Abstract
גילוי סמן ביולוגי חדשני משחק תפקיד משמעותי במאמץ לספק גילוי מחלה יותר רגיש וספציפי. למרבה הצער רב סמנים ביולוגיים נמוך שפע שקיימים בנוזלים ביולוגיים לא ניתן לאתר בקלות עם ספקטרומטריית או immunoassays כי הם נמצאים בריכוז נמוך מאוד, הם יציבים, ולעתים קרובות הם רעולי פנים על ידי חלבונים גבוה שפע כגון אלבומין או אימונוגלובולינים המוניים. פיתיון המכיל פולי (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) חלקיקים מבוססים מסוגלים להתגבר על מחסומים פיסיולוגיים אלה. בצעד אחד שהם מסוגלים ללכוד, להתרכז ולשמור על סמנים ביולוגיים מנוזלי גוף. analytes משקל מולקולרי הנמוך להיכנס לליבה של החלקיק ונתפס על ידי צבעים שונים אורגניים כימיים, המשמשים כפיתיונות חלבון זיקה גבוהה. חלקיקים הם מסוגלים להתרכז החלבונים של ריבית על ידי צווים שונים של גודל. גורם ריכוז זה מספיק כדי להעלות את רמת החלבון באופן שהחלבונים הם בתוךגבול גילוי של ספקטרומטרים הנוכחיים המוניים, מערבי סופג, וimmunoassays. ניתן מודגרות חלקיקים עם שפע של נוזלים ביולוגיים והם יכולים להעשיר מאוד את הריכוז של חלבוני משקל מולקולריים נמוכים ופפטידים ואילו בניכוי אלבומין וחלבונים במשקל מולקולרי גבוהים אחרים. הנתונים שלנו מראים כי הגברה של פי 10,000 בריכוז של אנליטי מסוים ניתן להשיג, מה שמאפשר ספקטרומטריית המסה וimmunoassays כדי לזהות סמנים ביולוגיים לגילוי בעבר.
Introduction
למרות השלמת רצף הגנום האנושי, התקדמות משמעותית לא נעשתה בסמנים ביולוגיים לזיהוי ניבוי של מחלה בשלב מוקדם, או שמתאם עם תוצאה טיפולית, או הפרוגנוזה 1. אחת סיבות לחוסר ההתקדמות היא שרבים סמנים ביולוגיים שעלולים להיות משמעותיים קיימות בריכוז מתחת לגבול הגילוי של ספקטרומטריית מסה המוסכמת ופלטפורמות גילוי סמן ביולוגי אחרות. ספקטרומטריית מסה (MS) וניטור תגובה מרובה (MRM) יש רגישות זיהוי בדרך כלל גדול יותר מ50 ng / ml בעוד רוב analytes שנמדד על ידי immunoassays במעבדה נפילה קלינית בטווח שבין 50 pg / ml ו10 ng / ml . משמעות דבר היא כי סמנים ביולוגיים רבים, במיוחד בשלב המוקדם של מחלה יכולים לא להיות מזוהים על ידי MS הקונבנציונלי וMRM 2. בנוסף הנוכחות של חלבונים גבוה שפע כגון אלבומין ואימונוגלובולינים בנוזלים ביולוגיים מורכבים לעתים קרובות להסוות על ידי EXC מיליארדים פינמוך שפע ESS, חלבוני משקל מולקולריים נמוכים ופפטידים 3, 4. מסיבה זו מספר צעדי הכנה מדגם נדרשים לפני רצף ספקטרומטריית מסה והזדהות. צעד הכנה אחד כזה מעסיק הדלדול של חלבונים גבוה שפע עם עמודות דלדול זמינות מסחרי 5-8. לרוע המזל שלב זה מוביל להפחתה של התשואה של סמנים ביולוגיים מועמד בגלל שהם קשורים לעתים קרובות שאינם קוולנטית עם חלבונים נשאים שהוסרו. אתגר נוסף הוא מיוצג על ידי היציבות של סמנים ביולוגיים מועמד לשעבר vivo פעם אחת הדגימות שנאספו. חלבונים הם נושא לשפלה על ידי פרוטאזות אנדוגני או אקסוגני 9. חלקיקי הידרוג'ל יכולים להתעלות מעל אתגרים קריטיים אלה על ידי הגברת ריכוז הסמן הביולוגי המשוערת לרמה בטווח של assay, תוך הגנה על החלבון מן השפלה 10-13.
חשוב לציין הבLMW חלבונים בדם הם תערובת של חלבונים ללא פגע קטנים, כמו גם שברים של חלבונים גדולים. חלבונים המופקים מרקמות גדולות יותר מ60 kDa הם גדולים מדי כדי להיכנס לזרם הדם באופן פסיבי דרך הקרום במרתף של כלי דם, אבל הם יכולים להיות מיוצגים בדם כפפטידים או שברי חלבון 14. המטרה שלנו היא למדוד סמנים ביולוגיים חדשניים במחזור שיכול להיות מועמדים לגילוי מוקדם של מחלה, ריבוד מטופל לטיפול, ומעקב אחר התגובה לטיפול. חלקיקים שלנו נוצרו כדי לשלול באופן סלקטיבי נוגדנים גבוה שפע ואלבומין, בעת לכידתו זמנית חלבונים ופפטידים קטנים יותר ומתרכזים אותם ל100 פי תלוי בהתחלת הנפח.
