs med en syntetisk kalsium indikator fargestoff i en wholemount forberedelse. Selv om syntetiske kalsium indikatorfargestoffer gir en utmerket plattform for studiet av den intracellulære kalsiumdynamikk, har sin utbredt bruk blitt hindret av manglende evne til å effektivt laste spesifikke populasjoner av nerveceller innenfor et gitt nettverk. Mange teknikker som bulklaste 11 og elektroporering 8,12 er blitt utført for å laste hele grupper av celler, men slike teknikker ikke diskriminerer mellom spesifikke celletyper. Genetisk kodede kalsium indikatorer gir evnen til selektivt å merke spesifikke populasjoner av celler, men slike metoder krever generering av transgene dyr 13. Vår teknikk beskriver en method for selektivt å merke RGCs i wholemount preparat via synsnervestump injeksjon av en kalsiumindikator fargestoff.

Tatt sammen, de strukturelle og fysiologiske teknikker beskrevet i denne artikkelen gi en plattform for å studere lokalisering og bidrag av VGCCs til kalsium signal i RGCs og deres aksoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene for velferd forsøksdyr utstedt av US Public Health Service Politikk på Human Care og bruk av forsøksdyr og University of California-Los Angeles (UCLA) Forsøksdyrutvalget. Hann og hunn voksne Sprague-Dawley rotter (Charles River Labs, Wilmington, MA) i alderen 3-5 uker ble anvendt.

1. Animal og Vevpreparerina for Wholemount Retina og Immunohistokjemi Protocol

  1. Forbered følgende materialer og verktøy: En dissekere mikroskop, 2 tang med veldig fine tips, saks, cellulose filter papir, plast pipette og et objektglass.
  2. Avlive rotte i et lukket kammer ved dypt bedøvelse av dyret med 1-3% isofluran fulgt ved halshugging med en giljotin. Fjern øynene med et par iris saks og plasser i en petriskål som inneholder ekstracellulære løsning. Hibernate A, Ames Memiddels eller fysiologiske løsninger anbefales.
  3. [Valgfritt trinn hvis tilbakefylling av RGCs med Fluo-4 ønskes]. Utfør Fluo-4-merking som beskrevet i trinn 2.3 til 2.4.
  4. Bruke dissekere mikroskop (lysintensitet: 1,6 x 10 8 fotoner / mm 2 ⋅sec), fjerne hornhinnen ved å kutte av foran øyet ballen. Fjern linsen og glasslegemet fra den indre overflaten retinal med pinsett. For å fjerne glasslegemet, stabil øyeeplet ved å holde sclera fast med en forcep. Forsiktig skrelle glassfoten mot sentrum av netthinnen med den andre forcep. Fremstillingen på dette stadium kalles øyekopp, som brukes for cryosections. Flere detaljer om cryosections kan bli funnet i referanser 14,15.
  5. Fjern netthinnen fra eyecup. Deretter lage fire kutt for å tillate netthinnen til å ligge flatt. Forsiktig montere netthinnen på et objektglass med fotoreseptoren lag opp. Tilsett en dråpe av oppløsningen på netthinnen og sette cellulose filterpapir på netthinnen. Når netthinnen festes til filterpapiret, plasseres på netthinnen tilbake i løsning. Hvis det er nødvendig, flate netthinnen med en børste eller tang.
  6. Plasser wholemounted netthinne til 4% PFA i 10-15 min for fiksering.
  7. Vask de wholemounted netthinne tre ganger i 30 minutter i 0,1 M fosfatbuffer (PB), pH 7.4. Blokker netthinne med 5% normalt geiteserum eller serum i esel 0.1 PB inneholdende 0,3% Triton X-100 og 0,1% NaN 3 ved 4 ° C over natten. Vi anbefaler et sluttvolum på 500 pl for alle trinnene å lagre blokkerer løsninger og antistoffer.
  8. Neste dag, inkuber retinae wholemounts med det primære antistoff i 5-7 dager ved 4 ° C. Optimale fortynninger må bestemmes av brukeren.
  9. Vask netthinne 3 x 30 minutter i 0,1 M PB og inkuber over natten ved 4 ° C i det tilsvarende fluoroforen-konjugert sekundært antistoff som er rettet mot arten av det primære antistoff (konsentrasjon 1: 1,000).
  10. Etter tre siste vasker av 30 min hver med PB, montere netthinne i monteringsmedium. Tett Dekk med neglelakk for langvarig lagring. Oppbevar prøver ved 4 ° C og beskyttes mot lys.

