Abstract
ट्रांसक्रिप्शनल और बाद ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन दोनों जीनों की अभिव्यक्ति पर गहरा प्रभाव पड़ता है। हालांकि, आमतौर पर अपनाया सेल आधारित स्क्रीनिंग assays के अनिवार्य रूप से प्रमोटर-लक्ष्य अणुओं की पहचान करने के उद्देश्य से किया जा रहा है, ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन पर ध्यान केंद्रित। नतीजतन, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र काफी हद तक जीन अभिव्यक्ति लक्षित दवा के विकास का पर्दाफाश किया जाता है। यहाँ हम, और इसे संशोधित करने में सक्षम यौगिकों की पहचान करने में अपनी mRNA की भाग्य के मॉडुलन में 3 'untranslated क्षेत्र (3' UTR) की भूमिका की जांच करने के उद्देश्य से एक सेल आधारित परख का वर्णन है। परख stably एक रोग-प्रासंगिक सेल लाइन में एकीकृत ब्याज की एक जीन के 3 'UTR से युक्त एक luciferase संवाददाता निर्माण के उपयोग पर आधारित है। प्रोटोकॉल इलाज के 24 घंटे के बाद luciferase गतिविधि को प्रभावित करने वाले अणुओं की पहचान करने के उद्देश्य से प्राथमिक स्क्रीनिंग पर प्रारंभिक ध्यान देने के साथ, दो भागों में बांटा गया है। प्रोटोकॉल के दूसरे भागवर्णन करता जवाबी स्क्रीनिंग विशेष रूप से 3 'UTR के माध्यम से luciferase गतिविधि modulating यौगिकों भेदभाव करने के लिए आवश्यक है। विस्तृत प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम के अलावा, हम परख विकास और अंतर्जात लक्ष्य पर हिट (एस) की मान्यता के बारे में महत्वपूर्ण विचार प्रदान करते हैं। वर्णित सेल आधारित रिपोर्टर जीन परख वैज्ञानिकों ने एक 3 'UTR पर निर्भर के बाद ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र के माध्यम से प्रोटीन का स्तर modulating अणुओं की पहचान करने की अनुमति देगा।
Introduction
जीन अभिव्यक्ति की एक लंबी अवधि ट्रांसक्रिप्शनल नियमन के लिए प्रोटीन के उत्पादन को नियंत्रित करने में नहीं विशेष भूमिका अगर एक प्रमुख खेलने के लिए सोचा था। सबूत जमते, हालांकि, बाद ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन सेलुलर प्रोटीन बहुतायत 1,2 निर्धारित करने के लिए के रूप में ज्यादा है, अगर नहीं, ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की तुलना में अधिक योगदान देता है कि इंगित करता है। जीन की अभिव्यक्ति के बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण पहले सोचा था पर था की तुलना में अधिक जटिल और विस्तृत है। वास्तव में, के बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण के सभी विभिन्न चरणों mRNA के प्रसंस्करण, स्थानीयकरण, कारोबार, अनुवाद 3 के साथ ही नव वर्णित प्रतिवर्ती आरएनए मेथिलिकरण 4 सहित विनियमित करने में उभरा है। पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन प्रक्रियाओं के एक नंबर के संभावित प्रभावित से, परख नीचे वर्णित mRNA के 3 'untranslated क्षेत्र (3' UTR) शामिल उन पर केंद्रित है। 