Abstract
Telomerase, et ribonucleoprotein, er ansvarlig for å holde telomere lengde og derfor fremme genomisk integritet, spredning og levetid. I tillegg beskytter telomerase mitokondriene fra oksidativt stress og resistens mot apoptose, noe som tyder på en mulig betydning for den gjenlevende av ikke-mitotisk, sterkt aktive celler så som nevroner. Vi har tidligere demonstrert evnen av nye telomerase-aktivatorer for å øke telomeraseaktivitet og ekspresjon i de forskjellige musehjerneregioner og for å beskytte motoriske nevroner celler fra oksidativt stress. Disse resultatene styrker den oppfatningen at telomerase er involvert i beskyttelse av nerveceller fra ulike lesjoner. For å understreke rollen til telomerase i hjernen, har vi her sammenligne aktiviteten av telomerase i mannlige og kvinnelige musehjerne, og dens avhengighet av alder. TRAP-analysen er en standard metode for påvisning av telomerase-aktivitet i forskjellige vev eller cellelinjer. Her demonstrerer vi analysis av telomerase-aktivitet i tre regioner av musehjerne ved ikke-denaturerende protein ekstraksjon ved hjelp av CHAPS lysis buffer etterfulgt av modifikasjon av standard TRAP-testen.
I denne to-trinns analysen, elongates endogen telomerase en bestemt telomerase substrat (TS primer) ved å legge TTAGGG 6 bp repetisjoner (telomerase reaksjon). De telomerase reaksjonsprodukter blir amplifisert ved PCR reaksjon skape en DNA-stige 6 bp trinn. Analyse av DNA-stigen er laget med 4,5% høy oppløsning agarose gelelektroforese etterfulgt av farging med meget følsom nukleinsyre flekken.
Sammenlignet med tradisjonelle TRAP-assay som bruker 32 P-merket radioaktivt dCTP står for DNA gjenkjenning og polyakrylamidgel-elektroforese for å løse DNA stige, denne protokollen gir en ikke-toksisk tidsbesparelse TRAP assay for vurdering av telomerase-aktivitet i musehjerne, som viser evnen til å oppdage forskjeller i telomerase aktivitet i de ulike kvinnelige og mannlige mus hjernen regionen.
Introduction
Telomerase er et ribonucleoprotein sammensatt av telomerase revers transkriptase (TERT), den katalytiske subenhet av telomerase og en RNA komponent (TERC). Den kanoniske rolle telomerase er å bevare den riktige lengde av telomerer ved tilsetning av repetitive sekvenser (TTAGGG) til de telomeric ender, således fremme genomisk integritet, og celleproliferasjon 1. Andre roller ble tilskrevet TERT i celler, dvs. den resistens mot apoptose indusert av ulike ødeleggende middel 2, beskytter menneske mesenchymale stamceller fra oksidativt stress 3, og spiller en pro-overlevelse rolle i fullt differensierte nevroner ved sin tilknytning til TIA1 positiv RNA granulater 4.
TERT uttrykkes og aktiv hovedsakelig i somatiske delende celler og i de fleste typer kreft, mens enzymet ekspresjon og aktivitet er strengt regulert i ikke-delende celler 5,6. Studier har vist at i rodent hjernen, blir telomerase aktivitet oppdages av postnatal dag 10, mens TERT mRNA er opprettholdt på lavere nivåer i voksen alder 7. Andre studier viste telomerase aktivitet i voksen sub-ventrikkel-sonen, luktelappen, hippocampus, og i voksen lillehjernen og cortex åtte. Vi har nylig vist at nye forbindelser som øker telomerase ekspresjon og aktivitet i hjernen og ryggmargen som utøves nevrobeskyttende effekter i N-metyl-D-aspartat (NMDA) - injiseres musene, forsinket inntreden og utvikling av amyotrofisk lateral sklerose sykdom hos SOD1 transgen mus og økt overlevelse av motoriske nerveceller i ryggmargen av disse musene ni. For fullt ut å forstå pro-overlevelse rolle telomerase i nerveceller og i hjernen, er det viktig å utvikle en enkel og forholdsvis følsomme hurtig analyse for deteksjon av telomerase-aktivitet i de forskjellige regioner av hjernen.
