Abstract
Roman Entdeckung neuer Biomarker spielt eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von empfindlicher und spezifischer Nachweis von Krankheiten. Leider sind viele Niedrigfluss Biomarkern, die in biologischen Flüssigkeiten vorliegen können nicht leicht mit Massenspektrometrie oder Immunassays, weil sie in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind, sind labil und werden häufig durch Hochfluss Proteine wie Albumin oder Immunglobulin maskiert detektiert werden. Köder, die Poly (N-isopropylacrylamid) (NIPAm) auf Basis Nanopartikel sind in der Lage, diese physiologischen Barrieren zu überwinden. In einem Schritt sind sie in der Lage, zu erfassen, zu konzentrieren und zu bewahren Biomarkern aus Körperflüssigkeiten. Niedermolekularen Analyten geben Sie den Kern der Nanopartikel und werden von verschiedenen organischen chemischen Farbstoffen, die als hohe Affinität Protein Köder handeln gefangen genommen. Die Nanopartikel können die interessierenden Proteine von mehreren Größenordnungen zu konzentrieren. Dieser Konzentrationsfaktor ausreicht, um den Proteingehalt zu erhöhen, so daß die Proteine in derNachweisgrenze von Strom-Massenspektrometer, Western Blot und Immuntests. Nanopartikel können mit einer Vielzahl von biologischen Flüssigkeiten inkubiert werden und sie in der Lage, die Konzentration der Proteine und Peptide Gewicht niedermolekulare stark anreichern, während ohne Albumin und andere Proteine Gewichtshochmolekularen sind. Unsere Daten zeigen, dass eine 10000-fachen Verstärkung der Konzentration eines bestimmten Analyten erreicht werden kann, wodurch Massenspektrometrie und Immunoassays, zuvor nicht nachweisbar Biomarker zu detektieren.
Introduction
Trotz der Beendigung der Sequenzierung des menschlichen Genoms, hat bedeutende Fortschritte bei der Identifizierung von Biomarkern nicht prädiktiv frühen Stadium der Erkrankung durchgeführt wurden oder dass mit therapeutischen Ergebnis, Prognose oder 1 korrelieren. Ein Grund für diesen Mangel an Fortschritt ist, dass viele potenziell signifikante Biomarker in einer Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze der konventionellen Massenspektrometrie und andere Biomarker Discovery-Plattformen existieren. Massenspektrometrie (MS) und Multiple Reaction Monitoring (MRM) eine Erfassungsempfindlichkeit in der Regel mehr als 50 ng / ml, während die Mehrheit der Analyten von Immunoassays in klinischen Labors fallen in den Bereich gemessen zwischen 50 pg / ml und 10 ng / ml . Dies bedeutet, dass viele Biomarker, insbesondere im frühen Stadium einer Krankheit nicht durch konventionelle MS MRM und 2 erkannt werden. Neben der Anwesenheit von Hochfluss-Proteine, wie Albumin und Immunglobulin in komplexen biologischen Flüssigkeiten Maske oft Milliarden fache excess Nieder Fülle, geringes Gewicht Proteine und Peptide Molekular 3, 4. Aus diesem Grund mehrere Probenvorbereitungsschritte sind erforderlich, vor der Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung. Eine solche vorbereitenden Schritt setzt die Erschöpfung der Hochfluss-Proteine mit handelsüblichen Erschöpfung Spalten 5-8. Leider ist dieser Schritt führt zur Verringerung der Ausbeute von Biomarker-Kandidaten, weil sie oft nicht-kovalent mit Trägerproteinen, die entfernt werden verbunden. Eine weitere Herausforderung wird durch die Stabilität der Biomarker-Kandidaten Ex-vivo dargestellt, sobald die Proben werden gesammelt. Proteine unterliegen einem Abbau durch endogene oder exogene Proteasen 9. Hydrogel-Nanopartikel können diese kritischen Herausforderungen durch Verstärkung des mutmaßlichen Biomarker-Konzentration auf ein Niveau im Bereich des Assays zu überwinden, während der Schutz für das Protein vor dem Abbau 10-13.
Es ist wichtig zu beachten, thbei LMW-Proteinen im Blut sind ein Gemisch von kleinen intakte Proteine als auch Fragmente von großen Proteinen. Gewebe-abgeleitete Proteine größer als 60 kDa sind zu groß, um den Blutstrom durch das Gefäß Basalmembran passiv geben, aber sie können im Blut als Peptide oder Proteinfragmente 14 dargestellt werden. Unser Ziel ist es, neue Umlauf Biomarker, die Kandidaten für die Früherkennung von Krankheiten, zur Stratifizierung von Patienten für die Therapie und Überwachung des Ansprechens auf die Therapie sein kann, zu messen. Unsere Nanopartikel sind geschaffen, um selektiv auszuschließen hoher Häufigkeit Immunglobuline und Albumin, wobei gleichzeitig die Erfassung kleiner Proteine und Peptide und konzentriert sie bis zu 100-fach in Abhängigkeit von dem Ausgangsvolumen.