3 'UTR से मोटे तौर पर शाही सेना के बंधन जनसंपर्क के विशिष्ट बातचीत के माध्यम से मुख्य रूप से mRNA के भाग्य को प्रभावित करता हैअपनी विनियामक दृश्यों और / या माध्यमिक संरचनाओं से 5 oteins और गैर-कोडिंग RNAs। इसलिए, इन मुलाकातों को बदलने या नदी के ऊपर संकेत पारगमन रास्ते के साथ हस्तक्षेप है कि छोटे अणुओं प्रोटीन बहुतायत को नियंत्रित करता है कि शेष बदलाव होगा। यह चिकित्सकीय दृष्टिकोण के लिए जो सबूत रोग-प्रासंगिक जीनों इस प्रकार औषधीय हस्तक्षेप के लिए एक संभावित लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है जो पद-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, के अधीन हैं दिखा रहा है कि मौजूद मानव विकृतियों के लिए विशेष महत्व का है। इसलिए, एक उच्च throughput प्रारूप में पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण तंत्र के साथ हस्तक्षेप के माध्यम से mRNA स्तर 'modulators के स्क्रीनिंग के लिए अनुमति सिस्टम संभावित उपन्यास उपचार की पहचान करने में कीमती उपकरण बन सकता है।
वर्णित सेल आधारित रिपोर्टर जीन परख अपनी 3 'UTR पर निर्भर तंत्र के माध्यम से mRNA के भाग्य मिलाना करने में सक्षम यौगिकों की पहचान के लिए अनुमति देता है। यह कई प्राचार्य सी के होते हैंomponents (चित्रा 1) और कुछ प्रारंभिक चरणों की आवश्यकता है परख की व्यवहार्यता को मान्य करने के लिए। सबसे पहले, संवाददाता निर्माण ब्याज की एक जीन से 3 'UTR से शामिल करने के लिए बनाया गया है। 3 'UTR से इस तरह के जुगनू luciferase (चित्रा 1) के रूप में एक पत्रकार जीन के अंत से जुड़े हुए है। डाला 3 'UTR के माध्यम से exerted के बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण तंत्र में कोई भी परिवर्तन विभिन्न luciferase स्तर में जिसके परिणामस्वरूप, इस चिमेरिक प्रतिलेख की स्थिरता और / या अनुवाद दक्षता बदल जाएगा। इसलिए, luciferase गतिविधि में परिवर्तन ब्याज की जीन के प्रभावित पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के रूप में अप्रत्यक्ष उपाय काम करते हैं। प्रणाली के दूसरे घटक एक नियंत्रण संवाददाता का निर्माण, एक ही रिपोर्टर जीन व्यक्त करता है, लेकिन किसी भी 3 'UTR से शामिल नहीं करता है कि एक समान अभिव्यक्ति प्लाज्मिड है। दो रिपोर्टर प्लास्मिड पारंपरिक आणविक जीव विज्ञान प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला में बनाया गया है या वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा जा सकता है।
एक उपयुक्त सेल लाइन का चयन परख निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है। जो सेल लाइन इष्टतम मॉडल है उपलब्धता, transfectability, और विकास विशेषताओं की तरह सिर्फ व्यावहारिक मुद्दों को विकृति के लिए अधिक से अधिक समानता जैसे नैदानिक आवश्यकताओं से लेकर कई कारकों पर निर्भर करता है। महत्वपूर्ण बात है, पहले एक पत्रकार जीन के लिए 3 'UTR का फ्यूजन चिमेरिक प्रतिलेख के स्तर पर एक उम्मीद प्रभाव पड़ता है सुनिश्चित करना चाहिए कि आगे बढ़ने के लिए। 3 से luciferase संकेत में महत्वपूर्ण अंतर के अभाव वैकल्पिक लोगों की खोज के लिए उत्साह, UTR से इस सेलुलर मॉडल में कार्यशील नहीं है 'UTR असर और नियंत्रण संवाददाता क्षणिक तीन संकेत मिलता है कि चयनित कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट constructs'। उच्च throughput प्रारूप के लिए, 3 'UTR असर और नियंत्रण luciferase संवाददाता निर्माणों stably चयनित सेल लाइन में एकीकृत किया जाना चाहिए। का प्रयोग एक stably क्षणिक अधिक एकीकृत ट्रांसफ़ेक्टसेल लाइन कई कारणों के लिए बेहतर है। यह लागत कम, अभिकर्मक