2. Merking av ganglion celler og Axoner i Rat Wholemount netthinne med en Kalsium Indicator Dye

  1. Forbered 1000 ml av pattedyr Ringers inneholdende (i mM) 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO3, og 10 glukose boblet med 95% O 2/5% CO ­ 2.
  2. Utfør disseksjon som beskrevet i trinn 1.2 til 1.4.
  3. For å laste retinal ganglion celler (RGCs) og deres aksoner med en kalsium indikator fargestoff, injisere 0,5 mL av Fluo-4 Penta salt (40 mM lager i H 2 O) inn i synsnerven stubben ca 1 mm posteriort for øyeeplet med en sprøyte . For å måle dynamiske økninger i ganglion celle [Ca 2 + i en indikator med høy affinitet, som f.eks Fluo-4 med sin K d av 345 nM, er optimal. Fluo-4 har den ytterligere fordel av å ha en svært høy kvantumutbytte resulterer i en økning av utslipps> 100 ganger når det er bundet til kalsium.
  4. Plasser øyemusling i pattedyr Ringers boblet med 95% O 2/5% CO ­ 2 i 1 time ved romtemperatur i mørket.

3. Kalsium Imaging Protokoll for retina ganglion celler og Axoner.

  1. Fjern det øye, linse og glasslegemet som beskrevet i trinn 1.1 til 1.4. Isoler netthinnen fra eyecup og del den opp i kvadranter. Mount en kvadrant ganglion celle siden opp på et glass slide og bruke en harpe skive rutenett for å stabilisere den. Hold de andre brikkene mørk-tilpasset i pattedyr Ringers boblet med 95% O 2/5% CO ­ 2 på is for senere bruk.
  2. Superfuse opptaket kammer med pattedyr Ringer løsning ogholde løsningen bobler kontinuerlig med 95% O2 / 5% CO2.
  3. Bilde vevet under mikroskop. Utføre eksperimenter ved romtemperatur (~ 23 ° C) eller for å oppnå fysiologiske temperaturer ved oppvarming av fasen, oppvarming av vannbadet under prøven eller å anvende varm luft til overflaten av prøven.
    Merk: Det er viktig å merke seg at mange cellulære funksjoner er regulert av temperatur, som spiller en nøkkelrolle i å opprettholde intracellulær homeostase 16. Imidlertid kan innføring av oppvarming tiltak øker frekvensen av fotobleking, fordampning av mediet og fokus avdrift forårsaket av termisk utvidelse 17.. Bruk av romtemperaturen synker intracellulær compartmentalization av Fluo-4 18.
  4. Utføre en kontroll av to sammenkoblede høye K + pulser i fravær av legemidler. Depolarize RGCs og RGC axoner ved å heve [K +] o fra 3 mm til 60 mm For 33 sekunder under hver puls for å aktivereVGCCs med en åtte-kanal tyngdekraften drevet super system. Reduser Na + med 57 mM for å opprettholde isosmolarity i høy K +-løsning.
  5. Vurdere bidraget av forskjellige VGCCs til kalsium-signalet med bruk av generelle eller spesifikke Ca-kanalblokkere. For eksempel, reduksjon i kalsium-signal som følge av administrering av et ikke-spesifikt kalsiumkanalblokker, kobolt, ga en semi-kvantitativt mål på bidraget fra de VGCCs til den høye K + -evoked kalsium signal.
  6. Erverve fluorescens intensitetsverdier ved å plassere en region av interesse (ROI) rundt RGCs av interesse (figur 2).
  7. Normaliser endringen i fluorescens intensiteten produsert av den andre av høy K + topp til endringen produsert av den første høye K + topp. Så, for testing av spesifikke kalsiumkanalblokkere, bruke narkotika bare i løpet av andre høyt K + pulsen på et par og normalisere denne toppen motden første toppverdien. For å måle virkningen av medikamentet på den høye K + topp, dividere amplituden for den andre K + topp ved at den første. Analyse skal utføres på disse verdiene med hensyn til deres samsvarende kontroller som stammer fra sammenkoblet med høy K + topper målt i fravær av medikament.
  8. Hente bilder på 5 sek mellomrom. For å unngå foto-bleking, holde laser eksitasjon så lavt som mulig. Gi eksitasjon ved 488 nm linjen i argon-laser, mens fotomultiplikatorrør samler fluorescensemisjonen gjennom et 505 nm filter LP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunolabeling med spesifikke antistoffer gir en plattform for å studere lokalisering av spesielle proteiner av interesse i retina og kalsium avbildningsteknikk tillater studiet av bidraget av de VGCCs til kalsium dynamikk i retina-gangliecellene og deres axoner.

