Abstract
Telomeras, en ribonukleoprotein är ansvarig för att upprätthålla telomerlängd och därmed främja genomisk integritet, spridning och livslängd. Dessutom skyddar telomeras mitokondrierna från oxidativ stress och ger resistens mot apoptos, vilket tyder på dess möjliga betydelse för den överlevande av icke-mitotiska, högaktiva celler såsom neuroner. Vi har tidigare visat förmåga av nya telomeras aktivatorer för att öka telomerasaktivitet och uttryck i de olika mus hjärnan och skydda motoriska nervceller celler från oxidativ stress. Dessa resultat stärker uppfattningen att telomeras är involverad i att skydda nervceller från olika skador. För att understryka betydelsen av telomeras i hjärnan, här jämför vi aktiviteten av telomeras i manligt och kvinnligt mus hjärnan och dess beroende av ålder. TRAP-testet är en standardmetod för detektering av telomerasaktivitet i olika vävnader eller cellinjer. Här visar vi analysis av telomerasaktivitet i tre regioner av mus-hjärna genom icke-denaturerande protein extraktion med CHAPS lysbuffert följt av modifiering av den standard TRAP-testet.
I denna analys 2-steg, förlänger endogen telomeras en specifik telomerassubstrat (TS primer) genom att lägga TTAGGG 6 bp upprepningar (telomeras reaktion). De telomeras reaktionsprodukter förstärks av PCR-reaktion skapar en DNA-stege steg 6 bp. Analysen av DNA-stege är gjord av 4,5% hög upplösning agarosgelelektrofores följt av färgning med mycket känslig nukleinsyra fläcken.
Jämfört med traditionella TRAP-analysen som utnyttjar 32p märkt radioaktivt dCTP s för DNA-detektion och polyakrylamidgelelektrofores för att lösa DNA-stege, erbjuder detta protokoll en giftfri tidsbesparande TRAP-analys för utvärdering telomerasaktivitet i mushjärna, visar förmågan att upptäcka skillnader i telomerase-aktivitet i de olika kvinnliga och manliga mushjärna region.
Introduction
Telomeras är ett ribonukleoprotein sammansatt av telomeras-omvänt transkriptas (TERT), den katalytiska subenheten av telomeras, och en RNA-komponent (TERC). Den kanoniska roll telomeras är att bevara den rätta längden på telomererna genom att lägga repetitiva sekvenser (TTAGGG) till telomera ändarna, därför främja genomisk integritet, och celltillväxt 1. Ytterligare roller tillskrevs TERT i celler, dvs den ger resistens mot apoptos som induceras av olika skadliga medel 2, skyddar de mänskliga mesenkymala stamceller från oxidativ stress 3, och spelar en pro-överlevnad roll i fullt differentierade nervceller genom sin förening att TIA1 positiva RNA granuler 4.
TERT uttrycks och aktiv främst i somatiska delande celler och i de flesta typer av cancer, medan enzymuttrycks och aktivitetsnivå är hårt reglerad i icke-delande celler 5,6. Studier har visat att i rODENT hjärnan blir telomerasaktivitet påvisas med postnatal dag 10, medan TERT mRNA bibehålls på lägre nivåer i vuxen ålder 7. Andra studier visade telomerasaktivitet inom vuxenunderkammarzonen, luktbulben, hippocampus, och i den vuxna lillhjärnan och hjärnbarken 8. Vi visade nyligen att nya föreningar som ökar telomeras uttryck och aktivitet i hjärnan och ryggmärgen som utövas nervskyddande effekter i N-metyl-D-aspartat (NMDA) - injicerade möss, fördröjde uppkomsten och utvecklingen av amyotrofisk lateralskleros sjukdomen i SOD1 transgena möss och ökad överlevnad av motomeuroner i ryggmärgen av dessa möss 9. För att till fullo förstå den pro-överlevnad roll telomeras i nervceller och i hjärnan, är det viktigt att utveckla en enkel och relativt känslig snabb analys för detektion av telomeras-aktivitet i de olika regioner i hjärnan.