दक्षता में उतार-चढ़ाव से उत्पन्न होने वाले डाटा में परिवर्तनशीलता में कमी, हार्ड-transfect सेल लाइनों सहित एक सेलुलर मॉडल के चुनाव को व्यापक होगा। इसके अलावा, क्षणिक अभिकर्मक कोशिकाओं पर बहुत बार सिस्टम की संतृप्ति के लिए अग्रणी एक डीएनए प्लाज्मिड के साथ अतिभारित हैं। इन स्थितियों में संवाददाता अभिव्यक्ति में एक और वृद्धि संभावित upregulating यौगिकों की दिशा में कमी हुई संवेदनशीलता, जिसके परिणामस्वरूप में चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
सभी परख घटकों को स्थापित कर रहे हैं जब luciferase गतिविधि वास्तव में ऊपर और नीचे विनियमित '3 डाला के माध्यम से विशेष रूप से किया जा सकता है अगर अंत में, यह, परख, यानी की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए उच्च throughput प्रारूप में जाने से पहले महत्वपूर्ण है UTR। सबसे अच्छा नियंत्रण ब्याज के 3 'UTR के माध्यम से mRNA की स्थिरता या translatability मिलाना सूचना दी छोटे अणुओं होगा। इन चल रहा हैसंभव नहीं, वांछित प्रभाव नकल सरोगेट नियंत्रण स्वीकार कर रहे हैं। ये miRNAs या ब्याज के 3 'UTR के लिए बाध्य करने के माध्यम से अपने प्रभाव डालती के लिए जाना जाता आरएनए बंधनकारी प्रोटीन हो सकता है। इस तरह के नियंत्रण का मूल्यांकन प्राथमिक जांच विकसित की परख की कार्यक्षमता को इंगित करता है, लेकिन यह भी उच्च throughput प्रारूप में अपनी गतिशील रेंज, संवेदनशीलता और प्रदर्शन के आकलन के लिए अनुमति देता है न केवल पहले।
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग हम एक 2000-यौगिक पुस्तकालय छह की जांच की। Neuroblastoma, बचपन की सबसे आम extracranial ठोस ट्यूमर, एक जैविक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था और जिसका प्रवर्धन MYCN ओंकोजीन, के 3 'UTR से दृढ़ता से एक लक्ष्य जीन के रूप में 7 neuroblastoma के प्रतिकूल परिणाम, भविष्यवाणी की है। दो प्रयोगात्मक लेआउट रूपरेखा चित्रा। स्क्रीनिंग एक समय में जांच 27 प्लेटों के बैच के आकार के साथ तीन रन में विभाजित किया गया था। 27 प्लेटों के बैच स्पेक्ट्रम संग्रह पुस्तकालय शामिलप्लेटों n.1-n.8 + n.25 (पहला भाग), n.9-n.16 + n.25 (दूसरा रन) और n.16-n.24 + n.25 (तृतीय रन), प्रत्येक थाली तीन प्रतियों में जांच की। इस प्रकार, एक पुस्तकालय प्लेट (n.25) संभव इंटर रन की तुलना करने के लिए सभी तीन रन के भीतर assayed किया गया था। प्रोटोकॉल के नीचे तीन प्रतियों में परीक्षण 9 पुस्तकालय प्लेटों की एक भी रन का वर्णन है।
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Protocol
नोट: इस तरह परख प्रणालियों के throughput उपलब्ध एचटीएस प्रयोगशाला उपकरणों पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल 96 अच्छी तरह प्रारूप में तरल से निपटने प्रदर्शन करती है जो एक TECAN स्वतंत्रता EVO 200 रोबोट, से मदद की है। 384 अच्छी तरह से करने के लिए प्रारूप miniaturization भी संभव है। रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली सभी प्रयोगात्मक चरणों के दौरान सड़न रोकनेवाला स्थिति बनाए रखने के क्रम में एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत तैनात है। कोई तरल-संभाल स्वचालन उपलब्ध है, तो प्रोटोकॉल आसानी से कम throughput के प्रारूप करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