Ved å bruke et antistoff mot ganglion celleprotein RBPMS (RNA-bindende protein med flere spleising) som selektivt etiketter RGCs 19, var vi i stand til å vise at Fluo-4 merking er begrenset til ganglion-celler (figur 1). Stump-injeksjon ikke fører til merking av alle ganglion celler som kan forventes fra denne teknikken.

En kanin polyklonalt antistoff ble generert mot N-terminus av polypeptidet RBPMS (RBPMS 4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, av en kommersiell leverandør (tabell 1). RBPMS er sterkt konservert blant pattedyr, og polypeptidsekvensen benyttes for immunisering er identisk i mus, rotte, ape og menneske (NCBI Protein Bank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Kanin sera ble oppsamlet etter immunisering og affinitetsrenset ved å bruke et polypeptid RBPMS affinitetskolonne. Den affinitetsrenset antistoff ble vist å immunostain ganglion-celler i mus og rotter hinnen. For å evaluere spesifisiteten til RBPMS farging, ble en preabsorption kontroll utført med kanin-antistoff. I korthet ble den RBPMS antistoff fortynnet i 0,1 M PB inneholdende 0,5% Triton X-100 og blandet med RBPMS polypeptid ved en sluttkonsentrasjon på 1 pg / ml i 2 timer ved RT. Ingen RBPMS farging var tilstede i vevssnitt inkubert med kanin-antistoffer til å preabsorbed RBPMS og bearbeidet ved standard immunhistokjemiske teknikker.

s.jpg "width =" 600 "/>
Figur 1: Post-hoc farging med antistoffer mot RGC protein RBPMS (rød) for å vise Fluo-4 (grønn) lokalisering til ganglieceller en Alexa 568 geit anti-kanin sekundært antistoff ble brukt.. Målestokk: 20 mm.

Kalsium avbildningsteknikker blir brukt til å studere bidraget av VGCCs til kalsium signal i RGCs og deres axoner. Fluorescent intensitetsverdier ble kjøpt ved å plassere ROI på RGCs av interesse (figur 2).

Figur 2
Figur 2: For å skaffe fluorescerende intensitetsverdier, ble Rois plassert på ganglion celle somata og / eller axoner Scale bar:. 50 mm.

Fluo-4 Pentakalium- salt ble brukt til å merke RGCs og deres aksoner (figur 3).


Figur 3: VGCC subtyper som bidrar til kalsium signalisering i ganglion celle somata og deres aksoner. (A) Confocal bilde av en wholemount netthinnen ved baseline nivå. RGCs og RGC axoner kan ses merket med Fluo-4. (B) Fluorescent signaler fra én RGC somata demonstrere økning i gjennomsnittlig fluorescens intensitet utløst av sammenkoblede pulser av høy-K + (60 mm) badeløsning og den påfølgende reduksjonen i fluorescens i nærvær av kobolt i løpet av andre puls. Scale bar for A: 20 mm.