Unsere Gruppe identifiziert eine Reihe von kleinen organischen Farbstoffe, die als hohe Affinität molekularen Köder erfolgreich agieren kann für Proteine und Peptide. Protein-Farbstoff-Bindungs wird angenommen, dass durch eine Kombination von hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungs. Die aromatischen Ringe auf dem Farbstoff zu verschachteln mit Proteinen über hydrophobe Taschen auf der Proteinoberfläche 11.
Die Köder, abhängig von ihrer Chemie, zeigen eine besondere Affinität für ausgewählte Klassen von Analyten. Die Köder konkurrieren mit den Trägerproteinen, wie Albumin, die für die Proteine oder Peptide. Die niedermolekularen Proteine / Peptide werden im Partikel gefangen. Hochmolekulare Proteine wie Albumin und Immunglobulin Eindringen von Teilchen durch die Sieb-Fähigkeit aufgrund der restriktiven Poren des Hydrogels 11 (Figur 1) verhindert.
Hydrogel-Nanopartikel werden durch Fällung Polymerisation durch Ammoniumpersulfat 11 eingeleitet synthetisiert. N-Isopropylacrylamid (NIPAm) sind Comonomere Acrylsäure (AAc) und Allylamin (AA) und Vernetzer N, N'-Methylenbisacrylamid (BIS) bei 70 ° C für 6 Stunden in verdünnter Lösung 1 reagieren1, 13. Die hohe Proteinbindungsaffinität von Poly (N-isopropylacrylamid-co-Acrylsäure) (Poly (NIPAm-co-AAc) nanoparticlesis durch kovalente Einbau aminogruppenhaltige Farbstoffe (dh., Sulfonatedanthraquinonetriazine Farbstoffe) in die Nanopartikel durch erreicht eine Amidierungsreaktion in wässrigen oder organischen Lösungsmitteln in Abhängigkeit von den hydrophilen / hydrophoben Eigenschaften der Farbstoffe durchgeführt 11, 13. nucleophile Substitution der Amingruppen in dem Nanopartikel mit dem Chloratom eines anthraquinonetriazine Farbstoff wird verwendet, um farbstoffhaltige Poly (NIPAm erstellen -CO-allylamin) (AA) Nanopartikel 11, 12. Ein zweistufiges Polymerisationsverfahren wird verwendet, um Hydrogel-Nanopartikel eine äußere Hülle aus Vinylsulfonsäure (VSA) 11, 13 enthält, zu schaffen.
Hydrogel-Nanopartikel können auf verschiedenen biologischen Flüssigkeiten, wie Vollblut, Plasma, Serum, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß und Urin verwendet werden. In einem Schritt, in Lösung, die nanoparticles führen Sie eine schnelle (innerhalb von Minuten) Beschlagnahme und Konzentration der niedermolekularen Analyten 10, 11, 13, 15-18. Proteine werden anschließend von den Nanopartikeln eluiert und detektiert unter Verwendung von Western-Blotting 19-21, Massenspektrometrie 10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, Immunoassays / ELISA 10, 11, 15, 18, oder Umkehrphasen-Protein-Microarray 16, 24 Assays. Nanopartikel mit chemischen Köder funktionalisiert, und präsentiert eine Kern oder Kern-Schale-Architektur, erfassen und konzentrieren Proteine auf der Grundlage der Köder / Schale physikalisch-chemischen Eigenschaften. Verschiedene Farbstoffe in die Nanopartikel eingebracht werden daher erfassen unterschiedliche Untergruppen von Proteinen mit unterschiedlicher Effizienz bezogen auf die Farbstoffaffinität, pH-Wert der Lösung und die Anwesenheit / Abwesenheit von konkurrierenden hochkonzentrierten Proteine 13. Darüber hinaus wird die Menge der Nanopartikel in Bezug auf das Volumen der Lösung, die Proteinausbeute aus den Nanopartikeln beeinflussen. Diese Aspekte derHydrogel-Nanopartikel Ernte werden mit drei verschiedenen Nanopartikel Köder zum Ernten von Proteinen aus Plasma-Proben, die große Mengen an Protein enthalten, nachgewiesen und von Urinproben, die in der Regel große Mengen an Protein enthalten. In diesem Protokoll Ernte und konzentriert Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF) aus Plasmaproben unter Verwendung von Poly (NIPAm-co-AAC), Poly (NIPAm / Farbstoff) und Kern-Schale-Nanopartikel zeigen wir (Poly (NIPAm-co-VSA)) . Poly (NIPAm / Farbstoff) Nanopartikel gezeigt, Mycobacterium-Spezies-Antigen, das für die menschliche Urinproben hinzugefügt wurde, zu konzentrieren, um Mycobacterium tuberculosis infizierte Personen zu imitieren.