प्राथमिक जांच
1. दिन 1: तैयार करने और बीज कोशिकाओं
नोट: बीज कोशिकाओं luciferase गतिविधि, बोने के बाद, यानी 48 घंटा परख करने की क्रिया के समय में 80% संगम उपज के लिए।
- Resuspend 10% FBS और 1% एल glutamine युक्त RPMI में 2 × 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए CHP134-mycn3UTR neuroblastoma कोशिकाओं trypsinized। 27 प्लेटों के लिए कम से कम 250 मिलीलीटर की तैयारी खाता तरल से निपटने में ले सेल निलंबन, मृत मात्रा और दोहराया pipetting के चरणों troughs। बाँझ जलाशय में सेल निलंबन डालो और रोबोट मेज पर जगह है।
- 9 बारकोड वाले सफेद फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें और रोबोट मेज़ पर 200 μl बाँझ pipet सुझावों का एक बॉक्स रखें। गुरुत्वाकर्षण के तहत निपटाने कोशिकाओं से बचने के लिए प्रत्येक विधान कदम से पहले pipetting द्वारा सेल निलंबन मिलाएं। अच्छी तरह से प्रति 1.5 × 10 4 कोशिकाओं की एक अंतिम घनत्व पाने के लिए 9 प्लेटों के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के 75 μl बांटना।
- Lids के साथ प्लेटों को कवर किया और कोशिकाओं को अच्छी तरह से नीचे तलछट के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर के बाहर उन्हें छोड़ दें। इस बढ़त प्रभाव कम कर देंगे।
- दोहराएँ 27 प्लेटों की कुल संख्या तैयार करने के क्रम में दो बार 1.2 और 1.3 कदम।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें प्लेस और 5% सीओ 2 और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
2. दिन 2: लाइब्रेरी यौगिकों के साथ कोशिकाओं का इलाज
ntent "> नोट: स्पेक्ट्रम संग्रह छोटे अणु पुस्तकालय DMSO में 10 मिमी की एकाग्रता में 25 96 अच्छी तरह से प्लेट में आठ पंक्तियों और 10 स्तंभों में व्यवस्थित 2000 यौगिकों के होते हैं पहला और आखिरी स्तंभों पर कुओं नियंत्रण के लिए खाली छोड़ दिया जाता है। । यौगिक स्क्रीनिंग assays के लिए आम तौर पर 1-10 माइक्रोन यौगिक एकाग्रता 8 पर प्रदर्शन कर रहे हैं। यहाँ वर्णित स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल काम एकाग्रता के रूप में 2 माइक्रोन और परख अंत बिंदु के रूप में 24 घंटा हल करता है।- कमरे के तापमान पर नौ यौगिक पुस्तकालय प्लेटें गला लें।
- बाँझ पीबीएस और पीबीएस 0.5% DMSO के समाधान के साथ दो troughs के लिए तैयार है और रोबोट मेज़ पर उन्हें जगह है। प्रत्येक पुस्तकालय थाली के लिए, तैयार करने और तदनुसार एक कमजोर पड़ने की थाली लेबल - कम से कम 400 μl के एक काम की मात्रा के साथ एक polypropylene यू-नीचे 96 अच्छी तरह से थाली। तरल हैंडलर की तय की युक्तियों का उपयोग बाँझ पीबीएस के 398 μl के साथ कमजोर पड़ने प्लेटों के 11 कॉलम 2 में से प्रत्येक में अच्छी तरह से भरें। भरें कॉलम एक और बाँझ पीबीएस के 12 50 के साथ μlनियंत्रण कुओं में वाहन एकाग्रता (0.02%) को पुन: पेश करने के क्रम में 0.5% DMSO के साथ।
- दो पुस्तकालय प्लेटें, तदनुसार लेबल वाले कमजोर पड़ने प्लेटें, 50 μl बाँझ pipet सुझावों के दो बक्से और रोबोट मेज़ पर छह कोशिकाओं प्लेटों रखें। कोशिकाओं प्लेटों खुलना।