Den telomeric rEPEAT amplifikasjonsprotokoll (TRAP) er et velkjent sensitiv analyse som kombinerer den kanoniske aktivitet av telomerase og polymerase kjedereaksjon (PCR). I denne analysen, gir telomerase TTAGGG repeterer til en telomerase substrat (TS primer) oligonukleotid, etterfulgt av PCR-amplifikasjon som genererer 6 basepar (bp) DNA-stige ved hjelp av TS revers primer -. ACX 32 P-merket dCTP s brukes til å detektere lav mengde av PCR produktene. DNA stigen er løst ved sekvense polyakrylamidgelelektroforese (PAGE). Både intensiteten av DNA-båndene, og lengden av DNA-ladder gjenspeile mengden av aktive enzymmolekyler og deres processivity henholdsvis 10..
Denne tradisjonelle assay har noen store vanskeligheter: Faren for eksponering for radioaktive stoffer, store og vanskelige å håndtere sekvense PAGE og tidsforbruk av gelen løpe og filmeksponering av det radioaktive produktet (over natten i begge tilfeller). Denne protokollen gir en mer ikke-radioaktivt agarose mini-gel basert analysen. DNA 6 bp stigen er løst ved hjelp av 4,5% høyoppløselig agarosegel og påvisning oppnås ved hjelp av svært følsomme nukleinsyre flekken. Kombinasjonen av høy oppløsning ved hjelp av agarose mini-gel og følsom nukleinsyre flekken har lett å håndtere assay, eliminerer faren for eksponering for radioaktivitet og signifikant forkorte den totale analyse varighet fra 3 dager til flere timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk ble godkjent av etisk komité for dyreforsøk i Ben-Gurion University (IL-39-08-2010).
1. Mouse Brain Protein Extraction
- Forbered tre rør på 15 ml hver inneholder 5 ml Ringer løsning og plassere rørene på is.
- Ofre musen med isoflurananestesi (OBS - bruk kjemiske hette) for 10-20 sek etterfulgt av halshugging og umiddelbar halshogging.
- Fjern hjernen fra skallen og skyll i noen sekunder med iskald Ringers løsning for å hindre skader på hjernevev.
- Ved hjelp av en kirurgisk kniv, skiller lillehjernen (CR) og hjernestammen (BS) fra frontal cortex. Deretter skille lillehjernen fra hjernestammen og kutte frontallappen (FL) fra frontal cortex; fjerne luktelappen fra frontallappen. Plasser de tre hjerneregioner i de utpekte 15 ml rør.
- Homogenisere vevet i hvert rør. Legg fresh iskald Ringers oppløsning, så hvert rør inneholder det samme volum og sentrifuger i 7 min ved 800 x g i.
- Fjern supernatanten og tilsett 100 ul av CHAPS lysis buffer til hvert rør. Bland godt ved å føre løsningen flere ganger (~ 10) gjennom en 1 ml sprøyte med en 21 G nål, og inkuber på is i 30 min.
- Overfør innholdet i hvert rør til en ny mikro-sentrifugerør og sentrifuger i 30 min ved 13 000 x g. Overfør supernatanten til et nytt mikro-sentrifugerør og bestemme proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et tidligere etablert metode. Oppbevar proteinekstrakter i aliquoter på 10 ul ved -80 ° C..
2. TRAP Assay Utarbeidelse av instrumenter, stabilisator Solutions og proteiner Fortynningskrav Beregninger
- Forbered passende antall merkede mikro-sentrifugerør for proteinekstrakt fortynninger og telomerase reaksjon buffer. Utføre alle pipettering i protokollen ved hjelp av filter tips for å hindre forurensning. Tin opp følgende løsninger på is: TRAP reaksjon mix 10x, TS primer, dNTP, UPW og proteinekstrakter (se tabell av materialer for reagenser og reagenser konsentrasjoner).
- Fortynn løsningen av proteinekstrakt til en endelig konsentrasjon på 1 pg / pl ved hjelp av ultrarent vann (UPW).
3. Telomerase Reaction
- Forbered telomerase reaksjonsblandingen ved å legge følgende til en mikro-sentrifugerør: 2 ul TRAP mix (10x), 1 pl TS primer (0,1 mikrogram), en mikroliter dNTPs (10 mm) og 15 mikroliter UPW. For flere prøver, multiplisere nevnte volumer med antall prøver, pluss en.