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Protocol
Humanplasma und Urin wurde von gesunden freiwilligen Spendern gesammelt, mit schriftlicher Einwilligung, nach der George Mason University Institutional Review Board genehmigt Protokolle. Spender wurden zu gleichen Teilen Männer und Frauen kaukasischen im Alter zwischen 25 und 42 Proben wurden einzeln analysiert zwischen verteilten und wurden nicht vereinigt.
1. Nanopartikel Verarbeitung von Serum-oder Plasma-Proben
Potential niedrigen reichlich Biomarker im Plasma erfasst, in Lösung, mit Hydrogel-Nanopartikel. Die Teilchen dem Plasma inkubiert, durch Zentrifugation abgetrennt, gewaschen wird und die gefangenen Proteine eluiert werden. Die eluierten Proteine werden unter Stickstoffstrom für Downstream-Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung getrocknet.
- 500 ul verdünnte Serum 1: 2 mit 50 mM Tris-HCl, pH 7 (500 ul Serum + 500 ul Tris-HCl) in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 500 ul von Poly (NIPAm / AAC) Kern NanOpArtikel. Inkubieren für 15 min bei RT.
- Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Gib 500 ul Natriumthiocyanat (25 mM) zu dem Pellet. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals.
- Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals.
- Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 700 ul Acetonitril bis 300 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss prep seinaRoten unmittelbar vor der Verwendung. Bewahren Sie die Elutionspuffer.
- Werden 300 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT.
- Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und speichern Sie das Eluat in einem sauberen, beschriftet Mikrozentrifugenröhrchen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,9 bis 1,10. Kombinieren Sie die beiden Eluate in einem Reaktionsgefäß.
- Trocknen Sie die Eluate unter Stickstoffstrom in einem Stickstoffverdampfer Verteiler an 42,1 ° C, mit einem Luftstrom bis 8 (2F) eingestellt.
- Das getrocknete Eluat bei RT O / N Lagerung oder bei -20 ° C für die Langzeitspeicherung, vor Massenspektrometrie, Western Blot oder ELISA-Tests (optional).
2. Nanopartikel Verarbeitung von Urinproben
Normaler Urin enthält weniger als 30 mg / dl Protein undweniger als 1 + Blut. Doch viele Krankheiten / Bedingungen können die normalen Niveaus der Urin-Protein und Blut verändern. Um bei der Bestimmung der optimalen Volumen von Nanopartikeln auf die Urinprobe hinzu zu erleichtern, wird eine Urinanalyse vor Nanopartikel Ernte durchgeführt wird. Urin Biomarker in extrem niedrigen Konzentrationen, was erfordern kann, die Optimierung des Verhältnisses von Nanopartikeln Urinvolumen vorhanden ist. Dieses Verfahren beschreibt, Nanopartikel-Ernte von Urinproben für nachfolgende Western-Blot-Analyse.
- Sammeln Urinproben in einem sauberen, trockenen Plastikbecher. Ein 22 ml Minimalvolumen ist erforderlich. Shop Urinproben bei -80 ° C bis bereit zu analysieren.
- Auftauen den gefrorenen Urin bei RT oder bei 4 ° CO / N. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Gießen von mindestens 22 ml Urin in einem 50 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden.
- Drehen Sie das Urin in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor bei 3.700 g für 15 min. Man dekantiert die Urin, ohne das Pellet zu stören, in eine saubere 50 ml konischen Boden polypropylene Röhre. Entsorgen Sie die Pellets.
- Urinanalyse durchgeführt mit Hilfe eines Multi-Analyt "Urinstäbchen" Reagensstreifen. Hinweis: Die Teststreifen zu speichern in einem dicht geschlossenen Behälter vor direkter Sonneneinstrahlung und Feuchtigkeit 17, 18.
- Legen Sie den Reagensstreifen, face-up, auf einem sauberen, trockenen Papiertuch.
- Verwenden Sie einen Einweg-Pipetten zu 1 ml Urin in Schritt 2.3 vorbereitet anzusaugen.
- Stellen Sie einen Timer für 2 min aber starten Sie nicht. Schnell verzichtet werden 1 - 2 Tropfen Urin auf jedem Testkissen des Reagenzstreifens. Der Timer sofort zu starten. Hinweis: Das Reagenz Streifen direkt in der Urinbehälter Tauchen Sie. Die Farbstoff / chemischen Indikatoren im Reagenz Streifen kann möglicherweise aus dem Reagensstreifen auslaugen in den Urinbehälter.