- Pipet दो इसी कमजोर पड़ने की थाली में दो पुस्तकालय प्लेटों में से एक से 10 मिमी शेयर समाधान के μl और अच्छी तरह मिक्स। यह 50 माइक्रोन का एक मध्यवर्ती यौगिकों एकाग्रता में परिणाम होगा। सुझावों का एक ही सेट का प्रयोग, कोशिकाओं के साथ तीन बारकोड वाले सफेद 96 अच्छी तरह से प्लेट में 50 माइक्रोन कमजोर पड़ने के 3 μl बांटना। प्रत्येक की एकाग्रता काम कर रहे दो माइक्रोन में यह कमजोर पड़ने योजना परिणाम यौगिक का परीक्षण किया।
नोट:, सुझावों के साथ अनावश्यक जोड़तोड़ से बचने के पुस्तकालय प्लेटें केवल 80 यौगिक होते हैं, भले ही शुरुआत से 96 सुझावों का एक पूरा सेट का उपयोग करें। पहली और पुस्तकालय प्लेटों के अंतिम कॉलम खाली हैं के बाद से यह संभव है। - Pipet सुझावों बदलें और सेंट दोहरानेदूसरा पुस्तकालय प्लेट के लिए ईपी 2.4।
- कोशिकाओं प्लेटों को कवर किया और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में उन्हें वापस।
- दोहराएँ शेष पुस्तकालय प्लेटों के लिए 2.3-2.6 दो बार दोहराएँ।
3. 3 दिन: luciferase परख प्रदर्शन
नोट: luciferase परख प्रदर्शन से पहले, यह प्रत्येक अच्छी तरह से नौ से एक सेल व्यवहार्यता सूचकांक प्राप्त करने के क्रम में resazurin की कमी के आधार पर एक सेल व्यवहार्यता परख के साथ यह मल्टीप्लेक्स के लिए संभव है। बहुसंकेतन luciferase और व्यवहार्यता परख कोशिकाओं luciferase गतिविधि का पर्याप्त उच्च स्तर प्रदान करते हैं, हालांकि, अनदेखा किया जा सकता है कि luciferase संकेत की कमी में assays के परिणाम है। Luciferase गतिविधि स्थिर luminescent के संकेत के साथ वाणिज्यिक और घर का बना 10,11 luciferase परख अभिकर्मकों की एक किस्म से पता लगाया जा सकता है।
- कमरे के तापमान को पसंद का पुनर्गठन luciferase अभिकर्मक संतुलित करना। मात्रा सभी assayed प्लेटों के लिए पर्याप्त है सुनिश्चित करें। 27 प्लेट के लिएluciferase अभिकर्मक के 170 मिलीलीटर खाता तरल से निपटने में लेने की आवश्यकता होगी, मृत मात्रा और दोहराया pipetting के चरणों troughs। एक जलाशय में luciferase अभिकर्मक डालो और रोबोट मेज पर जगह है।
- इनक्यूबेटर से कोशिकाओं के साथ नौ प्लेटें निकालें रोबोट मेज़ पर उन्हें जगह है, को उजागर करने और कमरे के तापमान को equilibrated तक प्रतीक्षा करें। थाली से अच्छी तरह से थाली प्रति luciferase अभिकर्मक के 50 μl जोड़ें। प्लेटों के बीच, एक थाली के luminescence पढ़ने के समय के बराबर एक देरी परिचय। यह सभी प्लेटों अभिकर्मक अलावा से बराबर समय अंतराल के भीतर मापा जाता है कि विश्वास दिलाता हूँ।
- एक 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, luminometer में पहली थाली प्लेस और एक संक्षिप्त मिलाते कदम के बाद luminescence के उपाय। सभी प्लेटों के लिए दोहराएँ। प्रत्येक थाली के बारकोड रिकॉर्ड और संभाला प्लेटों की एक बड़ी संख्या से उत्पन्न होने वाली गलतियों से बचने के लिए इसी डाटा फाइल करने के लिए सहयोगी।
- दोहराएँ कोशिकाओं के साथ शेष 18 प्लेटों के लिए दो बार 3.2-3.3 कदम। शेष luciferase अभिकर्मक लीजिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान।
4. 4 दिन: डेटा विश्लेषण
- पर प्लेट वाहन का इलाज नियंत्रण के औसत करने के लिए सभी नमूनों को सामान्य प्रक्रिया का उपयोग कर प्रयोगात्मक डेटा। प्रत्येक पुस्तकालय परिसर के लिए, triplicates से अधिक मतलब मूल्य एक्स और एसडी गणना।
- चुनें विनियमन अप और डाउन विनियमन मतलब मूल्य एक्स और एसडी सभी परख संसाधित मूल्यों पर गणना कर रहे हैं, जहां एसडी, और कश्मीर × कश्मीर ± एक्स की एक सीमा निर्धारित करके हिट एक परिभाषित स्थिर है।
- एक मनमाना दहलीज कट ऑफ <luciferase संकेत की कमी सबसे शायद यौगिक विषाक्तता के साथ जुड़ा हुआ है जब वाहन का इलाज नियंत्रण के 20% का चयन करें। इस सीमा से नीचे हिट फेंकना काफी जवाबी स्क्रीनिंग में झूठी सकारात्मक हिट की संख्या कम हो जाएगा।
नोट: इसके बजाय नियंत्रण आधारित सामान्य बनाने की प्रयोगात्मक डेटा जेड स्कोर या अपनी मजबूत अनुरूप बी एस लागू करने संसाधित किया जा सकता हैकोर 12। इसके अलावा, हिट चयन के लिए वैकल्पिक सांख्यिकीय दृष्टिकोण 12 उपलब्ध हैं।
5. काउंटर स्क्रीनिंग
नोट: प्राथमिक स्क्रीन में पहचान यौगिकों की पुष्टि की और एक काउंटर स्क्रीनिंग द्वारा विशिष्टता के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं ('हिट' लेबल)।
- चेरी इसी लेआउट बचत, एकल 2 डी बारकोड वाले ट्यूबों में संग्रहीत aliquots से चयनित हिट लेने के लिए और नए "प्लेटों हिट 'पैदा करते हैं। नियंत्रण के लिए मुक्त करने के पदों को छोड़ने के लिए मत भूलना।
नोट: एक कुशल चेरी उठा प्रणाली के अभाव में, एक नियंत्रण और प्राथमिक जांच में समानांतर में 3 'UTR असर कोशिकाओं दोनों परीक्षण हो सकता है। इस मामले में, केवल शुरू की 3 'UTR पर निर्भर प्रभाव के साथ यौगिकों के विशिष्ट चयन जवाबी स्क्रीनिंग की आवश्यकता को नष्ट प्राथमिक जांच के बाद ही संभव हो जाएगा। बहरहाल, दो सेल लाइनों में समानांतर स्क्रीनिंग परख दोगुनी हो जाएगीलागत। - प्राथमिक जांच के लिए प्रोटोकॉल (धारा "दिन 1: तैयार करने और बीज कोशिकाओं") के बाद, प्रत्येक हिट "प्लेट" के लिए प्रत्येक CHP134-mycn3UTR और CHP134-Ctrl स्थिर कोशिकाओं के तीन 96 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करते हैं।
- प्राथमिक जांच के लिए प्रोटोकॉल (धारा "दिवस 2: लाइब्रेरी यौगिकों के साथ कोशिकाओं का इलाज") के बाद, एकाग्रता काम कर रहे दो माइक्रोन से कम तीन CHP134-mycn3UTR और तीन CHP134-Ctrl प्लेटों के इलाज के लिए प्रत्येक हिट प्लेट का उपयोग करें।
नोट: यहाँ वर्णित काउंटर स्क्रीन 2 माइक्रोन की एक खुराक पर triplicates में किया जाता है, वहीं यह मानक प्रतिकृति स्थानापन्न और 2 माइक्रोन से 20 एनएम से लेकर 10 गुना dilutions के रूप में तीन सांद्रता में हिट परीक्षण करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। इस दृष्टिकोण को लागू केवल झूठी सकारात्मक दरों को कम करने, प्राथमिक हिट पर प्रारंभिक खुराक प्रतिक्रिया डेटा प्राप्त करने के लिए भी प्राथमिक स्क्रीन के डेटा की पुष्टि की, लेकिन करने के लिए अनुमति नहीं होगी। इस मामले में, एक अलग विश्लेषण पाइपलाइन appli के लिए किया जाना चाहिएएड प्रयोगात्मक डेटा की प्रक्रिया और हिट पुष्टि करने के लिए। - प्राथमिक जांच के लिए प्रोटोकॉल (धारा "3 दिन: luciferase परख प्रदर्शन") के बाद, सभी CHP134-mycn3UTR और CHP134-Ctrl प्लेटों में luciferase गतिविधि को मापने।
- प्राथमिक जांच के लिए प्रोटोकॉल (धारा "दिवस 4: डेटा विश्लेषण") के बाद, पर प्लेट वाहन का इलाज नियंत्रण के औसत के लिए इलाज कुओं से प्रयोगात्मक डेटा मानक और प्रतिकृति से अधिक मतलब है और एसडी गणना। प्रत्येक परीक्षण परिसर के लिए, CHP134-Ctrl कोशिकाओं बनाम CHP134-mycn3UTR में luciferase गतिविधि के गुना परिवर्तन की गणना। का मनमाना गुना परिवर्तन कट-नापसंद> <0.01 के 1.5 और महत्व पी-मूल्यों का चयन करें।
नोट: हिट विशिष्टता के लिए निर्धारक पैरामीटर CHP134-Ctrl कोशिकाओं बनाम CHP134-mycn3UTR में luciferase गतिविधि का एक महत्वपूर्ण गुना परिवर्तन है वर्णित परख सेटिंग्स में। यदि आवश्यक हो, एक भी एसई पर समवर्ती एक सेल व्यवहार्यता परख प्रदर्शन करके यौगिक विषाक्तता का आकलन हो सकता हैlected यौगिकों। प्राथमिक हिट एक खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण में जवाबी जांच कर रहे हैं यह विशेष रूप से लाभप्रद हो सकता है। एक खुराक के लिए, हमारे अनुभव 6 सेल व्यवहार्यता में कमी आई के साथ कम luciferase गतिविधि का एक मजबूत संबंध को दर्शाता है। इसलिए, लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण कक्षों में luciferase गतिविधि में कमी आई परीक्षण किया एकाग्रता में यौगिक विषाक्तता का एक संकेतक के रूप में माना जा सकता है।
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Representative Results
वर्णित दृष्टिकोण का प्रयोग, हम MYCN जीन के 3 'UTR के माध्यम से exerted के बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण तंत्र की क्षमता modulators के लिए एक 2000-यौगिक पुस्तकालय की जांच की। 3 एक पुस्तकालय थाली द्वारा उदाहरण प्राथमिक जांच के परिणामों को दर्शाया गया है चित्रा। वाहन का इलाज नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में प्रदर्शित luciferase संकेत एक पुस्तकालय थाली के यौगिकों के साथ इलाज CHP134-mycn3UTR कोशिकाओं की तीन प्रतियों प्लेटों में luciferase गतिविधि को मापने के द्वारा प्राप्त हुई थी। जैसी कि उम्मीद थी 100% आधारभूत करने के लिए करीब मूल्यों से संकेत के रूप में, यौगिकों के बहुमत luciferase गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। हिट (स्पष्ट चौकों) मतलब मूल्य एक्स और एसडी सभी परख मूल्यों पर गणना कर रहे हैं, जहां एक्स ± 2 एसडी, की एक सीमा की स्थापना चयन किया गया था। पता चला निषेध सबसे शायद pronou से परिणाम के रूप में 20% (asterisk के साथ चिह्नित एक) नीचे luciferase गतिविधि को कम करने के यौगिकों को ध्यान से हटा दिया जाना चाहिएपरिसर के nced सेलुलर विषाक्तता।
चित्रा 4 के बारे में 100 यौगिकों की जवाबी स्क्रीनिंग में प्राप्त आंकड़ों के कुछ प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है। यौगिक एक्स कुछ साइटोटोक्सिक गतिविधि को प्रदर्शित करता है, जबकि CHP134-Ctrl कोशिकाओं में सामान्यीकृत luciferase संकेत से आंका जा सकता है, दो माइक्रोन एकाग्रता में यौगिक डब्ल्यू, सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं है। डब्ल्यू और एक्स दोनों यौगिकों, हालांकि, MYCN 3 का कारण 'अप-विनियमन गुना परिवर्तन का अंतर और टी परीक्षण के संकेत के रूप luciferase गतिविधि की, UTR विशिष्ट। 2 माइक्रोन एकाग्रता में यौगिक वाई CHP134 कोशिकाओं की व्यवहार्यता समझौता करने के लिए लगता है; विशिष्टता के संदर्भ में CHP134-mycn3UTR और CHP134-Ctrl कोशिकाओं में luciferase गतिविधि में कोई अंतर नहीं है। एक बराबर अप-विनियमन CHP134-Ctrl कोशिकाओं में मनाया जाता है क्योंकि अंत में, यौगिक Z के लिए प्राथमिक जांच में पता चला luciferase गतिविधि में वृद्धि हुई है, MYCN 3 'UTR पर सही मायने निर्भर नहीं है। हम मीटर में जिसके परिणामस्वरूप किसी भी हिट का पता नहीं चलाYCN 3 'UTR विशिष्ट नीचे विनियमन luciferase गतिविधि की।