- Legg 19 pl av reaksjons-blandingen til hvert reaksjonsrør og tilsett 1 pl av den fortynnede proteinekstrakt (1 ug protein) til hvert rør til et endelig volum på 20 pl.
- Plasser reaksjonsrørene i et 30 ° C forvarmet vannbad i 45 min.
4. PCR-reaksjon
- Femten min før slutten av telomerase reaksjon, tine følgende løsninger: ACX primer, Titanium Taq Buffer, UPW.
- Forbered PCR-reaksjonsblanding ved å tilsette følgende til en mikro-sentrifugerør: 2,5 mL Titanium Taq-buffer (10x), 1 pl ACX primer (0,1 mikrogram), 2 pl UPW (1 pl når IC benyttes) og 0,5 pl Taq-polymerase Titanium (50x). For flere prøver, multiplisere nevnte volumer med antall prøver pluss to.
- Tilsett 6 pl av PCR-blanding til hvert PCR-rør og legge til hele volumet av reaksjons telomerase (20 pl) til hvert rør til et endelig volum på 26 pl.
- Sett PCR rør til en PCR thermo cycler og kjøre følgende program:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C -. 30 sek *
- 60 ° C -. 30 sek *
- 72 ° C -. 45 sek *
- 72 ° C - 2 min.
Oppbevar PCR produktene ved -20 ° C.
* = 34 sykluser
5. Agarose Mini-gel Forberedelse, Samples Løping, og Gel Farging
- Tilsett 25 ml kjølt elektroforese buffer (TBE) og en rørestav i et beger som er 2-4 ganger volumet av bufferløsningen og langsomt strø i 1.125 g av det høy oppløsning (HR) agarose pulver mens løsningen blir raskt omrørt . Fjern oppstuss bar, dekke begeret med en plastfolie og stikk i et lite hull for ventilasjon. Varm begeret i mikrobølgeovnen på "Low" makt for 3 min og deretter bytte til "Høy" strøm og varme løsningen i korte pulser med forsiktighet for ikke å føre smitte. Legg merke til at når skummet er laget av varme blir store bobler og forsvinner etter noen få sekunder, er det klart agarose.
- Fell gelen til en horisontal mini-gel apparat, etter at gelen stivner ved romtemperatur tillate gelen å kjøle i 20 min ved 4 ° C før bruk.
- Laste hvert kjørefelt med 25 mL av TRAP prøven (20 ul FELLE PCR-produkter og 5 mL 6x gel-lasting fargestoff) og kjøre på 110 V i 3 timer i et 4 ° C kaldt rom.
- Forbered nukleinsyre flekk 3x arbeidsløsning ved å tilsette 15 mikroliter 10,000x nuklein-syre-flekken, stamoppløsning til 50 ml dobbelt destillert vann (DDW) med 0,1 M NaCl (0,29 g). Flekker på gel for 20 min med forsiktig risting.
- Bruk UV transilluminator med 302 nm bølgelengde for å vise fellen stigen DNA band.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele celle protein ekstrakter ble forberedt fra frontallappen (FL), hjernestammen (BS) og lillehjernen (CR), avledet fra tre CD-1 tispe og 3 CD-en hannmus ved alderen 1 og 3 måneder gammel for modifisert TRAP analysen og 3 CD-en hannmus i en alder av 2 måneder gamle for det radioaktive TRAP analysen. Telomerase-aktivitet ble påvist i en ug proteiner ekstrakt ved hjelp av den modifiserte TRAP-analysen og 2 ug proteiner ekstrakt for den radioaktive TRAP-testen. Påvisning av telomerase-aktivitet av det radioaktive TRAP-analysen og ved den modifiserte TRAP-analysen viser at en bedre visualisering og oppløsning av telomerase DNA-produkter er observert med den modifiserte analysen som sett av lengden og intensiteten av DNA-stige (figur 1A g 1C og 1d). En gradvis reduksjon i telomerase DNA produkter er observert når avtagende konsentrasjoner av proteinekstrakter, avledet fra glioblastom U-251 cellelinje, ble brukt suggesvi følsomheten av den modifiserte TRAP assay metode for deteksjon av telomerase-aktivitet ved lavere konsentrasjoner av proteiner ekstrakt (figur 1B).