Zeiss LM5 Pascal systemet ble satt til å ta bilder på en bildefrekvens på 5 sek og hver fullformat scan tok 1,57 sek på innstillingene som brukes. En samling område på 318 um x 318 um ble inkludert i det skannede område av 512 x 512 pixels gir et areal på 0.385 mikrometer 2 per piksel. Disse innstillingene kan bli variert avhengig av den ønskede oppløsning. Systemet benytter en 25 mW argon laser for 488 nm eksitasjon. Vi brukte denne linjen på 3% strøm. Metning ble minimalisert ved først å velge den laveste konsentrasjon av kalsium indikatorfargestoff som ga de robuste responser til den depolariserende stimuli, og deretter ved å redusere utgangsforsterkning. Reduksjon av laser makt hjalp til med å unngå bleking. Indikator konsentrasjonen ble ikke målt. Kalibrering av ikke-ratiometrisk avbildning er mulig med bruk av kalsium ionophores, men tilbakefylling teknikken kan arbeide med ratiometrisk fargestoffer i tillegg. For å bestemme den optimale indikator konsentrasjon, sammenlignet vi depolarisering-fremkalt endring i fluorescens med stubbe-injisert konsentrasjoner av Fluo-4 som strekker seg 1-40 mm. Sirkulære og ovale ROIs ble trukket rundt henholdsvis RGCs og deres aksoner, som viste stabil fluorescens intensitet. RGCs og axoner som drev ut avfokusere på grunn av bevegelse forårsaket av superfusjons ikke ble valgt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen har vi beskrevet to ulike teknikker: 1) Immunhistokjemi å vise Fluo-4 lokalisering til ganglion celler i netthinnens wholemounts, og 2) Kalsium bildebehandling å analysere kalsium dynamikk i netthinnens ganglion celler og deres aksoner.

Immunhistokjemi hjelp wholemounts har blitt brukt til å avsløre lokalisering av proteiner i gnager retina 20-23. Det er imidlertid noen begrensninger. Kvaliteten av fargings er sterkt avhengig av evnen til antistoffet til å gjenkjenne sin respektive antigen og dets evne til å trenge inn i den netthinnevev til den spesielle grunnslag av interesse. Disse problemene kan forbedres ved å øke inkubasjonstid i det primære antistoff med opp til syv dager, øke konsentrasjonen av Triton-X og / eller inkubering av netthinnen uten filterpapiret for å tillate diffusjon av antistoffet via ganglion cellelaget og fotoreseptorene. En annen begrensning er duratipå, og konsentrasjonen av fiksering. Noen antistoffer virker bedre når vevet er løst for en time, mens andre antistoffer krever en kortere periode fiksering. Likeledes, mens visse antistoffer fungerer best i 4% PFA fiksering, andre fungerer bedre til reduserte konsentrasjoner. Det anbefales at brukeren bestemme den optimale varighet og konsentrasjon av fiksering, og varigheten av inkubasjonen er konsentrasjonen av Triton-X, i tillegg til konsentrasjonen av det primære antistoff for optimale resultater.

Kalsium avbildning ble brukt til å studere kalsium dynamikk i retina-gangliecellene og deres axoner. Superfusjons av VGCC blokkerende midler tillot evaluering av den relative blokkerende effekt av de stoffer, og tilstedeværelsen av forskjellige Ca-kanalundertyper. I det tilfelle at RGCs axoner og ikke reagerer på høyt K +, forsøke å redusere konsentrasjonen av kalsium indikatorfargestoff, som høye konsentrasjoner kan føre til metning. Ufullstendig fjerning av glasslegemetkan også fungere som en barriere, og hindrer høye K + fra å nå RGCs og deres axoner. I tillegg, kan unnlatelse av å korrekt feste harpe på toppen av retina forårsake bevegelse, noe som resulterer i en manglende evne til å erverve fluorescensintensitet verdier. Hvis netthinnen fortsetter å flytte, fjerne nøye harpe, tørk området rundt netthinnen og re-montere harpe ved å legge til mer fett på sin omkrets. Fullstendig fjerning av glasslegemet og minimal bevegelse av retinal wholemount er avgjørende for å lykkes i forsøket.