הקבוצה שלנו זיהתה שורה של צבעים אורגניים קטנים אשר יכול לפעול בהצלחה פיתיונות מולקולריים גבוהה כזיקה לחלבונים ופפטידים. הוא חשב חלבון צבען מחייב להיות בגלל שילוב של אינטראקציה הידרופובי ואלקטרוסטטיים. הטבעות ריחניות בצבע Interleave עם חלבונים באמצעות כיסים הידרופובי על פני השטח חלבון 11.
הפיתיונות, תלוי בכימיה שלהם, להראות זיקה מסוימת לשיעורים נבחרים של analytes. הפיתיונות להתחרות עם החלבונים מובילים, כגון אלבומין, לחלבונים או פפטידים. חלבונים / פפטידים המשקל מולקולריים נמוכים נלכדו בחלקיקים. חלבוני משקל מולקולריים גבוהים כגון אלבומין ואימונוגלובולינים מנוע מלהיכנס לחלקיק בגלל יכולת הסנון בשל נקבובית המגבילה של הידרוג'ל 11 (איור 1).
חלקיקי הידרוג'ל מסונתזים על ידי פילמור ממטרים ביוזמת persulfate אמוניום 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm), שיתוף מונומרים של חומצה אקרילית (AAC) וallylamine (AA) וצולב מקשר N, N'-Methylenebisacrylamide (BIS) מותר להגיב ב70 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות בתנאים לדלל 11, 13. הזיקה גבוהה מחייבת חלבון של פולי (N-isopropylacrylamide-שיתוף אקריליק חומצה) (פולי (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis מושגת על ידי קוולנטית שילוב צבעים המכיל אמינו (כלומר., צבעי sulfonatedanthraquinonetriazine) לחלקיקים דרך תגובת amidation בוצעה בממסים מימיים או אורגניים בהתאם למאפיינים הידרופילי / הידרופובי של הצבעים 11, 13 חילוף. Nucleophilic של הקבוצות האמינים בחלקיק עם אטום כלוריד של צבע anthraquinonetriazine מנוצל ליצירת פולי המכילים צבע (NIPAm -co-Allylamine) (AA) חלקיקים 11, 12. תהליך פילמור שני שלבים הוא מנוצל כדי ליצור חלקיקי הידרוג'ל המכילים מעטפת חיצונית של חומצת vinylsulfonic (VSA) 11, 13.
יכולים להיות מיושמים חלקיקי הידרוג'ל לנוזלים ביולוגיים שונים, ובכלל זה כל דם, פלזמה, סרום, נוזל השדרתי, זיעה, ושתן. בצעד אחד, בפתרון, nanoparticles לבצע מהיר (תוך דקות) תפיסה וריכוז של משקל מולקולרי נמוך analytes 10, 11, 13, 15-18. חלבונים eluted לאחר מכן מהחלקיקים וזוהו באמצעות מערביים סופג 19-21, ספקטרומטריית 10, 11, 13, 15, 18, 22 המוני, 23, immunoassays / 10 ELISA, 11, 15, 18, או microarray חלבון שלב הפוך 16, 24 מבחני. חלקיקים פונקציונליות עם פיתיון כימי, והצגת ארכיטקטורת פגז ליבה או ליבה, לכידה ולהתרכז חלבונים המבוססים על מאפייני physicochemical פיתיון / פגז. צבעים שונים שולבו בחלקיקים ולכן יהיו ללכוד תת שונה של חלבונים עם משתנה יעילות המבוססת על זיקת הצבע, pH של התמיסה, ונוכחות / היעדרות של מתחרות חלבונים גבוהים בשפע 13. יתר על כן, כמות חלקיקים ביחס להיקף הפתרון תשפיע על תשואת החלבון מהחלקיקים. היבטים אלה שלקציר nanoparticle הידרוג'ל הם הפגינו באמצעות שלושה פיתיונות nanoparticle שונים לחלבוני קצירה מדגימות פלזמה שמכילות כמויות גדולות של חלבון, ומדגימות שתן שבדרך כלל לא מכילות כמויות גדולות של חלבון. בפרוטוקול זה אנו מדגימים קצירה וריכוז אלפא גורם נמק גידול (TNFα) מדגימות פלזמה באמצעות פולי (NIPAm-CO-AAC), midi (NIPAm / צבע), וחלקיקי קליפת core- (פולי (NIPAm-CO-VSA)) . חלקיקי midi (NIPAm / צבע) מוצגים להתרכז אנטיגן מיני Mycobacterium שנוסף לדגימות שתן אנושיות, לחקות אנשים נגועים שחפת Mycobacterium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פלזמה ובשתן אנושיים נאספו מתורמים מתנדבים בריאים, עם כתב הסכמה מדעת, הבאים באוניברסיטת ג'ורג מייסון מוסדי המועצה לביקורת שאושרה פרוטוקולים. תורמים חולקו שווים בשווים בין זכרים ונקבות קווקזי בין גילאי 25 ו42. דוגמאות נותחו בנפרד ולא אספו.