- Zu dem Zeitpunkt, zu dem Reagenzstreifen Behälter angegeben, erfassen die qualitativen Ergebnisse der verschiedenen Analyten auf dem Reagenzstreifen durch Vergleich der Farbe der einzelnen Reagenzstreifen zur entsprechenden farbcodierten indicatoren auf der Reagenzienbehälter. Typische normale Urin Ergebnisse sind: (normal oder negativ) für Blut, Eiweiß, Leukozyten, Nitrit, Glucose, Keton, Bilirubin, Urobilinogen und; Urin-pH (5,5-7,0); spezifisches Gewicht (1,001 bis 1,020). Hinweis: Hohe Proteinspiegel in einer Urinprobe mit dem Protein von Interesse für die Bindungsstellen auf den Nanopartikeln zu konkurrieren. Um Protein Ernte mit Nanopartikeln zu maximieren, kann der Nanopartikel Volumen / Volumen-Verhältnis Urin zu beiden Grenz Konkurrenz von Hochfluss-Proteine reguliert werden, oder optimiert werden, um Proteine, die in sehr geringen Konzentrationen vorhanden ernten werden. Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen 2x Volumen von Nanopartikeln in Schritt 2.5 unten. Wenn der Analyt von Interesse ein sehr geringer häufigste Protein, kann es notwendig sein, das Volumen der Nanopartikel bis zu 2 ml (Figur 3) zu erhöhen.
- 20 ml des geklärten Urin aus Schritt 2.3 in ein sauberes 50-ml-Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden. Unterlassen Siestören jeglichen Schmutz / Pellet, das in dem Boden des Urinröhre sein kann. Geben Sie 200 ul von Nanopartikeln auf die 20 ml Urinprobe. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Hinweis: Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen Sie 400 ul von Nanopartikeln auf 20 ml Urin.
- Inkubieren der Urin / Nanopartikelmischung für 30 min bei RT ohne Schaukel / Mischen.
- Drehen Sie das Urin / Nanopartikel-Suspension in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet bei 3.700 g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet ist nicht sichtbar Nach der Zentrifugation spinnen die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets.
- Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Übertragen Sie die Nanopartikel-Lösung für ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß.
- Dreh die Nanopartikel in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor bei 16.100 × g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet nicht sichtbar ist folgenden Zentrifugation, drehen Sie die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.11 (zweimal) mit 200 ul 18 MilliQ-Wasser, um die Nanopartikel zu waschen.
- Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 970 ul Acetonitril bis 30 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden. Bewahren Sie die Elutionspuffer.
- Mit 20 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT.
- Dreh die Nanopartikel-Proben bei 16.100 g für 10 min. Entfernen und den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. Stören Sie nicht die Nanopartikel-Pellets. Entsorgen Sie die Pellets in der Biohazard Papierkorb.
- Legen Sie die Proben in einem Rack in einem Laborabzug. Öffnen Sie die Kappen und incUbate bei RT für 30 min. Alternativ legen Sie die Proben unter Stickstoffstrom bei 40 ° C bis trocken (1 - 2 h).
- Werden 15 ul Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer (2 x) zu den Proben. Hitze bei 100 ° C in einer trockenen Wärmeblock für 5 min mit den Kappen offenen oder bis das Volumen in dem Rohr bleibt, ist nicht mehr als 20 ul. Hinweis: Verwenden Sie kein kochendes Wasserbad. Die Feuchtigkeit aus dem Wasserbad wird die Verdampfung des Puffers zu verhindern.
- Legen Sie den Deckel auf den Rohren. Die Rohre aus dem Wärmeblock entfernen. Die Probe kann bei -80 ° C gelagert oder sofort für Downstream Western-Blot-Analyse verwendet werden.
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Representative Results
Hydrogel Nanopartikelgröße und Gleichmäßigkeit
Poly (NIPAm-AAC) Teilchen mit extrem hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb der Serie gefertigt. Die Teilchen haben eine sehr gute kolloidale Stabilität bei RT während der Zeit für die Erfassung, Speicherung, und die Elution von Proteinen (mindestens 48 Stunden) erforderlich ist und Nanopartikel Fällung wurde nicht beobachtet (Abbildung 1) 11. Die kolloidale Stabilität kann für die schnelle Protein / Peptidaufnahme durch die Nanopartikel sehr wichtig sein.
Low-Potential Fülle Biomarker aus Plasma Geerntet
Der Einbau des Farbstoffs Köder treibt die Aufnahme von Molekülen in Lösung und stellt sicher, dass erfasst Moleküle vor dem Abbau 13, 15, 18, 25 erhalten. Aus diesem Grund sind Proteaseinhibitoren, die nicht während der Proben Vorverarbeitung benötigt. Dieses Attribut der Nanopartikel macht sie suitable als Konservierungstechnologie für die Probenentnahme auf dem Feld und für den Versand von biologischen Flüssigkeiten bei RT.