Agonister av kalsium-gjennomtrengelig glutamat-reseptorer som uttrykkes av RGCs slik som N-metyl-D-aspartat (NMDA), 24,25 α-amino-3-hydroksy-5-metylisoksazol-4-propionat (AMPA) og kainat-reseptorer lignende ionotrofiske glutamatreseptorer 26-29, kan anvendes til å fremkalle direkte inntasting av kalsium, så vel som tilveiebringe en depolariserende stimuli som aktiverer VGCCs. Utnyttelse av slike agonister kan føre til en ikke-uniform respons på grunn av den differensielle ekspresjonen av glutamat-reseptor-undertyper til de forskjellige typer av RGCs. To-fotonmikroskopi kan også benyttes for å undersøke lys-fremkalt kalsiumsignaler i RGCs 30 og deres dendritter 31.

Selektiv merking av RGCs ble oppnådd på grunn av membran impermeant egenskapene til Fluo-4 Penta salt kalsium indikatorfargestoff. Dekstran-konjugert kalsium indikatorfargestoffer har også blitt brukt til å selektivt merke RGCs og deres axoner via intraretinal injeksjoner i kanin 32 og rotte 33. I begge studiene ble selektiv merking av RGCs og deres axoner oppnås via intraretinal injeksjoner av dekstran-konjugerte kalsiumindikator fargestoff, etterfulgt av en 2 timers inkubering i kanin 32 eller en 7 timers inkubasjon i rotte 33. Til tross for å gi en tilstrekkelig inkubasjonstid å sikre enhetlig merking i netthinnen, slike metoder resultere i økt merking av RGCs og deresaxoner nærmeste injeksjonsstedet sammenlignet med sparsom merking i regioner distale til injeksjonsstedet. Som omtalt i Baldrige (1996), ikke-uniform merking på injeksjonsstedet har blitt tilskrevet diffusjon merking av soma som følge av fargestoff opptak på den eksponerte (cut) Dendritt, mens merking i distale regioner skyldes sannsynligvis retrograd transport fra opptak av fargestoffet på den eksponerte axon 32. Vår teknikk gir forbedrede metoder for å øke ensartet merking av RGCs og deres axoner og for å minimere den nødvendige inkubasjonstid.

Foreliggende fargestoff lastemetode gir en alternativ strategi for å konvensjonelle teknikker slik som bulk lasting og elektroporering som resulterer i ikke-spesifikk belastning av ford amacrine celler i ganglion cellelaget. Med tilgjengeligheten av transgene mus linjer uttrykker tdTomato eller EGFP under kontroll av arrangører som er i bestemte ganglion celle populasjoner 34-38, fremtidige Applications av denne teknikken kan omfatte kalsium imaging studier av spesifikke retinal ganglion celle undergrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer.

Acknowledgments

Vi takker Dr. S. Stella og Helen Vuong for bidrag til kalsium bildebehandling protokollen. Vi takker Dr. K. blad for filming intervju scener. Vi takker Dr. Arlene Hirano for hennes kommentarer til manuskriptet. Dette FoU-prosjekt ble gjennomført av forfatterne ved David Geffen School of Medicine ved UCLA og er gjort mulig av en kontrakt avtale som ble tildelt og administreres av US Army Medical Research & forsyningskommando (USAMRMC) og telemedisin & Advanced Technology Research Center (TATRC), ved Fort Detrick, MD under kontrakt Antall: W81XWH-10-2-0077. Støtte for disse studiene også kom fra NIH EY04067 og en VA Merit omtale (NB). NCB er en VA Career Forsker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

Nevrovitenskap immunhistokjemi antistoff fluo-4 kalsium bildebehandling ganglion celler retina rotte
Immunhistokjemiske og kalsium avbildningsmetoder i Wholemount Rat Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter