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Neuroscience

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Abstract

Neste artigo descrevemos as ferramentas, os reagentes e os passos práticos que são necessários para: 1) preparação bem-sucedida de retinas wholemount para imunohistoquímica e, 2) imagens de cálcio para o estudo da tensão fechado de canais de cálcio (VGCC) mediada sinalização de cálcio na retina células ganglionares. O método de imagem de cálcio que descrevem problemas contorna relativas à carga não-específica de células amácrinas deslocadas na camada de células ganglionares.

Introduction

As células ganglionares da retina (RGCs) expressar L, N, P / Q e T-tipo VGCC como determinado por meio do bloqueio farmacológico desses componentes de toda a célula actual canal Ca 1,2. VGCC são proteínas transmembrana multim�icos que estão envolvidos na liberação do transmissor, a transcrição do gene, regulação celular e sináptica 3,4,5 plasticidade. VGCCs funcionais são compostos de pelo menos três classes distintas de subunidades: grandes, transmembrana α 1 poro formando subunidades que estabelecem propriedades biofísicas e farmacológicas do canal, principalmente extracelular α auxiliar 2 δ subunidades e subunidades β intracelulares. Os dois últimos formam complexos heterom�icas com diferentes α um subunidades e alterar a cinética de propagação e tráfico de canais para a membrana plasmática 6.

Nas últimas décadas, várias técnicas têm sido empregadas para estudar expre proteínassion, tais como imuno-histoquímica, ligada ensaio imunoenzimático, análise de Western e citometria de fluxo. Estas técnicas requerem a utilização de anticorpos específicos para a detecção de uma determinada proteína de interesse e fornecem ferramentas poderosas para a localização e distribuição de proteínas específicas em diferentes tecidos. As técnicas usadas para detectar e quantificar níveis de uma proteína particular de expressão de ARNm, tais como a análise de manchas de Northern, RT-PCR, em tempo real quantitativa de RT-PCR, hibridação in situ, de microarrays e ensaio de protecção de ribonuclease proporcionam uma abordagem alternativa, quando os anticorpos não são prontamente os níveis de expressão ou se disponíveis de uma proteína particular são baixos 7. No entanto, uma limitação para a utilização de tais técnicas moleculares é necessária a identificação da sequência do gene.

Para localizar as proteínas na retina, imuno-histoquímica pode ser realizada em retinas wholemount. Devido à acessibilidade das CGR, a wholemountpreparação fornece uma plataforma excelente para o estudo da localização de proteínas específicas para o RGC somata e seus axónios.

Em adição à sua localização, algumas propriedades funcionais dos VGCCs em CGRs pode ser demonstrada através da utilização de técnicas de imagiologia de cálcio. Descreve-se um protocolo de imagens de cálcio para etiquetar selectivamente CGR com um corante indicador de cálcio para medir a dinâmica de cálcio intracelulares. A contribuição de diferentes VGCCs ao sinal de cálcio em diferentes compartimentos celulares podem ser isoladas com o uso de bloqueadores dos canais de Ca específicos do subtipo.

Talvez um dos aspectos mais benéficos da técnica de imagiologia de cálcio descritos aqui é a capacidade de gravar, simultaneamente e de forma independente a partir de múltiplas CGR e seus axónios. Embora muitas técnicas fisiológicas, como a correção de células gravação braçadeira todo, proporcionar gravações de alta resolução temporal das correntes de membrana, o somático ou fonte axonal de these correntes gravados não podem ser discriminados e gravações só pode ser feita a partir de um único neurónio de cada vez. Matrizes multieletrodo (AMA) são capazes de gravar simultaneamente picos de muitas células, mas podem detectar e nem discriminar a ativação de, por exemplo, diferentes subtipos de canais de cálcio. Meas preferencialmente gravar a partir de células que estão localizadas na proximidade de um determinado eletrodo 8 e gravar a partir de células que geram grandes picos de 9. Métodos de imagem Optical fornecer uma estratégia alternativa para permitir que as gravações simultâneas e independentes de populações inteiras de células que podem ser integrados com as informações obtidas a partir de uma única célula de microeletrodos e remendo gravação de fixação e gravação de MEA. Embora tenham sido empregues as técnicas de imagiologia de cálcio descritos aqui para estudar a dinâmica de cálcio de CGRs, sujeição do emplastro e AAM também podem ser utilizados em paralelo para elucidar as correntes iónicas e propriedades spiking de CGRs.