चित्रा 1:। सेल आधारित रिपोर्टर जीन परख के घटक ऊपरी पैनल MYCN जीन की योजनाबद्ध चित्र प्रदर्शित करता है। MYCN प्रतिलेख (NM_005378.4) पैमाने पर करने के लिए तैयार है। बक्से छायांकित क्षेत्रों सीडीएस के लिए इसी के साथ एक्सॉनों का प्रतिनिधित्व करते हैं, लाइनों इंट्रोन्स प्रतिनिधित्व करते हैं। रिपोर्टर ल्यूक-Ctrl और ल्यूक-3UTR-mycn रेखाचित्र के रूप में नीचे प्रतिनिधित्व कर रहे हैं constructs। सीएमवी, cytomegalovirus; SV40, बंदर का वायरस 40. CHP134 neuroblastoma सेल लाइन में aforementioned प्लास्मिड का उपयोग कर stably ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के उत्पादन के लिए चुना गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। प्राथमिक जांच की रूपरेखा प्रत्येक एकल यौगिक पुस्तकालय थाली CHP134-mycn3UTR कोशिकाओं की तीन प्रतियों प्लेटों के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया था। Luciferase गतिविधि इलाज के 24 घंटे के बाद मापा गया था।
चित्रा 3:। प्राथमिक जांच में से एक भी 96 अच्छी तरह से थाली का प्रतिनिधित्व सामान्यीकृत मूल्यों की प्लेट अच्छी तरह से तितर बितर साजिश 96 अच्छी तरह से प्लेट में बढ़ रही CHP134-mycn3UTR कोशिकाओं 2 माइक्रोन एकाग्रता में पुस्तकालय यौगिकों के साथ इलाज किया गया। प्रत्येक बिंदु एक ही थाली के भीतर वाहन का इलाज नियंत्रण में पाया मतलब luciferase संकेत करने के लिए 24 को उपचार के मानव संसाधन और सामान्यीकृत के बाद एक भी परिसर के लिए पता लगाया luciferase गतिविधि से मेल खाती है। डेटा बिंदुओं एक 96 अच्छी तरह से थाली के भीतर यौगिकों स्थिति (कच्चे एक से कॉलम 2-10 में 10 यौगिकों के लिए निम्न प्रदर्शित कर रहे हैंजी)। एसडी दिखाया गया है ± तीन प्रतिकृति मतलब है। हिट स्पष्ट चौकों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं। 20% से नीचे कम luciferase गतिविधि द्वारा विशेषता हिट asterisk के साथ चिह्नित है।
चित्रा 4:। जवाबी स्क्रीनिंग CHP134-mycn3UTR और CHP134-Ctrl स्थिर कोशिकाओं के प्रतिनिधि उदाहरण यौगिकों प्राथमिक जांच में पूर्व चयनित साथ समानांतर में इलाज किया गया। luciferase परख 2 माइक्रोन एकाग्रता में इलाज के 24 घंटे के बाद किया गया था। ग्राफ हर बार संकेत दिया स्थिर कोशिकाओं में वाहन का इलाज नियंत्रण का मतलब luciferase संकेत करने के लिए एक एकल और मिश्रित सामान्यीकृत के लिए पता लगाया luciferase गतिविधि से मेल खाती है डब्ल्यू, एक्स, वाई, और जेड नामित चार चयनित यौगिकों के लिए प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है। प्रदर्शित कर रहे हैं दो पूंछ टी परीक्षण में परिवर्तन का अंतर और सांख्यिकीय महत्व मोड़ो, ** पी <0.01,*** पी <0.001।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50 μl Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200 μl Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
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