En signifikant høyere telomerase aktivitet er sett i FL og BS regioner i forhold til CR i 3 måneder gamle kvinner og menn som avslørt av intensiteten av DNA band og lengden på DNA-produkter stigen. I tillegg er det vist at i løpet av overgangen i voksen mus telomeraseaktivitet økninger i FL og avtar i BS og CR (figur 1D). Sammenligning mellom kjønnene viser at i FL telomerase aktivitet er høyere hos kvinner i motsetning til BS og CR viser høyere telomerase aktivitet hos menn.
I vev som uttrykker lave nivåer av telomerase-aktivitet har vi funnet at påvisning av DNA-stigen ved hjelp av PCR er mer effektivt uten å bruke den interne kontroll (IC) primer, siden IC benytter TS som en forover primer og således forstyrrer DNA-ladder forsterkning. Reproduserbarheten av data oppnås ved å gjenta hvert forsøk flere ganger.
Figur 1. Telomerase aktivitet i musehjerne: Tradisjonell versus endret TRAP analysen. A) telomerase-aktivitet i tre hjerneregioner analysert ved radioaktiv TRAP assay (2 måneder gamle CD-1 hannmus, 2 ug proteiner ekstrakt). B) Følsomhet av den modifiserte TRAP-analysen er vist ved avtagende konsentrasjoner av proteiner ekstrakt avledet fra glioblastom U -251 cellelinje. C, D) telomeraseaktivitet i tre hjerneregioner av en (C) og 3 (D) måneder gamle CD-1 kvinnelige og mannlige muse. DNA-ladder starter ved den 50 bp båndet med 6 bp trinn. (NC - negativ kontroll, IC-internkontroll, BS - hjernestammen, CR - cerebellum, FL - frontallappen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse av telomerase-aktivitet i musehjerne via TRAP-analysen består av fire hovedtrinn: 1) ekstraksjon fra proteiner spesifikke regioner av hjernevev 2) TS primer forlengelse av telomerase - telomerase reaksjon 3) forsterkning av telomerase reaksjonsprodukter ved PCR 4 ) separering av PCR-produkter med høy oppløsning agarosegel.
Denne modifiserte analysen TRAP adresserer to store problemer som reiser seg fra den tradisjonelle assay: bruk av radioaktive dCTP største for sensitiv påvisning av PCR-produkter og PAGE separasjon av DNA-stige. Høyoppløselig agarosegel forenkler påvisning av telomerase reaksjonsprodukter (DNA-ladder) i forhold til den vanskelig å håndtere sekvense PAGE. I tillegg er den nukleinsyre farging et ikke-toksisk løsning med høy følsomhet er nødvendig for påvisning av små mengder av DNA.
Spesiell oppmerksomhet bør gis til følgende kritiske trinn: 1) Å holde tiden mellom fjerning av vev og homogenisering på et minimum for å bevare integriteten protein 2) CHAPS lysis buffer gjenfrysing bør unngås 3) proteinekstrakter bør holdes i aliquoter og tint en gang før bruk. Unngå refreezing av prøver.
Problemer kan oppstå i løpet av gel forberedelse skritt siden høy konsentrasjon agarosegel er utsatt for ringvirkninger og krever oppmerksomhet under stekingen. Teknikken har flere begrensninger med nødvendigheten av å kjøre en gel i et kaldt rom. I tillegg kan den lave mengden av PCR-produkter som ikke vises på en UV-bord.
Telomerase aktivitetsnivå varierer mellom ulike vev og regnes for å være lav i hjernen. Denne protokollen gir en mer sensitiv deteksjonsmetode, sammenlignet med den tradisjonelle radioaktive analyse muliggjør bedre deteksjon av telomerase-aktivitet i hjernen. Selv om ulike tidseffektive metoder er tilgjengelige (ett trinn TRAP analysesett, ved hjelp av et labeled TS primer for påvisning) disse metodene er betydelig mer kostbart. Videre, bruk av agarose eliminerer giftige fare for å bruke polyakrylamid gel.
Som åpenbart fra de representative resultater, ved bruk av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, er det mulig å demonstrere forskjeller i telomerase aktivitetsnivåer mellom de forskjellige områder av hjernen og mellom menn og kvinner. Denne metoden kan bli brukt for deteksjon av telomerase-aktivitet i andre normale vev med lav telomerase-aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