.1 Nanoparticle עיבוד דגימות סרום או פלזמה
סמנים ביולוגיים בשפע פוטנציאל נמוך בפלזמה נלכדים, בפתרון, עם חלקיקי הידרוג'ל. החלקיקים מתווספים לפלזמה, מודגרות, מופרדת על ידי צנטריפוגה, שטף, והחלבונים שנתפסו הם eluted. חלבוני eluted מיובשים תחת זרימת חנקן עבור סידור במורד הזרם המוני ספקטרומטריית והזדהות.
- לדלל 500 μl של סרום 1: 2 עם 50 מ"מ TrisHCl pH 7 (500 סרום μl + 500 μl TrisHCl) בצינור microcentrifuge.
- הוסף 500 μL (NIPAm / AAC) nanop ליבה של פולימאמרים. דגירה של 15 דקות ב RT.
- ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה מצוידת בהרוטור קבוע זווית. להסיר ולסלק supernatant.
- הוסף 500 thiocyanate μl נתרן (25 מ"מ) לגלולה. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.
- ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. להסיר ולסלק supernatant.
- הוסף 500 μl מים MilliQ לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.
- ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. להסיר ולסלק supernatant.
- הכן חיץ elution טרי: הוסף 700 μl אצטוניטריל 300 אמוניום הידרוקסיד μl בצינור נקי. זהירות: הידרוקסיד אמוניום הוא מאכל. השתמש עם אוורור מתאים. הערה: חיץ elution חייב להיות הכנהared מייד לפני השימוש. אל תאחסן את חיץ elution.
- הוסף 300 μl של חיץ elution לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה של 15 דקות ב RT.
- ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. הסר ולשמור את eluate בצינור נקי, שכותרתו microcentrifuge.
- חזור על שלבים 1.9-1.10. לשלב את שני eluates לתוך צינור microcentrifuge אחד.
- ייבש את eluates תחת זרימת חנקן בסעפת מאייד חנקן ב42.1 ° C, עם זרימת אוויר מוגדרת 8 (איור 2F).
- אחסן את eluate המיובש ב RT לO / אחסון N, או ב -20 מעלות צלזיוס עבור אחסון לטווח ארוך, לפני ספקטרומטריית מסה, מערבי סופג, או מבחני ELISA (אופציונליים).
.2 עיבוד Nanoparticle של דגימות שתן
שתן נורמלי מכיל פחות מ 30 מ"ג / ד"ל חלבון ופחות מ 1 + דם. עם זאת, מחלות רבות / תנאים עשויות לשנות את הרמות נורמליות של חלבון בשתן ודם של. כדי לסייע בקביעת הנפח האופטימלי של חלקיקים כדי להוסיף לדגימת השתן, בדיקת שתן מבוצעת לפני קציר חלקיק. סמנים ביולוגיים שתן עשויים להתקיים בריכוזים נמוכים מאוד, שעשויה לדרוש אופטימיזציה של היחס של חלקיקים לנפח שתן. הליך זה מתאר את קצירת חלקיק של דגימות שתן לניתוח כתם מערבי במורד הזרם.
- לאסוף דגימות שתן בכוס פלסטיק נקייה, יבשה. היקף מינימאלי 22 מ"ל נדרש. שתן חנות דגימות ב -80 ° C עד מוכן לנתח.
- להפשיר את השתן הקפוא ב RT או על 4 מעלות CO / N. מערבבים בקצרה על מיקסר מערבולת. יוצקים לפחות 22 מ"ל של שתן לתוך צינור פוליפרופילן תחתון 50 מ"ל חרוטי.
- ספין השתן בצנטריפוגה עם הרוטור את הנדנדה ב3,700 XG במשך 15 דקות. למזוג השתן, מבלי להפריע גלולה, לpolypr תחתון 50 מ"ל חרוטי נקיצינור opylene. זורק את הכדור.
- לבצע בדיקת שתן באמצעות רצועה רב אנליטי "מדיד שתן" מגיב. הערה: לאחסן את הרצועות מגיב במכל סגור היטב הרחק מאור שמש ולחות 17, 18 ישירים.
- הנח את הרצועה מגיב, עם הפנים כלפי מעלה, על מגבת נייר נקיה ויבשה.
- השתמש בפיפטה חד פעמית כדי לשאוב 1 מ"ל של השתן מוכן בשלב 2.3.
- להגדיר טיימר למשך 2 דקות, אבל לא להפעיל אותו. מהירות לוותר 1 - 2 טיפות של שתן על כל משטח בדיקה של הרצועה מגיב. מייד להתחיל את הטיימר. הערה: אל להטביע את הרצועה מגיב ישירות במכל השתן. מחווני צבע / הכימיים ברצועה מגיב עלולים לדלוף החוצה של הרצועה מגיב לתוך מיכל השתן.