Den telomera rEPEAT förstärkning protokoll (TRAP) är ett välkänt känslig analys som kombinerar den kanoniska aktivitet av telomeras och polymeraskedjereaktion (PCR). I denna analys lägger telomeras TTAGGG upprepar att en telomerassubstrat (TS-primer) oligonukleotid, följt av PCR-amplifiering som alstrar sex baspar (bp) DNA-stege med hjälp av TS omvänd primer -. ACX 32 P-märkt dCTP: er används för att detektera låg mängd av PCR-produkter. Den DNA-stege är löst genom sekvensering polyakrylamidgelelektrofores (PAGE). Både intensiteten av DNA-banden och längden på DNA-stege återspeglar mängden aktiva enzymmolekyler och deras processivitet respektive 10.
Denna traditionella analys innehåller några större svårigheter: Faran med exponering för radioaktiva ämnen, stora och svåra att hantera sekvense PAGE och tidsförbrukning av gelen löpning och film exponering av radioaktiv produkt (över natten i båda fallen). Detta protokoll ger en förbättrad icke-radioaktiv agaros mini-gel baserad analys. Den bp stege DNA 6 är löst med hjälp av 4,5% högupplösande agarosgel och detekteringen uppnås med hjälp av mycket känsliga nukleinsyra fläcken. Kombinationen av att använda hög upplösning agaros mini-gel och känslig nukleinsyra fläcken erbjuder lätthanterlig assay, eliminerar risken för exponering för radioaktivitet och avsevärt förkorta den totala analystiden från 3 dagar till flera timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök har godkänts av etisk kommitté för djurförsök i Ben-Gurion University (IL-39-08-2010).
1. Mouse Brain Protein Extraction
- Bered 3 rör med 15 ml vardera innehållande 5 ml Ringers lösning och Placera rören på is.
- Offra musen med isoflurananestesi (VARNING - använd kemisk huva) för 10-20 sekunder följt av halsdislokation och omedelbar halshuggning.
- Ta bort hjärnan från skallen och skölj under några sekunder med iskall Ringers lösning för att förhindra skada på hjärnvävnad.
- Med hjälp av en kirurgisk kniv, separera lillhjärnan (CR) och hjärnstammen (BS) från frontala cortex. Därefter separera lillhjärnan från hjärnstammen och skär pannloben (FL) från frontala cortex; ta luktbulben från pannloben. Placera de 3 hjärnregioner i de angivna 15 ml rör.
- Homogenisera vävnad i varje rör. Lägg frESH iskall Ringers lösning så att varje rör innehåller samma volym och centrifugera under 7 minuter vid 800 x g.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 100 pl CHAPS lysbuffert till varje rör. Blanda väl, genom att lösningen flera gånger (~ 10) genom en 1 ml spruta med en 21 G nål, och inkubera på is under 30 min.
- Överför innehållet i varje rör i ett annat mikro-centrifugrör och centrifugera under 30 minuter vid 13.000 x g. Överför supernatanten till ett nytt mikro-centrifugrör och bestämma proteinkoncentrationen med hjälp av en tidigare etablerad metod. Förvara proteinextrakt i alikvoter om 10 ^ il vid -80 ° C.
2. TRAP analys Beredning av instrument, reaktionslösningar och Protein Utspädning Beräkningar
- Förbered lämpligt antal märkta mikro centrifugrör för proteinextrakt späd och telomeras reaktionsbuffert. Utför all pipettering i protokollet med hjälp av filterspetsar för att förhindra kontaminering. Tina följande lösningar på is: TRAP reaktionsblandningen 10x, TS primer, dNTP, ultrarent vatten och proteinextrakt (se tabell av material för reagenser och reagenser koncentrationer).
- Späd lösningen av proteinextraktet till en slutlig koncentration av 1 ug / ul med hjälp av ultrarent vatten (UPW).
3. Telomeras Reaktion
- Förbered telomeras reaktionsblandning genom att lägga till följande i en mikro-centrifugrör: 2 pl TRAP mix (10x), 1 l TS primer (0,1 mikrogram), en il dNTP (10 mm) och 15 pl ultrarent vatten. För flera prover, multiplicera nämnda volymer med antalet prover, plus 1.