10, o nosso objetivo era usar uma técnica de carga que rotula seletivamente CGR com um corante indicador de cálcio sintético em um preparação wholemount. Embora corantes indicadoras de cálcio sintéticos fornecem uma excelente plataforma para o estudo da dinâmica de cálcio intracelular, a sua utilização generalizada tem sido dificultado pela incapacidade para carregar de forma eficaz as populações específicas de neurónios no interior de uma determinada rede. Muitas técnicas, tais como volume de carga 11 e eletroporação 8,12 foram realizados para carregar populações inteiras de células, no entanto, essas técnicas não discriminar entre tipos específicos de células. Geneticamente codificado indicadores de cálcio fornecem a capacidade para identificar selectivamente populações específicas de células, no entanto, estes métodos requerem a geração de animais transgénicos 13. Nossa técnica descreve uma metod etiquetar seletivamente CGR na preparação wholemount via óptica injeção coto do nervo de um corante indicador de cálcio.

Tomadas em conjunto, as técnicas estruturais e fisiológicas descritas neste artigo fornecer uma plataforma para o estudo da localização e da contribuição dos VGCCs para o sinal de cálcio no CGR e seus axônios.

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Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações para o bem-estar dos animais experimentais de emissão da Política de Serviço de Saúde Pública dos EUA em Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e da Universidade da Califórnia-Los Angeles (UCLA) Comitê de Pesquisa Animal. Foram utilizados Macho e fêmea adultos ratos Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre a idade de 3-5 semanas.

1. Animais e Preparação de tecidos para Wholemount Retina e imunohistoquímica Protocolo

  1. Prepare os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, 2 pinças com pontas muito finas, tesouras, papel de filtro de celulose, pipeta de plástico e uma lâmina de microscópio.
  2. Eutanásia o rato numa câmara fechada por profundamente anestesiar os animais com 1-3% de isoflurano seguido por decapitação com uma guilhotina. Remover os olhos com um par de tesouras e de íris lugar em uma placa de Petri contendo a solução extracelular. Hibernate A, Ames-medium ou soluções fisiológicas são recomendados.
  3. [Etapa opcional se aterro de CGR com Fluo-4 é desejado]. Realizar a rotulagem de Fluo-4, conforme descrito no 2,3-2,4 passos.
  4. Utilizando o microscópio de dissecação (intensidade de luz: 1,6 x 10 8 fotões / mm 2 ⋅sec), remover a córnea cortando a parte dianteira do globo ocular. Retirar a lente e vítreo a partir da superfície interior da retina com uma pinça. Para remover o vítreo, estabilizar o globo ocular, mantendo a esclera firmemente com uma pinça. Descascar delicadamente a base vítrea para o centro da retina com a outra pinça. A preparação nesta fase é chamada a ocular, a qual é usada para criocortes. Mais detalhes sobre criocortes podem ser encontradas em referências 14,15.
  5. Retire a retina do ocular. Em seguida, faça quatro cortes para permitir a retina para colocar o plano. Gentilmente montar a retina numa lâmina de microscópio com o fotorreceptor camada de cima. Adicionar uma gota de solução para a retina e colocar cepapel de filtro llulose na retina. Uma vez que a retina atribui ao papel de filtro, colocar a retina para trás em solução. Se necessário, achatar a retina com uma escova ou uma pinça.
  6. Coloque as retinas wholemounted em PFA 4% por 10-15 min para fixação.
  7. Lavam-se as retinas wholemounted três vezes durante 30 min em tampão fosfato 0,1 M (PB), pH 7,4. Bloquear as retinas com 5% de soro normal de cabra ou soro de burro em PB 0,1 contendo 0,3% de Triton X-100 a 0,1% e NaN 3 a 4 ° C durante a noite. Recomendamos um volume final de 500 mL para todas as etapas para salvar soluções de bloqueio e anticorpos.
  8. No dia seguinte, incubar as wholemounts retinas com os anticorpos primários 5-7 dias a 4 ° C. As diluições ótimas deve ser determinado pelo usuário.
  9. Lava-se a retina 3 x 30 min em 0,1 M PB e incubar durante a noite a 4 ° C, em que o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo correspondente que é dirigido contra a espécie de anticorpo primário (concentração de 1: 1000).
  10. Após três lavagens final de 30 min cada um com PB, montar as retinas em meio de montagem. Vedar as lamelas com unha polonês para o armazenamento prolongado. Armazene as amostras a 4 ° C e proteger da luz.

2 Rotulagem de células ganglionares e axônios Rat Wholemount Retinas com Cálcio Indicador Dye

  1. Preparar 1000 ml de Ringer de mamífero contendo (em mM) 125 de NaCl, 3 de KCl, 2 CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 de MgCl2, 25 de NaHCO3, 10 de glucose e borbulhado com 95% de O2 / 5% de CO ­ 2.
  2. Efectuar a dissecção como descrito no 1,2-1,4 passos.
  3. Para carregar as células ganglionares da retina (RGCs) e seus axónios com um corante indicador de cálcio, injectar 0,5 ul de Fluo-4 sal pentapotássio (40 mM em H 2 O) para o coto do nervo óptico de cerca de 1 mm posterior ao globo ocular, utilizando uma seringa . Para medir um aumento dinâmico em células ganglionares da [Ca2 + i um indicador com elevada afinidade, tais como Fluo-4 com o seu K d de 345 nM, é óptima. Fluo-4 oferece a vantagem adicional de possuir uma elevada eficiência quântica, resultando num aumento das emissões de> 100 vezes quando ligado ao cálcio.
  4. Coloque a ocular no borbulhar com 95% de O2 / 5% de CO de Ringer de mamífero ­ 2, durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro.

3. Cálcio imagem Protocolo de células ganglionares da retina e axônios.

  1. Remover o olho, da lente e vítreo, tal como descrito nos passos 1,1-1,4. Isolar a retina do ocular e divida em quadrantes. Montagem lado de células ganglionares um quadrante se numa lâmina de vidro e usar uma grade fatia harpa para estabilizá-la. Mantenha as outras peças escuro adaptado em aeradas com 95% de O2 / 5% CO mamíferos de Ringer ­ 2 em gelo para posterior utilização.
  2. Superfuse a câmara grava com solução de Ringer e mamíferosmanter a solução borbulhar continuamente com 95% O2 / 5% de CO 2.
  3. Imagem do tecido sob o microscópio. Realizar experiências à temperatura ambiente (~ 23 ° C), ou atingir temperaturas fisiológicas por aquecimento da fase, o aquecimento do banho de água por baixo da amostra, ou a aplicação de ar quente para a superfície do espécime.
    Nota: É importante notar que muitas funções celulares são regulados pela temperatura, que desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase intracelular 16. No entanto, a introdução de medidas de aquecimento pode aumentar a taxa de fotodegradação, a evaporação do desvio médio e foco causada pela expansão térmica 17. Utilização de temperatura ambiente diminui compartimentalização intracelular de Fluo-4 18.
  4. Executar um controlo de dois de K + pulsos emparelhados elevados na ausência de drogas. Despolarizar RGCs e RGC axónios através do aumento da [K +] o de 3 mM a 60 mM durante 33 segundos, durante cada pulso para activarVGCCs com um sistema de superfusão impulsionado oito gravidade canal. Reduzir o Na + por 57 mM para manter isosmolarity na solução de elevado K +.
  5. Avaliar a contribuição de diferentes VGCCs ao sinal de cálcio com o uso de bloqueadores dos canais de Ca gerais ou específicas. Por exemplo, a redução no sinal de cálcio após a administração de um bloqueador do canal de cálcio não-específica, o cobalto, fornecida uma medida semi-quantitativa da contribuição dos VGCCs ao sinal -evoked cálcio de K + elevado.
  6. Adquirir os valores de intensidade de fluorescência através da colocação de uma região de interesse (ROI) em torno das CGR de interesse (Figura 2).
  7. Normalizar a mudança na intensidade de fluorescência produzida pelo segundo pico de K + elevado para a alteração produzida por o primeiro pico de K + elevado. Em seguida, para o teste de bloqueadores dos canais de cálcio específicos, aplicar drogas apenas durante o segundo pulso de K + elevado de um par e normalizar este pico contrao primeiro valor de pico. Para medir o efeito do fármaco sobre a K + elevado pico, dividir a amplitude do segundo pico de K + pelo que a do primeiro. A análise deve ser executada em estes valores em relação aos seus controlos correspondentes derivados de K + elevado emparelhado picos medidos na ausência de fármaco.
  8. Adquira imagens em intervalos de 5 seg. Para evitar a foto-branqueamento, manter o laser de excitação o mais baixo possível. Fornecer excitação pela linha 488 nm do laser de árgon, enquanto o tubo fotomultiplicador recolhe a emissão de fluorescência através de um filtro PB de 505 nm.

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Representative Results

Imunomarcação com anticorpos específicos proporciona uma plataforma para o estudo da localização de proteínas de interesse particular na retina e na técnica de imagiologia de cálcio permite o estudo da contribuição dos VGCCs para a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axónios.

Ao utilizar um anticorpo contra as células ganglionares RBPMS proteína (proteína de ligação de ARN com splicing múltipla) que rotula selectivamente CGRs 19, fomos capazes de demonstrar que a rotulagem de Fluo-4 está limitada a células ganglionares (Figura 1). Stump-injeção não leva à rotulagem de todas as células ganglionares como pode ser antecipada a partir dessa técnica.

Um anticorpo policlonal de coelho foi produzido contra o N-terminal do polipeptídeo RBPMS (RBPMS 4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, por um fornecedor comercial (Tabela 1). RBPMS é altamente conservada entre mamíferos e a sequência polipeptídica utilizada para a imunização é idêntico no ratinho, rato, macaco e humano (NCBI Protein Bank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Os soros dos coelhos após imunização foi recolhido e purificado por afinidade utilizando uma coluna de afinidade de polipéptido RBPMS. O anticorpo purificado por afinidade foi mostrado para imunocoloração de células ganglionares da retina de rato e ratinho. Para avaliar a especificidade da imunocoloração RBPMS, um controlo de pré-absorção foi realizada com o anticorpo de coelho. Resumidamente, o anticorpo RBPMS foi diluída em PB 0,1 M contendo 0,5% de Triton X-100 e mistura-se com o polipéptido RBPMS a uma concentração final de 1 ug / ml durante 2 horas à temperatura ambiente. Nenhuma imunocoloração RBPMS estava presente em secções de tecido foram incubadas com os anticorpos de coelho pré-absorvido para RBPMS e transformados por meio de técnicas de imuno-histoquímica padrão.

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Figura 1: imunocoloração post-hoc com anticorpos contra as proteína RBPMS RGC (vermelho) para mostrar Fluo-4 (verde) de localização para as células ganglionares Uma Alexa 568 anti-coelho de cabra de anticorpo secundário foi utilizado.. Barra de escala: 20 mm.

Técnicas de imagem de cálcio são usados ​​para estudar a contribuição das VGCCs ao sinal de cálcio nas CGR e seus axónios. Os valores de intensidade de fluorescência foram adquiridos através da colocação de ROIs nas CGRs de interesse (Figura 2).

Figura 2
Figura 2: A fim de adquirir os valores de intensidade de fluorescência, as ROI foram colocados no somata e / ou barra de escala de axónios de células do gânglio:. De 50 mm.

Fluo-4 pentapotássio sal foi utilizado para marcar CGR e seus axónios (Figura 3).


Figura 3: subtipos VGCC que contribuem para a sinalização de cálcio em células do gânglio somata e seus axónios. (A) imagem confocal de uma retina wholemount em níveis basais. RGCs e RGC axónios podem ser vistos marcado com fluo-4. (B) dos sinais fluorescentes a partir de um único somata RGC demonstrando o aumento da intensidade média de fluorescência induzida por pulsos emparelhados de alto-K + (60 mM) de solução de banho e a redução subsequente no fluorescência na presença de cobalto, durante o segundo impulso. Barra de escala para A: 20 mm.

O sistema Zeiss LM5 Pascal foi criado para capturar imagens a uma taxa de quadros de 5 segundos e cada digitalização full frame levou 1.57 segundos com as regulações utilizadas. Uma área de recolha de 318 um x 318 um foi incluído na região digitalizada de 512 x 512 pixels dando uma área de 0,385 mM 2 por pixel. Essas configurações podem variar dependendo da resolução desejada. O sistema usa um laser de Árgon de 25 mW para a excitação a 488 nm. Nós usamos esta linha de 3% de energia. A saturação foi minimizado seleccionando primeiro a menor concentração do corante indicador de cálcio, o que proporcionou as respostas robustas para o estímulo de despolarização e, em seguida, através da redução de ganho de saída. Redução de potência do laser ajudou a evitar a descoloração. Concentração indicador não foi medido. Calibração de imagem não radiométrica é possível com a utilização de ionóforos de cálcio, mas a técnica de aterro pode trabalhar com corantes raciométrica bem. Para determinar a concentração indicador ideal, nós comparamos a mudança evocados despolarização da fluorescência com concentrações injetou-tronco de Fluo-4 que vão 1-40 mM. ROIs circulares e ovais foram desenhada em torno CGR e seus axônios, respectivamente, que apresentaram intensidade de fluorescência estável. CGR e axônios que vagavam defoco devido ao movimento provocado pelo superfusão não foram seleccionadas.

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Discussion

Neste artigo, descrevemos duas técnicas diferentes: 1) Imunohistoquímica para mostrar Fluo-4 de localização para as células ganglionares da retina em wholemounts, e 2) Imagem de cálcio para analisar a dinâmica de cálcio em células ganglionares da retina e seus axônios.

A imuno-histoquímica utilizando wholemounts foi usado para revelar a localização de proteínas no roedor retina 20-23. No entanto, existem algumas limitações. A qualidade da coloração depende muito da capacidade do anticorpo para reconhecer o seu respectivo antigénio e a sua capacidade para penetrar no tecido da retina para a camada de interesse particular. Estes problemas podem ser melhorados através do aumento do período de incubação em que o anticorpo primário por até sete dias, aumentando a concentração de Triton-X e / ou a incubação da retina sem o papel de filtro para permitir a difusão do anticorpo através da camada de células ganglionares e os fotorreceptores. Outra limitação é a duratie na concentração de fixação. Alguns anticorpos funcionam melhor quando o tecido é fixado, durante uma hora, enquanto outros anticorpos requerem um período de fixação mais curtos. Da mesma forma, enquanto alguns anticorpos funcionam melhor em 4% PFA fixação, outros trabalham melhor em concentrações reduzidas. É recomendável que o utilizador determinar a duração óptima e da concentração de fixação, a duração de incubação, a concentração de Triton-X, bem como a concentração do anticorpo primário para resultados óptimos.