- בזמן מצויינים על גבי מיכל הרצועה מגיב, רשום את התוצאות איכותיות עבור analytes השונים ברצועה מגיב על ידי השוואת הצבע של הרצועות מגיב פרט לאינדיקה בצבעים המקבילהtors על המכל מגיב. תוצאות שתן נורמליות אופייניות הן: (רגילות או שליליות) לדם, חלבון, לויקוציטים, ניטריט, גלוקוז, קטון, בילירובין, וurobilinogen; pH שתן (5.5-7.0); משקל סגולי (1.001-1.020). הערה: רמות חלבון גבוה בדגימת שתן עשויות להתחרות עם החלבון של עניין לאתרי קישור על חלקיקים. על מנת למקסם את קצירת חלבון עם חלקיקים, חלקיק הנפח / יחס נפח השתן יכול להיות מותאם לכל אחד תחרות גבול מחלבונים שפע גבוהים, או יכול להיות מותאם למסוק חלבונים שקיימים בריכוזים נמוכים מאוד. אם ערך חלבון בשתן הוא 1+ או גדול יותר, להוסיף כרכי 2x של חלקיקים בשלב 2.5 להלן. אם אנליטי של עניין הוא חלבון נפוץ מאוד נמוך, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את ההיקף של חלקיקים עד 2 מ"ל (איור 3).
- העברה 20 מ"ל של השתן הבהיר מצעד 2.3 לתוך צינור פוליפרופילן נקי 50 מ"ל תחתון חרוטי. האם לאלהפריע כל פסולת / גלולה שיכולה להיות בחלק התחתון של צינור השתן. הוסף 200 μl של חלקיקים לדגימת שתן 20 מ"ל. מערבבים בקצרה על מיקסר מערבולת. הערה: אם ערך חלבון בשתן הוא 1+ או גדול יותר, להוסיף 400 μl של חלקיקים ל20 מ"ל שתן.
- דגירה את תערובת שתן / חלקיק ל30 דקות ב RT, ללא נדנדה / ערבוב.
- ספין ההשעיה שתן / חלקיק בצנטריפוגה מצוידת ברוטור את נדנדה ב3,700 XG עבור 10 דקות. הערה: אם גלולה היא לא צנטריפוגה הבאה נראית לעין, לסובב את הדגימות ל2 נוספות - 7 דקות.
- להסיר ולסלק supernatant. מוסיף המים 500 μl MilliQ לגלולת החלקיק.
- Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. מעבירים את פתרון nanoparticle לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל נקי.
- ספין חלקיקים בצנטריפוגה מצוידת בהרוטור קבוע זווית ב16,100 XG 10 דקות. הערה: אם גלולה היא לא מספק מתה גלויגעיית צנטריפוגה, לסובב את הדגימות ל2 נוספות - 7 דקות.
- להסיר ולסלק supernatant.
- חזור על שלבים 2.8 ו2.11 (פעמיים) עם 200 μl 18 MilliQ מים כדי לשטוף את חלקיקים.
- הכן חיץ elution טרי: הוסף 970 μl אצטוניטריל ל30 אמוניום הידרוקסיד μl בצינור נקי. זהירות: הידרוקסיד אמוניום הוא מאכל. השתמש עם אוורור מתאים. הערה: חיץ elution חייב להיות מוכן מייד לפני השימוש. אל תאחסן את חיץ elution.
- הוסף חוצץ elution 20 μl לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה של 15 דקות ב RT.
- ספין דגימות החלקיק ב16,100 XG 10 דקות. הסר ולשמור את supernatant ב, צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל נקי. אל תפריע לגלולת החלקיק. זורק את הכדור בפסולת הביולוגית.
- מניחים את הדגימות במעמד במנדף הכימי. פתח את הכובעים, וincubate ב RT למשך 30 דקות. לחלופין, למקם את הדגימות תחת זרימת חנקן ב40 מעלות צלזיוס עד יבשה (1 - שעה 2).
- הוסף 15 μl חיץ טריס-גליצין SDS מדגם (2x) לדגימות. חום ב100 מעלות צלזיוס בגוש חום יבש ל5 דקות עם הכובעים פתוחים או עד שהנפח שנותר בצינור היא לא יותר מ 20 μl. שים לב: אין להשתמש באמבט מים רותח. לחות מאמבט המים תהיה למנוע אידוי של החיץ.
- מניחים את הכובע על הצינורות. הסר את הצינורות מהגוש החום. המדגם יכול להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס או בשימוש באופן מיידי לניתוח כתם מערבי במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גודל הידרוג'ל Nanoparticle ואחידות
חלקיקי midi (NIPAm-AAC) שהופקו בתשואה גבוהה במיוחד ושחזור בין ובתוך קבוצות. יש לי החלקיקים יציבות colloidal טוב מאוד ב RT בזמן הנדרש עבור לכידה, אחסון, וelution של חלבונים (לפחות 48 hr), וממטרי חלקיק לא נצפו (איור 1) 11. יציבות colloidal עשויה להיות חשובה מאוד לספיגת חלבון / פפטיד מהיר על ידי חלקיקים.
סמנים נמוך-שפע פוטנציאלי שנקטפו מפלזמה
השילוב של פיתיון הצבע מניע את הספיגה של מולקולות בתמיסה ומבטיח כי מולקולות שנתפסו נשמרות משפלה 13, 15, 18, 25. מסיבה זו, מעכבי פרוטאז אין צורך במדגם עיבוד מראש. תכונה זו של חלקיקים גורמת להם זהuitable כטכנולוגיה שימור לאיסוף דגימה בתחום ועבור משלוח של נוזלים ביולוגיים ב RT.
מולקולת הפיתיון יכולה להיות משולבת בחלקיקי הידרוג'ל ידי copolymerization או קוולנטיים מחייב קבוצות פונקציונליות קיימים בחלקיק. כדוגמא, חלקיקי פולי (NIPAm-CO-AAC) נבנו עם צבעי אמינו המכיל באמצעות תגובות amidation crosslinking אורך אפס, בעוד שחלקיקים עם מעטפת חיצונית המכילה חומצת קופולימר vinylsulfonic (VSA) נוצרו על ידי תגובת פילמור שנייה 10-13. סוגים שונים של חלקיקים יכולים להיות מיוצרים על ידי שילוב צבע כימי שונה בתוך החלקיק ובכך לשפר את קצירה של כיתות מסוימות של חלבונים. מושג חשוב של הטכנולוגיה שלנו הוא שפיתיונות שונים יכול להראות זיקה מועדפת לחלבונים שונים, כי האינטראקציה צבע החלבון תלויה בעיקר בשילוב של אינטראקציות הידרופוביות, interac 3-Dמשא, וכוחות אלקטרוסטטיים. ראינו כי ניתן ללכוד כמה analytes עם זיקה גבוהה על ידי צבעים שונים כימי בגלל המורכבות של הכוחות המחייבים. ראה Tamburro et al. להסבר ודוגמאות נרחבים של 13 עיקרון זה. לדוגמא, ארבעה סוגים שונים של פיתיון ללכידה (חלקיקים) שמשו לקציר TNFα מפלזמה באמצעות 200 μl של חלקיקים והפלזמה μl 200 לכל סוג של חלקיק. בכל המקרים לאחר טיפול בחלקיקים, TNFα לא היה להבחין בsupernatant על ידי SDS-PAGE עם צביעת כסף, ואילו TNFα היה להבחין בeluate החלקיק (איור 1 ג). (הנתיב 1 = TNFα רקומביננטי (MW 17,000 דא), Lanes 2 ו -3, 4 ו -5, 6 ו -7 ו -8 ו -9 מייצג תוצאות עבור ארבעה סוגים שונים של פיתיונות nanoparticle בהתאמה; C = שליטה, S = supernatant, P = חלקיק eluate).
מנת תגובה לdiffeסוגי השכרה של anoparticles N
על מנת לבצע את עקומת כיול, ובכך להעריך את התשואה ודיוק, ניסויים צריכים להתבצע עם חלבונים ממוסמר-בריכוז ידוע. תוצאות שפורסמו עבור מגוון רחב של נוזלי גוף וanalytes להדגים כיצד העיבוד מראש החלקיק שומר על ליניאריות של assay וקובע עקומת כיול תוך שיפור המגבלה האפקטיבית של גילוי 10, 16, 26. יש לנו גם פרסמו מחקרים של דיוק בין המעבדה באמצעות חלקיקים כדי לנהל רבת תגובת ניטור ספקטרומטריית מסה עם רגישות משופרת 27.
כדי להשוות IL-17 יעילות קציר על ידי סוגים שונים של חלקיק, IL-17 רקומביננטי (17.5 KDA) התווסף לדגימות פלזמה לאשר גם פולי (NIPAm-CO-AAC) או פולי חלקיקים (NIPAm-CO-VSA) נוספו לאחר מכן . שני סטים של ארבעה דילולים סדרתי של IL-17 רקומביננטי 100 ng נערכו 10081; הפלזמה l (100 ng / 100 μl, 50 ng / 100 μl, 25 ng / 100 μl ו12.5 ng / 100 μl). חלקיקי פולי (NIPAm-CO-AAC) או פולי (NIPAm-CO-VSA) נוספו לדגימות הפלזמה המתאימות ב1: (V / V) חלקיק 1: יחס פלזמה. סך הכל assay חלבון spectrophotometric בוצע על דגימות supernatant. מערבי סופג עם polyclonal נגד הארנב IL-17 בוצע ביום 20 מיקרוגרם של supernatant הפלזמה (S) לאחר קצירת חלקיק והחלקיק eluates (P) (איור 4). שני סוגי nanoparticle כראוי נקטפו ומרוכזים IL-17 בכל דילול. להקות נוספות על הכתם המערבי מייצגות אלבומין האנושי בסרום ואימונוגלובולינים שחוצים להגיב עם הנוגדנים משני. (חלקיקי AAC: Lanes 1 & 2 = 1 ng / μl IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / μl, Lanes 5 & 6 = 0.25 ng / μl, Lanes 7 & 8 = 0.125 ng / μl, 9 ליין = IL-17; חלקיקי VSA: Lanes ng 1 & 2 = 1 / μl IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / μl,נתיבים 5 & 6 = 0.25 ng / μl, Lanes 7 & 8 = 0.125 ng / μl).
זיהוי של חלבונים שעלולים להיות לאבחון בשתן
דגימות שתן אנושיות, המתקבלות מתורמים מתנדבים בריאים עם כתב הסכמה מדעת, היו מתובלות במיני Mycobacterium רקומביננטי אנטיגן חלבון מוקדם הפרשת יעד Mycobacterium שחפת (ESAT-6) לחקות אנשים נגועים שחפת Mycobacterium. 1 מיקרוגרם כל אחת מESAT-6 (15 KDA) וIL-2 (15.5 KDA) נוספו ל1 מ"ל aliquots של שתן אנושי שנאספו מתורמים מתנדבים בריאים. בדיקת שתן בוצעה על הדגימות עם פס מגיב שתן כדי לקבוע את היחס האופטימלי של חלקיקים לשתן, שהיה מבוסס על הנוכחות / ההיעדרות של חלבונים בשתן. חלקיקי midi (NIPAm / צבע) שמשו לקציר חלבונים מדגימות שתן שטופלו ולא טופלו. ג'ל אלקטרופורזה חד ממדית של eluates nanoparticle בוצעה followed על ידי צביעת כסף. דוגמאות בנתיבי U4 וU6 מייצגות eluates חלקיק מESAT-6 וIL-2 דגימות שתן שטופלו, מראה בבירור להקות בולטות ב15 kDa (איור 5). ספקטרומטריית מסה של eluates זיהה ESAT-6 (POA567 UniProt הצטרפות, 84.0 כיסוי, 9 פפטידים) וIL-2 (P60568 UniProt הצטרפות, 38.56 כיסוי, 3 פפטידים). שתן ללא קצירת nanoparticle מוצג בנתיב שכותרתו "גלם".
קציר איור 1 חלקיקים ולהתרכז חלבוני שפע נמוכים מנוזלים ביולוגיים מורכבים. () זרימת עבודה עבור חלבוני קצירה. זמן עיבוד כולל הוא כ 1.5 שעות. חלבונים בתמיסה מרוכזים מהדם, סרום, פלזמה, שתן, זיעה, רוק, או נוזלי גוף אחרים (ריכוז 1,000 פי מתואר). (B)אצווה להשוואה אצווה המראה את הגודל האחיד של חלקיקים. מיקרוסקופית כוח אטומי על נציץ תערוכות אחידות של גודל (0.7 מיקרומטר קוטר) והעדר התקבצות בשתי קבוצות של חלקיקים. ג'ל אלקטרופורזה) ג (1-D, עם צביעת כסף שלאחר מכן, של גידול אלפא נימק פקטור (TNFα) מוחרם מפלזמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור הליך קציר 2 Nanoparticle מפלזמה / סרום לניתוח ספקטרומטריית מסה במורד הזרם. חלקיקים () להישאר תלויים בפתרון (פולי (NIPAm / צבע) מוצגים). חלקיקים (ארוחת בוקר) נוסף למדגם פלזמה בדילול מלא. (C) אני השעיה nanoparticle-פלזמהs הסתובב בצנטריפוגה כדי להפריד את חלקיקים מsupernatant. צנטריפוגה (ד ') ההודעה, חלקיקי צורה כדורית ברורה בחלק התחתון של הצינור. (E) לאחר שטיפת חלקיקים, eluate מכיל חלבונים שנקטפו מוסר והציל . לניתוח במורד הזרם (F) eluate הוא מיובש תחת זרימת חנקן במאייד ב42.1 ° C, זרימת אוויר 8, 1 -. שעה 2 לפני ספקטרומטריית מסה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 שתן באמצעות רצועות מגיב רב אנליטי לבקרת איכות דגימה. (א) כל משטח ברצועה מגיב הוא ספוג עם צבעי כימיקלים, אנזימים, ו / או מחוון שמגיבים עם שונהאנליטי שתן אף אוזן גרון (למשל., גלוקוז, בילירובין, קטון, משקל סגולי, דם, pH, חלבון, urobilinogen, ניטריט, ו / או esterase ליקוציט). שתן יובהר על ידי צנטריפוגה. ירידה של שתן מתווספת כל משטח ברצועה מגיב. (B) הצבע של כל משטח בהשוואה ויזואלית לגושי צבע על המכל, בזמן הקצוב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. מפלזמה באמצעות ליבה (AAC) או חלקיקי ליבת קליפה (VSA) קציר IL-17. אלקטרופורזה 1-D ג'ל והמערבי סופג עם אנטי-IL-17 מדגימה את יכולתה של חומצה אקרילית (AAC) וחלקיקי קליפת ליבת VSA למסוק conce השוניםntrations של IL-17 מפלזמה. (S = supernatant לאחר קצירת חלקיק, חלקיקי P = eluate nanoparticle AAC:. Lanes 1 & 2 = 1 ng / μl IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / μl, Lanes 5 & 6 = 0.25ng / μl, Lanes 7 & 8 = 0.125 ng / μl, ליין 9 = IL-17; חלקיקי VSA: Lanes 1 & 2 = 1 ng / μl IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / μl, Lanes 5 & 6 = 0.25 ng / μl, Lanes 7 & 8 = 0.125 ng / μl) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. שחזור של אנטיגן שחפת Mycobacterium וציטוקינים IL-2 משתן באמצעות חלקיקי הידרוג'ל. צביעת כסף הבא גרם 1-Dאלקטרופורזה אל של דגימות שתן. דוגמאות בU4 נתיבים וU6 מייצגות eluates מדגימות שתן המכילות ESAT-6 רקומביננטי וIL-2, מראים בבירור להקות בולטות ב15 kDa. ספקטרומטריית מסה של eluates זיהה ESAT-6 (POA567 UniProt הצטרפות, 84.0 כיסוי, 9 פפטידים) וIL-2 (P60568 UniProt הצטרפות, 38.56 כיסוי, 3 פפטידים). (RAW = שתן ללא קצירת חלקיק; U1, U2, U3, U5, U7, U8 = שתן חסר קצירת nanoparticle רקומביננטי ESAT-6 וIL-2 שלהלן). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שם חלבון | מספר חלבונים במערכת העיכול | ריכוז בסרום / פלזמה [ng / ml] | הפניה |
| איזופורם 1 ABL-interactor | 61743942 | לא ידוע | |
| איזופורם המקטע מופעל AMP חלבון gamma2 קינאז | 33186925 | לא ידוע | |
| CAS-Br-M (עכברי) retroviral הפיכת רצף ecotropic | 52426745 | לא ידוע | |
| chemokine (מוטיב CC) ליגנד 18 (ריאות והפעלה-מוסדרת) | 4506831 | 30 | 34 |
| chemokine (מוטיב CC) ליגנד 5 | 22538814 | 1.5 | ביום 31 ב |
| chondroadherin | 153251229 | לא ידוע | |
| כרומוזום מסגרת 16 קריאה פתוחה 80 | 8392875 | לא ידוע | |
| Consortin | 213021160 | לא ידוע | |
| defensin, אלפא 4, corticostatin | 4503303 | לא ידוע | |
| 20149675 | לא ידוע | ||
| גליקופרוטאין Ib (טסיות דם), פוליפפטיד בטא | 4504073 | לא ידוע | |
| חלבון מחייב נוקלאוטיד גואנין (G חלבון), פוליפפטיד q | 40254462 | לא ידוע | |
| Heparanase | 148746204 | לא ידוע | |
| גורם דמוי אינסולין צמיחה 2 (סומטומדין) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | לא ידוע | |
| תאי שמקורם יקוציט chemotaxin 2 | 59806345 | 200,000 | 33 |
| lipocalin 2 (24p3 אונקוגן) | 38455402 | 0.05 | 28 |
| lipase Monoglyceride, CRA_b איזופורם | 6005786 | לא ידוע | |
| N-ethylmaleimide רגיש חלבון מצורף גורם, אלפונס | 47933379 | לא ידוע | |
| homeobox חתך אחד 2 | 119220564 | לא ידוע | |
| סיבים צפופים חיצוניים של זנבות תאי זרע 4 | 171184433 | לא ידוע | |
| חיך, אפיתל ריאות ואף קשור | 18765705 | לא ידוע | |
| חלבון הכרת פפטידוגליקן 2 | 156616294 | לא ידוע | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| CASC3 חלבון | 15721939 | לא ידוע | |
| RAB27B, RAS חבר אונקוגן משפחה | 5729997 | לא ידוע | |
| עמותת ראס (RalGDS /-6 AF) משפחת תחום 6 איזופורם | 29789443 | לא ידוע | |
| הקשורים לראס RAB10 חלבון קושר GTP | 33695095 לא ידוע | ||
| חלבון קמיצה 166 | 30520320 | לא ידוע | |
| תגובת קיפוח בסרום (phosphatidylserine מחייב חלבון) | 4759082 | לא ידוע | |
| משפחה מומסת נושאת 33 (טרנספורטר אצטיל-CoA), חבר 1 | 4757708 | לא ידוע | |
| אלפא 2,6-sialyltranferase beta-galactosamide ST6 איזופורם 1 | 27765091 | 15 | 32 |
| כמו thymosin-3 | 34013530 | לא ידוע | |
| (E (הומולוג sp135), דרוזופילה) משפר כמו transducin-פיצול 3 | 157384982 | לא ידוע | |
| טרנס 1 | 4507475 | לא ידוע | |
| תחום חוזר WD 1 | 9257257 | לא ידוע | |
| תחום חוזר WD 91 | 222080092 | px; "> לא ידוע||
| שין אקטין מחייב חוזרים המכיל 2 | 119372317 | לא ידוע |
חלבוני טבלת 1 דוגמא שפע נמוך שנקטפו על ידי חלקיקים מסרום / פלזמה. (PeptideAtlas peptidome ספקטרומטריית מסה) 28-34 מעובד עם התייחסות permissionfrom 13 (Tamburro, ד et al חלקיקי ליבת פגז רב תפקודי:... גילוי של סמנים ביולוגיים בלתי נראים בעבר J Am Chem Soc, 133, 19,178-19,188, (2011 ).) כל הזכויות שמורות 2011 האגודה האמריקנית לכימיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רלוונטיות קליני
הוא חשב מדגם סרום או פלזמה להכיל נמוך שפע במחזור חלבונים ופפטידים אשר יכול לספק מקור מידע עשיר על מצבו של האורגניזם כולו. למרות ההבטחה של פרוטאומיקה סרום, יש שלושה חסמים פיסיולוגיים בסיסיים ורציניים סיכול גילוי סמן ביולוגי ותרגום לתועלת קלינית 10, 11, 16, 25.
.1 סמנים ביולוגיים לאבחון חשובים עשויים להתקיים במאוד נמוך שפע (ריכוז) בדם. רקמה בשלב מוקדם חולה, כגון נגעי סרטן טרום גרורתי, עשויה להוות פחות מכמה מ"מ 3. סמנים ביולוגיים לשפוך לתוך מחזור הדם מכזה נפח רקמה קטן יהפכו מדוללים מאוד בכל נפח הדם. analytes הרלוונטי עשוי להתקיים מתחת לתחום הגילוי של ספקטרומטריית המסה וimmunoassays הקונבנציונלי.
2 סמנים ביולוגיים שפע נמוך /חלבונים הם רעולי פנים על ידי הנוכחות של חלבונים גבוהים בשפע כגון אלבומין ואימונוגלובולינים, המייצגים עד 90% מproteome הפלזמה 14.
3 חלבונים ופפטידים רגישים לשפלה על ידי proteinases במשק ומחוץ הבאים venipuncture ומדגם תחבורה / אחסון. פירוק חלבונים יכול להוביל לתוצאות חיוביות או שקר שקר שלילי 35.
חלקיקי הידרוג'ל פותחו כנקבובי, קלילים, פולימרים המכילים צבעי anthraquinonetriazine ו / או פגזי חומצת vinylsulfonic לחלבון וקציר פפטיד ושימור בגוף נוזלי 11, 13. הקבוצה שלנו מסונתזת ונבדקה חלקיקי הידרוג'ל פונקציונליות עם שפע של צבעים אורגניים (כלומר. , פעיל מעץ ולא sulfonatedanthraquinonetriazine צבעים) והראה זיקות מועדפים לכמה חלבון analytes 11, 13. אנחנו גם הוקמו פרוטוקולים לגילוי סמן ביולוגי המשתמשיםחלקיקי הידרוג'ל עם ימפה, רוק, נוזל השדרתי, זיעה, שתן, פלזמה, דם, או בסרום דגימות 11, 13, 23, 24, 26.
אופטימיזציה של פרמטרי קצירת nanoparticle לפני חלבוני קצירה מדגימות קליניים / מחקר יקרים היא הכרחית לתוצאות אידיאליים. כמות החלבון בדגימות צריכה לכמת כדי לקבוע את היחס האופטימלי של חלקיקים לנפח דגימה. לanalytes של ריכוז לא ידוע, עקומת מנת תגובה באמצעות חלבונים רקומביננטי מספקת מידע בנוגע לגבולות של גילוי. אם יש דגימה מספקת, סוגים שונים של חלקיקים יכולים לשמש כדי לקבוע את החלקיק האידיאלי עבור אנליטי ודגימה.
בדיקת שתן לפני קציר nanoparticle מספקת דגימת שתן בדיקת בקרת איכות. הזיקה של פיתיון צבע חלקיק תלוי בנקודה של החלבון של העניין וpH של סביב המדיום isoelectric. pH השתן להיותtween 5.5 ו7.0 הוא אופטימלי לקציר חלבון עם פולי חלקיקים (NIPAm / צבע). הנוכחות של תאי דם אדומים hemolyzed או בשלמותה (1 + הדם על הרצועה מגיב) אינה מפריעה לקציר חלקיק.
בפרוטוקול זה אנו מתמקדים ביישום של חלקיקי הידרוג'ל למסוק חלבונים מפלזמה ושתן. יישומים עתידיים יכולים לכלול נוזלי גוף אחרים כגון זגוגית של העין, או נוזל הסינוביאלי. פוטנציאל ביישומי vivo ניתן חזה לעתיד שבו חלקיקים מוזרקים לרקמה חולה לאסוף מולקולות ביולוגיות. גם עבודה בעתיד תהיה ממוקדת בפיתוח של מכשירים חדשים ללכידה והשימור של סמנים ביולוגיים, כגון תיקון עור המבוסס על חלקיק לניתוח proteome טרנסודט העור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מייקל הנרי, אוניברסיטת העיר דבלין, באדיבותו סייע באיסוף הנתונים וניתוח שמוצג באיור 5. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי (1) אוניברסיטת ג'ורג מייסון, (2) האיטלקי IstitutoSuperiore di Sanita 'במסגרת איטליה / ארה"ב הסכם שיתוף פעולה בין משרד בריאות האמריקאי ולשירותי אנוש, אוניברסיטת ג'ורג מייסון, והמשרד האיטלקי לבריאות הציבור, (3) NIH, מענקי תכנית IMAT 1R21CA137706-01 ו1R33CA173359-01 לLAL, ו( 4) קרס Nanosciences, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