Die Köder-Molekül in der Hydrogelpartikel durch Copolymerisation oder kovalente Bindung an die Nanopartikel vorhandenen funktionellen Gruppen eingearbeitet werden. Zum Beispiel wurden Poly (NIPAm-co-AAc) Nanopartikel mit Aminogruppen enthaltenden Farbstoffen über die Länge Null Vernetzungs Amidierungsreaktionen ausgebildet, während Nanopartikel mit einer äußeren Schale, die Vinylsulfonsäure (VSA) Copolymers wurden in einer zweiten Polymerisationsreaktion 10-13 erstellt. Verschiedenen Arten von Nanopartikeln, indem eine unterschiedliche chemische Farbstoff innerhalb der Nanopartikel und erhöhen so die Ernte von bestimmten Klassen von Proteinen hergestellt werden. Ein wichtiges Konzept der Technik ist, dass verschiedene Köder eine bevorzugte Affinität für verschiedene Proteine zeigen, weil der Farbstoff-Protein-Wechselwirkung hängt hauptsächlich von einer Kombination von hydrophoben Wechselwirkungen, 3-D-Wechselwirkungengen und elektrostatische Kräfte. Wir haben beobachtet, dass einige Analyten kann mit hoher Affinität von chemisch unterschiedlichen Farbstoffen aufgrund der Komplexität der Bindungskräfte erfasst werden. Siehe Tamburro et al. Für eine umfassende Erklärung und Beispiele für dieses Prinzip 13. Zum Beispiel wurden vier verschiedene Arten von Aufnahme Köder (Nanopartikel) verwendet werden, um TNF aus Plasma unter Verwendung von 200 ul und 200 ul Teilchen Plasma für jeden Typ von Nanopartikeln zu ernten. In allen Fällen nach der Behandlung mit den Nanopartikeln war TNF nicht im Überstand durch SDS-PAGE mit Silberfärbung nachweisbar, wohingegen TNF war in der Nanopartikel-Eluat (1C) nachweisbar. (Spur 1 = rekombinantes TNF (MW 17000 Da), Spuren 2 & 3, 4 und 5, 6 und 7 sowie 8 und 9 stellen die Ergebnisse für vier unterschiedliche Typen von Nanopartikel-Köder bzw. c = Kontrolle, S = Überstand, P = Nanopartikel Eluat).
Dosis-Antwort für verschieMiete Typen von N anoparticles
Um eine Eichkurve zu erhalten und Präzision durchzuführen und somit zu beurteilen, müssen Experimente mit Stachel-Proteinen mit bekannter Konzentration durchgeführt werden. Veröffentlichte Ergebnisse für eine Vielzahl von Körperflüssigkeiten und Analyten zeigen, wie die Nanopartikel Vorverarbeitung hält Linearität des Assays und stellt eine Eichkurve, während die Verbesserung der effektiven Erfassungsgrenze 10, 16, 26. Wir haben ebenfalls Studien veröffentlicht zwischen Labor-Präzisions mit Hilfe der Nanopartikel, um Multi-Reaktionsüberwachung Massenspektrometrie mit erhöhter Empfindlichkeit 27 durchzuführen.
IL-17-Effizienz bei der Ernte von verschiedenen Arten von Nanopartikeln zu vergleichen, wurde rekombinantes IL-17 (17,5 kDa) an Plasmaproben, bei denen entweder Poly (NIPAm-co-AAc) oder Poly (NIPAm-co-VSA)-Nanopartikel wurden anschließend zugegeben . Zwei Sätze von vier seriellen Verdünnungen von 100 ng rekombinantem IL-17 wurden in 100 hergestellt81; l Plasma (100 ng / 100 ul, 50 ng / 100 ul, 25 ng / 100 ul und 12,5 ng / 100 ul). 1 (v / v) Partikel: Plasma-Verhältnis von Poly (NIPAm-co-AAc) oder Poly (NIPAm-co-VSA)-Teilchen wurden zu den jeweiligen Plasmaproben in einem 1 zugegeben. Eine spektrophotometrische Gesamtprotein-Assay wurde auf dem Überstandsproben durchgeführt. Western-Blotting mit Anti-Kaninchen polyklonalen IL-17 wurde auf 20 ug Plasmaüberstand (S) nach der Ernte und der Nanopartikel Nanopartikel Eluate (P) (Figur 4) durchgeführt. Beide Nanopartikeltypen angemessen geerntet und eingeengt IL-17 bei jeder Verdünnung. Die zusätzlichen Banden auf dem Western-Blot stellen humanes Serumalbumin und Immunglobulin, das mit dem sekundären Antikörper kreuzreagiert. (AAC-Partikel: Die Bahnen 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, Spuren 3 & 4 = 0,50 ng / ul, Spuren 5 und 6 = 0,25 ng / ul, Spuren 7 & 8 = 0,125 ng / ul, Lane 9 = IL-17; VSA-Partikel: Die Bahnen 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, Spuren 3 & 4 = 0,50 ng / ul,Spuren 5 & 6 = 0,25 ng / ul, Spuren 7 & 8 = 0,125 ng / ul).
Erkennung potenziell Diagnose Proteine im Urin
Menschlichen Urinproben von gesunden freiwilligen Spendern mit schriftlicher Einwilligung erhalten wurden, wurden mit einem rekombinanten Mycobacterium-Spezies-Antigen frühen sekretorischen Ziel Mycobacterium Tuberculosis Protein (ESAT-6), um Mycobacterium tuberculosis infizierte Personen zu imitieren versetzt. 1 ug jedes der ESAT-6 (15 kDa) und IL-2 (15,5 kDa) wurden in 1 ml Aliquots von menschlichem Urin von gesunden freiwilligen Spendern gesammelt zugegeben. Urinanalyse wurde auf die Proben mit einer Urin Reagenzstreifens durchgeführt, um das optimale Verhältnis von Nanopartikeln, um Urin, der auf die Anwesenheit / Abwesenheit von Urinproteinen wurde festzulegen. Poly (NIPAm / Farbstoff) Nanopartikel wurden verwendet, um Proteine aus behandelten und unbehandelten Urinproben geerntet. Eindimensionale Gelelektrophorese der Nanopartikel Eluate wurde f geführtdurch Silberfärbung ollowed. Proben U4 und U6 Fahrspuren repräsentieren Nanopartikel Eluate aus ESAT-6 und IL-2 behandelten Urinproben, die deutlich prominente Banden bei 15 kDa (5). Massenspektrometrie der identifizierten ESAT-6 (UniProt Beitritt POA567, 84,0 Deckung, 9 Peptide) und IL-2 (UniProt Beitritt P60568, 38.56 Abdeckung, 3 Peptide) Eluate. Urin ohne Nanopartikel-Ernte in der Spur mit "Raw" angezeigt.
Abbildung 1. Nanopartikel Ernte und konzentrieren geringer Menge Proteine aus komplexen biologischen Flüssigkeiten. (A) Workflow für Sammelproteine. Gesamtbearbeitungszeit beträgt ca. 1,5 Stunden. Proteinen in Lösung aus Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiß, Speichel oder anderen Körperflüssigkeiten (1000-fache Konzentration dargestellt) eingeengt. (B)Charge zu Charge Vergleich zeigt die einheitliche Größe von Nanopartikeln. Atomic Force Microscopy von Glimmer zeigt Gleichförmigkeit der Größe (Durchmesser 0,7 um) und in Abwesenheit von Verklumpung in zwei Chargen von Nanopartikeln. (C) 1-D-Gelelektrophorese und anschließender Silberfärbung von Tumornekrosefaktor alpha (TNF) aus dem Plasma abgesondert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Nanopartikel Ernteverfahren von Plasma / Serum für Downstream-Massenspektrometrie-Analyse. (A) Nanopartikel verbleiben im Lösung (Poly (NIPAm / Farbstoff) gezeigt). Sind (B) Nanopartikel zu der verdünnten Plasmaprobe hinzugefügt. (C) Die Nanopartikel-Suspension Plasma iS in einer Zentrifuge, um die Nanopartikel vom Überstand trennen gesponnen. (D) Beitrag Zentrifugation, die Nanopartikel bilden einen ausgeprägten Pellet in dem Boden der Röhre. (E) Nach dem Waschen der Nanopartikel wird das Eluat der geernteten Proteine enthalten, entfernt und aufbewahrt . für Downstream-Analyse (F) Das Eluat wird unter Stickstoffstrom in einem Verdampfer bei 42,1 ° C, Luftstrom 8, für 1 getrocknet -. 2 Stunden vor der Massenspektrometrie Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Urinanalyse mit Multi-Analyt-Teststreifen für die Probenqualitätskontrolle. (A) Jedes Pad auf dem Reagenzstreifen mit Chemikalien, Enzyme und / oder Indikator-Farbstoffe, die mit einem unterschiedlich reagieren imprägniertent Urin Analyt (zB., Glukose, Bilirubin, Ketone, spezifisches Gewicht, Blut, pH, Protein, Urobilinogen, Nitrit und / oder Leukozyten-Esterase). Urin wird durch Zentrifugieren geklärt. Ein Tropfen Urin wird zu jedem Pad auf der Reagensstreifen aufgenommen. (B) Die Farbe jedes Pad wird optisch an die Farbblöcke auf dem Behälter verglichen, zu der angegebenen Zeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4. Ernte IL-17 aus dem Plasma mit Kern (AAC) oder Core-Shell-(VSA) Nanopartikel. 