Imagem de cálcio foi utilizado para estudar a dinâmica de cálcio em células ganglionares da retina e seus axônios. Superfusão de agentes bloqueadores VGCC permitiu a avaliação da eficácia relativa do bloqueio das drogas e na presença de diferentes subtipos de canais de Ca. No caso de CGRs e axónios não respondem a K + elevado, tentar reduzir a concentração do corante indicador de cálcio, como concentrações elevadas podem levar a uma saturação. Remoção incompleta do vítreotambém pode agir como uma barreira, impedindo alto K + de alcançar as CGR e seus axônios. Além disso, a falha da montagem adequada harpas no topo da retina pode causar o movimento, o que resulta numa incapacidade para adquirir os valores de intensidade de fluorescência. Se a retina continua a se mover, retire cuidadosamente a harpa, secar a área em torno da retina e voltar a montar a harpa, adicionando mais gordura para seu perímetro. A remoção completa do movimento do vítreo e mínima do wholemount retina é crucial para o sucesso da experiência.

Os agonistas dos receptores de glutamato de cálcio-permeável expressas por CGRs, tais como N-metil-D-aspartato (NMDA), 24,25 α amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propionato (AMPA) e do tipo cainato Os receptores de glutamato ionotrópicos 26-29, pode ser usado para provocar a entrada directa de cálcio, bem como proporcionar um estímulo que activa VGCCs despolarizante. A utilização de tais agonistas pode conduzir a um produto nãoresposta -uniform devido à expressão diferencial dos subtipos de receptores de glutamato para os diferentes tipos de CGRs. Microscopia de dois fotões podem também ser utilizados para investigar os sinais de cálcio evocado-luz em CGRs 30 e suas dendrites 31.

Marcação selectiva de CGR foi conseguida devido às propriedades de membranas impermeabilizantes do corante indicador de cálcio Fluo-4 sal pentapotássio. Corantes indicadoras de cálcio dextrano conjugado também têm sido utilizados para etiquetar selectivamente CGR e seus axónios através de injecções intra-retinianas coelho em 32 e 33 de rato. Em ambos os estudos, a marcação selectiva de CGR e seus axónios foi conseguida através de injecções intra-retinianas do corante indicador de cálcio dextrano conjugado, seguido de uma incubação de 2 h em 32 de coelho ou de uma incubação de 7 horas em 33 de rato. Apesar de proporcionar um período de incubação suficiente para garantir a rotulagem uniforme na retina, estes métodos resultam num aumento da marcação das CGR e os seusaxônios mais próximas do local da injeção em relação à rotulagem escassa nas regiões distais ao local da injeção. Como discutido em Baldrige (1996), rotulagem não uniforme no local de injecção tem sido atribuída a rotulagem de difusão do soma, como resultado da absorção do corante para o (corte) dendrito exposta, enquanto a rotulagem em regiões distais é provavelmente devido a um transporte retrógrado de absorção do corante no axônio expostos 32. A nossa técnica fornece métodos melhorados para aumentar a marcação uniforme das CGR e seus axónios e para minimizar o período de incubação.

O método de carregamento de corante presente proporciona uma estratégia alternativa com técnicas convencionais, tais como a carga a granel e electroporação que resultam em carga não específica de células amácrinas deslocadas na camada de células ganglionares. Com a disponibilidade de linhas de ratinhos transgénicos que expressam tdTomato ou EGFP sob o controlo de promotores que estão em populações específicas de células ganglionares 34-38, applicati futurasons desta técnica pode incluir estudos de imagem de cálcio de subtipos de células ganglionares da retina específicas.

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Disclosures

Os autores não têm divulgações.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. S. Stella e Helen Vuong para contribuições para o protocolo de imagem de cálcio. Agradecemos Sheets Dr. K. para filmar as cenas de entrevista. Agradecemos ao Dr. Arlene Hirano por seus comentários sobre o manuscrito. Este projeto de pesquisa e desenvolvimento foi realizado pelos autores na Geffen de Medicina David na UCLA e é possível graças a um acordo de contrato que foi concedido e administrado pela Research & Material Médico Comando do Exército dos EUA (USAMRMC) ea Telemedicina e Tecnologia Avançada Centro de Pesquisa (TATRC), em Fort Detrick, Maryland sob Número do Contrato: W81XWH-10-2-0077. O suporte para esses estudos também vieram NIH EY04067 e uma revisão Mérito VA (NB). BCN é uma VA Carreira de Investigação Scientist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina
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Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

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