- Lägg 19 pl av reaktionsblandning till varje reaktionsröret och tillsätt 1 pl av det utspädda proteinextrakt (1 ^ g protein) till varje rör för en slutlig volym av 20 | il.
- Placera reaktionsrören i ett 30 ° C förvärmt vattenbad under 45 min.
4. PCR-reaktion
- Femton min före slutet av telomeras reaktionen, tina följande lösningar: ACX primer, Titanium Taq Buffer, ultrarent vatten.
- Bered PCR-reaktionsblandningen genom att lägga till följande i en mikro-centrifugrör: 2,5 l Titanium Taq Buffer (10x), 1 pl ACX primer (0,1 mikrogram), 2 pl UPW (1 pl när IC används) och 0,5 pl Titanium Taq-polymeras (50x). För flera prover, multiplicera nämnda volymer med antalet prover plus 2.
- Lägg 6 | il av PCR-blandning till varje PCR-rör och tillsätt den hela volymen av telomeras-reaktionen (20 ^ il) till varje rör för en slutlig volym av 26 | il.
- Sätt i PCR-rör till en PCR termocykeln och kör följande program:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C -. 30 sek *
- 60 ° C -. 30 sek *
- 72 ° C -. 45 sek *
- 72 ° C - 2 min.
Förvara PCR-produkter vid -20 ° C.
* = 34 cykler
5. Agarose Mini-gel Beredning, Prov Löpning och Gel färgning
- Lägg 25 ml kyld elektroforesbuffert (TBE) och en omrörarstång till en bägare som är 2-4 gånger volymen av buffertlösningen och långsamt strö i 1,125 g av den i hög upplösning (HR) agaros pulver medan lösningen omrördes snabbt . Ta av omrörare, täck över bägaren med ett plastfolie och stick i ett litet hål för ventilation. Värm bägaren i mikron på "Low" effekt i 3 min och sedan växla till "Hög" effekt och värma lösningen i korta pulser med att inte orsaka att spilla. Observera att när skummet skapas genom upphettning blir stora bubblor och försvinner efter några sekunder, är redo agarosen.
- Kasta gelén till en horisontell mini-gelapparat, efter gelén stelnar vid rumstemperatur tillåta gelén att kyla under 20 minuter vid 4 ° C före användning.
- Fyll varje bana med 25 l av TRAP prov (20 pl TRAP PCR-produkter och 5 ^ 6x gel-laddningsfärg) och kördes vid 110 V under 3 h i en 4 ° C kallt rum.
- Förbered nukleinsyra fläck 3x arbetslösning genom att tillsätta 15 | il 10.000x nuklein-syra fläck, stamlösning till 50 ml dubbeldestillerat vatten (DDW) med 0,1 M NaCl (0,29 g). Färga gelén under 20 min med försiktig skakning.
- Använd UV-transilluminator med 302 nm våglängd för att se TRAP stege DNA-band.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hela cellproteinextrakt bereddes från frontalloben (FL), hjärnstammen (BS) och cerebellum (CR), som härrör från tre CD-1 hona och tre CD-1 hanmöss vid åldrarna 1 och 3 månader gammal för modifierad TRAP-analys och 3 CD-1 hanmöss vid en ålder av 2 månader gamla för den radioaktiva TRAP-analysen. Telomeras-aktivitet detekterades i 1 | ig protein extraktet genom den modifierade TRAP-testet och 2 ug proteiner extrahera för den radioaktiva TRAP-testet. Upptäckt av telomeras-aktivitet genom den radioaktiva TRAP-analysen och med den modifierade TRAP-analysen visar att en bättre visualisering och upplösning av telomeras DNA-produkterna observeras med den modifierade analysen sett av längden och intensiteten i DNA-stege (Figur 1A vs 1C och 1D). En gradvis minskning av telomeras DNA-produkterna observeras när sjunkande koncentrationer av proteinextrakt, som härrör från glioblastom U-251 cellinje användes Suggesting känsligheten hos den modifierade TRAP analysmetod för påvisande av telomerasaktivitet vid lägre koncentrationer av proteiner extrakt (Figur 1B).