1-D-Gelelektrophorese und Western Blotting mit anti-IL-17 zeigt die Fähigkeit von Acrylsäure (AAc) und VSA Kern-Schale-Nanopartikel, um verschiedene conce erntenntrations von IL-17 aus dem Plasma. (S = Überstand nach der Ernte Nanopartikel, P = Nanopartikel Eluat AAc Partikel. Bahnen 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, Spuren 3 & 4 = 0,50 ng / ul, Spuren 5 & 6 = 0.25ng / ul, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul, Lane 9 = IL-17; VSA-Partikel: Die Bahnen 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, Spuren 3 & 4 = 0,50 ng / ul, Spuren 5 und 6 = 0,25 ng / ul, Spuren 7 & 8 = 0,125 ng / ul) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Wiederherstellung des Mycobacterium tuberculosis-Antigen und Zytokin IL-2 aus Urin mittels Hydrogel-Nanopartikel. Silberfärbung folgenden 1-D-gel-Elektrophorese von Urinproben. Proben in den Bahnen U4 und U6 darstellen Eluate aus Urinproben, die rekombinantes ESAT-6 und IL-2, die deutlich prominente Banden bei 15 kDa. Massenspektrometrie der identifizierten ESAT-6 (UniProt Beitritt POA567, 84,0 Deckung, 9 Peptide) und IL-2 (UniProt Beitritt P60568, 38.56 Abdeckung, 3 Peptide) Eluate. (RAW = Urin ohne Nanopartikel-Ernte, U1, U2, U3, U5, U7, U8 = Urin fehlt rekombinanten ESAT-6 und IL-2-Nanopartikel folgenden Ernte). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Protein Namen | GI Protein Nummer | Konzentration im Serum / Plasma [ng / ml] | Referenz |
| abl-Interaktors 1-Isoform ein | 61743942 | Unbekannt | |
| AMP-aktivierten Protein-Kinase-Isoform gamma2-Untereinheit ein | 33186925 | Unbekannt | |
| Cas-Br-M (Maus) ecotrope retroviralen Transformationssequenz | 52426745 | Unbekannt | |
| Chemokin (CC motif) Ligand 18 (Lungen-und Aktivierungs-geregelt) | 4506831 | 30 | 34 |
| Chemokin (CC motif) Ligand 5 | 22538814 | 1,5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Unbekannt | |
| Chromosom 16 offene Leserahmen 80 | 8392875 | Unbekannt | |
| Consortin | 213021160 | Unbekannt | |
| Defensin, Alpha 4, corticostatin | 4503303 | Unbekannt | |
| 20149675 | Unbekannt | ||
| Glykoprotein Ib (Plättchen), beta Polypeptid | 4504073 | Unbekannt | |
| Guanin-Nukleotid-bindendes Protein (G-Protein), q Polypeptid | 40254462 | Unbekannt | |
| Heparanase | 148746204 | Unbekannt | |
| Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 2 (Somatomedin A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| Lacritin | 15187164 | Unbekannt | |
| Leukozyten-Zellen abgeleiteten Chemo 2 | 59806345 | 200.000 | 33 |
| Lipocalin 2 (Onkogen 24p3) | 38455402 | 0,05 | 28 |
| Monoglyceridlipase, Isoform CRA_b | 6005786 | Unbekannt | |
| N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor Attachment-Protein, alphein | 47933379 | Unbekannt | |
| einem Schnitt Homöobox 2 | 119220564 | Unbekannt | |
| Außen dichte Faser Schwänze der Spermien 4 | 171184433 | Unbekannt | |
| Gaumen, Lungen-und Nasen Epithel verbunden | 18765705 | Unbekannt | |
| Peptidoglycan Erkennungsprotein 2 | 156616294 | Unbekannt | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| Protein CASC3 | 15721939 | Unbekannt | |
| RAB27B, Mitglied ras-Onkogen-Familie | 5729997 | Unbekannt | |
| Ras Association (RalGDS / AF-6)-Domäne Familie 6-Isoform ein | 29789443 | Unbekannt | |
| ras-verwandten GTP-bindenden Protein RAB10 | 33695095 Unbekannt | ||
| Ringfinger-Protein 166 | 30520320 | Unbekannt | |
| Serumentzug Antwort (Phosphatidylserin-bindendes Protein) | 4759082 | Unbekannt | |
| solute carrier family 33 (Acetyl-CoA-Transporter), member 1 | 4757708 | Unbekannt | |
| ST6 Beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1-Isoform ein | 27765091 | 15 | 32 |
| Thymosin-like 3 | 34013530 | Unbekannt | |
| Transducin-Enhancer wie von Split 3 (E (SP135) Homolog, Drosophila) | 157384982 | Unbekannt | |
| Transglutaminase 1 | 4507475 | Unbekannt | |
| WD repeat Domäne 1 | 9257257 | Unbekannt | |
| WD repeat domain 91 | 222080092 | px; "> Unbekannt||
| Xin aktinbindenden wiederholen, die 2 | 119372317 | Unbekannt |
Tabelle 1. Beispiel geringer Menge Proteine, die von Nanopartikeln aus Serum / Plasma geerntet. (PeptideAtlas Peptidoms Massenspektrometrie) 28-34 mit permissionfrom Referenz 13 (Tamburro, D. et al Angepasst Multifunktions Kern-Schale-Nanopartikel.:.. Entdeckung der zuvor unsichtbare Biomarker J Am Soc Chem, 133, 19178-19188, (2011 .)) Copyright 2011 American Chemical Society.