En signifikant högre telomerasaktivitet ses i FL och BS regioner jämfört med CR i 3 månader gamla honor och hanar vilket framgår av intensiteten av DNA-banden och längden på DNA-produkter stege. Dessutom visas det att under mus övergång till vuxenlivet telomerasaktivitet ökningar av FL och minskar i nämnda BS och CR (figur 1D). Jämförelse mellan könen visar att i FL telomerasaktivitet är högre hos kvinnor i motsats till BS och CR visar högre telomerasaktivitet hos hanar.
I vävnader som uttrycker låga halter av telomerasaktivitet har vi funnit att detektionen av DNA-stege genom att använda PCR är mer effektivt utan att använda den interna kontrollen (IC) primer, eftersom IC utnyttjar TS som en framåt primer därmed störa DNA-stege förstärkning. Reproducerbarheten av de data åstadkommes genom att upprepa varje experiment flera gånger.
Figur 1 Telomerasaktivitet i mushjärna: Traditionell kontra modifierad TRAP analys. A) Telomerasaktivitet i 3 områden i hjärnan analyseras av radioaktivt TRAP-analys (2 månader gamla CD-1 hanmöss, 2 ug proteiner extrakt). B) Känslighet för den modifierade TRAP-analysen visas med sjunkande koncentrationer av proteinerna extrakt från glioblastom U -251 cellinje. C, D) Telomerasaktivitet i 3 hjärnregioner 1 (C) och 3 (D) månader CD-1 kvinnliga och manliga möss. börjar DNA-stege på 50 bp-bandet med steg 6 bp. (NC - negativ kontroll, IC-intern kontroll, BS - hjärnstammen, CR - lillhjärnanFL - frontalloben).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analys av telomeras-aktivitet i musen hjärnan via TRAP-testet består av fyra viktiga steg: 1) protein extraktion från specifika regioner i hjärnvävnaden 2) TS primer förlängning av telomeras - telomeras reaktion 3) förstärkning av telomeras reaktionsprodukter med PCR 4 ) separation av PCR-produkter med användning av hög upplösning agarosgel.
Denna modifierade TRAP analys behandlar två stora svårigheter som reser sig från den traditionella analysen: användning av radioaktiva dCTP är för känslig detektion av PCR produkter och PAGE separation av DNA-stege. Högupplöst agarosgel förenklar detektion av telomeras-reaktionsprodukter (den DNA-stege) jämfört med svårhanterlig sekvense PAGE. Dessutom är nukleinsyran färgning en ogiftig lösning med hög känslighet som krävs för detektering av små mängder DNA.
Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt följande kritiska steg: 1) Att hålla tiden mellan avlägsna vävnad och homogenisering till ett minimum för att bevara proteinintegritet 2) käkar lysbuffert omfrysning bör undvikas 3) proteinextrakt bör förvaras i portioner och tinas en gång före användning. Undvik omfrysning av prover.
Problem kan uppstå under gelframställningen steget eftersom hög koncentration agarosgel är benägen att spillover och kräver stor uppmärksamhet under tillagningen. Tekniken har flera begränsningar med nödvändigheten av att köra gelén i ett kallt rum. Dessutom kan den låga mängden av PCR-produkter som inte visas på en UV-tabell.
Telomerasaktivitet nivån varierar mellan olika vävnader och anses vara låg i hjärnan. Detta protokoll ger en känsligare detektionsmetod, jämfört med den traditionella radioaktiva analysen möjliggör bättre upptäckt av telomeras-aktivitet i hjärnan. Även olika tidseffektiva metoder är tillgängliga (ett steg TRAP analyssatser, med hjälp av en labeled TS primer för detektion) dessa metoder är betydligt dyrare. Dessutom eliminerar användningen av agaros den toxiska faran av att använda polyakrylamidgel.
Såsom uppenbaras från de representativa resultat, genom att använda den ovan beskrivna metoden är det möjligt att påvisa skillnader i telomerasaktivitet nivåer mellan de olika regioner i hjärnan och mellan manliga och kvinnliga. Denna metod kan användas för påvisande av telomerasaktivitet i andra normala vävnader med låg telomerasaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