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Discussion
Klinische Relevanz
Eine Serum oder Plasmaprobe wird angenommen, niedrig-abundanten zirkulierenden Proteinen und Peptiden, die eine reiche Quelle von Informationen über den Zustand des Organismus als Ganzes bereitstellen können, enthalten. Trotz der Versprechen der Serum Proteomik, gibt es drei grundlegende und schwerwiegende physiologische Barrieren Vereitelung Entdeckung von Biomarkern und die Übersetzung in die klinische Nutzen 10, 11, 16, 25.
1. Wichtige diagnostische Biomarker können in extrem Fülle (Konzentration) im Blut vorhanden sind. Frühzeitig erkranktem Gewebe, wie vor-metastatischen Krebsläsionen, kann weniger als einige wenige mm 3 bilden. Biomarker aus so einem kleinen Gewebevolumen in den Kreislauf vergossen wird hoch in die gesamte Blutvolumen verdünnt zu werden. Relevante Analyten können unter der Nachweisgrenze der Massenspektrometrie und konventionellen Immunoassays existieren.
2. Niedrige Fülle Biomarker /Proteine werden durch das Vorhandensein von hochkonzentrierten Proteinen, wie Albumin und Immunglobulin, die bis zu 90% der Plasma Proteom 14 stellen maskiert.
3. Proteine und Peptide sind anfällig für den Abbau durch endogene und exogene Proteasen nach der Blutentnahme und Probentransport / Aufbewahrung. Proteinabbau kann zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen 35.
Hydrogel-Nanopartikel wurden als poröse, lebhaft, Polymere mit anthraquinonetriazine Farbstoffe und / oder Vinylsulfonsäure Schalen für Protein und Peptid-Ernte und Konservierung in Körperflüssigkeiten 11, 13 entwickelt. Unsere Gruppe synthetisiert und getestet Hydrogel-Nanopartikel mit einer Fülle von organischen Farbstoffen (dh funktionalisiert. , sulfonierte und nicht-sulfonatedanthraquinonetriazine Farbstoffe) und zeigten die Vorzugs Affinitäten für mehrere Protein Analyten 11, 13. wir auch Protokolle für die Entdeckung von Biomarkern, die verwenden etabliertHydrogel-Nanopartikel mit Lymphe, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß, Urin, Plasma, Blut oder Serumproben, 11, 13, 23, 24, 26.
Optimierung der Nanopartikel Ernteparameter vor der Ernte Proteine aus wertvollen klinischen / Forschung Proben wird für optimale Ergebnisse erforderlich. Die Proteinmenge in den Proben zu quantifizieren, um das optimale Verhältnis von Nanopartikeln um das Probenvolumen zu bestimmen. Für Analyten mit unbekannter Konzentration, eine Dosis-Wirkungs-Kurve unter Verwendung von rekombinanten Proteinen enthält Informationen hinsichtlich der Nachweisgrenze. Wenn eine ausreichende Probe können verschiedene Typen von Nanopartikeln verwendet werden, um die ideale Nanopartikel für den Analyten und Probe zu bestimmen.
Urinanalyse vor Nanopartikel Ernte bietet eine Urinprobe Qualitätskontrolle. Die Affinität der Nanopartikel Farbstoff Köder hängt von dem isoelektrischen Punkt des Proteins von Interesse und der pH-Wert des umgebenden Mediums. Urin-pH seinzwischen 5,5 und 7,0 ist optimal für die Protein Ernte mit den Poly (NIPAm / Farbstoff) Nanopartikel. Die Anwesenheit von hämolytische oder intakten roten Blutzellen (1 + Blut auf dem Reagensstreifen) nicht mit der Ernte Nanopartikel stören.
In diesem Protokoll konzentrierten wir uns auf die Anwendung der Hydrogel-Nanopartikel, um Proteine aus Plasma und Urin geerntet. Zukünftige Anwendungen könnten auch andere Körperflüssigkeiten wie Glaskörper des Auges oder der Gelenkflüssigkeit umfassen. Potential in vivo-Anwendungen für die Zukunft in dem Nanopartikel in erkranktem Gewebe injiziert wird, um Biomoleküle zu sammeln denkbar. Zukünftige Arbeiten werden auch auf die Entwicklung von neuen Geräten für die Erfassung und Erhaltung von Biomarkern, wie eine Nanopartikel-basierte Haut Patch für die Analyse der Haut Transsudat Proteom fokussiert werden.
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Acknowledgments
Michael Henry, Dublin City University, freundlich mit der Datenerhebung und Analyse in Abbildung 5 dargestellt unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von (1) George Mason University, (2) die italienische IstitutoSuperiore di Sanita ', die im Rahmen des Italien / USA Kooperationsvereinbarung zwischen dem US Department of Health and Human Services, George Mason University, und dem italienischen Gesundheitsministerium, (3) NIH, IMAT Programm Zuschüsse 1R21CA137706-01 und 1R33CA173359-01 LAL, und (4) Ceres Nanowissenschaften, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
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