Abstract
التطورات الحديثة في تطبيق خلايا نخاع العظم الجذعية الوسيطة (BMMSC) لعلاج إصابات الأوتار والأربطة في الحصان أقترح تحسين مقاييس النتائج في كل من الدراسات التجريبية والسريرية. على الرغم من أن BMMSC يتم زرعها في آفة وتر بأعداد كبيرة (عادة 10 حتي 20000000 الخلايا)، سوى عدد قليل نسبيا البقاء على قيد الحياة (<10٪) على الرغم من أن هذه يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى 5 أشهر بعد الزرع. هذا يبدو أن المراقبة المشتركة في الأنواع الأخرى حيث تم زرع BMMSC إلى الأنسجة الأخرى وأنه من المهم أن نفهم عند حدوث هذه الخسارة، وكيفية البقاء على قيد الحياة كثير عملية زرع الأولية وما إذا كان يتم مسح الخلايا في الأجهزة الأخرى. تتبع مصير الخلايا يمكن تحقيقه عن طريق radiolabeling وBMMSC قبل الزرع التي تسمح غير الغازية في التصوير المجراة من موقع الخلية النوعي والكمي لأعداد الخلايا.
يصف هذا البروتوكول على labeli الخليةالإجراء نانوغرام يستخدم التكنيتيوم-99m (TC-99m)، وتتبع هذه الخلايا التالية زرع في الأوتار المثنية اصابة في الخيول. TC-99m هو (ر 1/2 من 6.01 ساعة) النظائر قصيرة الأجل التي تنبعث أشعة جاما، ويمكن أن يكون داخليا من قبل الخلايا في وجود hexamethylpropyleneamine أوكسيم مجمع محبة للدهون (HMPAO). هذه الخصائص تجعله مثاليا للاستخدام في عيادات الطب النووي لتشخيص كثير من الأمراض المختلفة. يمكن اتباعها مصير الخلايا المسمى في المدى القصير (تصل إلى 36 ساعة) من خلال جاما مضان لتحديد كل من عدد من الخلايا الاحتفاظ بها في الآفة وتوزيع الخلايا في الرئتين والغدة الدرقية وغيرها من الأجهزة. ويتم تكييف هذه التقنية من وضع العلامات الكريات البيض في الدم، ويمكن استخدامها لصورة مزروع BMMSC في الأجهزة الأخرى.
Introduction
وتستند استراتيجيات التجدد لإصلاح الأنسجة المريضة أو التالفة على الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستمدة من مجموعة متنوعة من الأنسجة وزرعها في المنطقة المصابة. وقد أظهرت التطورات الأخيرة في تطبيق ذاتي BMMSC لعلاج وتر وإصابات الرباط في الحصان تحسين مقاييس النتائج في كل تجريبي 1-5 والدراسات السريرية 6. الحصان هو نموذج جاذبية خاصة لتقييم فعالية الخلايا الجذعية العلاجات المتعلقة لأنها تعاني من العمر وإرهاق الإصابات المتعلقة الأوتار من forelimb البعيدة، فمن حيوان الرياضي، وأنه هو كبير، وتسهيل الانتعاش نخاع العظام و غرس دقيقة. إصابات الأوتار تلتئم بشكل طبيعي مع التليف ولكن وتر تلتئم هو أدنى وظيفيا 7 ولها مخاطر عالية من إعادة الإصابة 8. يتأثر المثنية الرقمي سطحية وتر (SDFT) الأكثر شيوعا وتطورت لتكون بمثابة الطاقة المرنةويؤكد مخزن والخبرات تحميل عالية لتحقيق كفاءة الطاقة وسرعة عالية الحركة. استعادة وظيفة بعد الاصابة ولذلك حرجة. هذه الإصابات هي مماثلة لتلك التي تؤثر على وتر أخيل في البشر الذي يؤدي وظيفة مماثلة 9. لا توجد خيارات جيدة العلاج لعلاج أو تحقيق حالة جيدة لمثل هذه الإصابات، وتوفر استراتيجيات التجدد بالتالي، يستند خلية فرصة جذابة لتحسين النتائج والحد من إعادة الإصابة.
في معظم الدراسات 5 - يتم حقن 20 مليون BMMSC ذاتي مباشرة إلى الآفة التي تحدث عادة في غضون جوهر الجسم وتر التي بالتالي بمثابة وعاء للخلايا. مصير الخلايا مرة واحدة حقن ليست طرق وضع العلامات الخلية واضحة ومختلفة لتعقب وقد وصفت الخلايا مؤخرا. عرضت الخلايا المسمى مع علامة مضان من أجل البقاء فقط في أعداد صغيرة نسبيا (<10٪) 10،11. تسميات مضان تستلزماستخراج الأنسجة وباجتزاء للتحليل النسيجي الذي هو مضيعة للوقت و لا تسهل بسهولة التحليل الزمني في نموذج حيواني كبير أو في الحالات السريرية. في مزيد من العمل مؤخرا استخدمنا 99m النظائر المشعة ح لتسمية الخلايا واتبع مصيرهم جاما مضان 1. يسمح هذا الأسلوب مقارنات سريعة ليتم بين طرق مختلفة من تسليم خلية، بما في ذلك داخل الآفة، عن طريق الوريد عن طريق الوريد الوداجي 1 أو نضح الإقليمي عبر داخل الشرايين 12 أو عن طريق الوريد 1،12 الحقن. استمرار وتوزيع الخلايا ومن ثم يمكن تصويرها من قبل جاما مضان من مختلف الأجهزة. ويبين هذا أن 24٪ فقط من حقن الخلايا ظلت intralesionally في الآفة التي مدار 24 ساعة (1) وهذا معتمد من قبل دراسة أخرى باستخدام الآفات خلق تجريبيا وباستخدام نفس radiolabel 5. وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا قدرة محدودة على منزل في الآفات وتر عندما delivereد كتبها نضح الإقليمي أو عن طريق الوريد ولكنها تنتشر في الرئتين عن طريق طرق الأخيرة (4).
BMMSC المسمى مع النانوية الحديد هو طريقة بديلة لتعقب الخلايا المزروعة في الأوتار forelimb 13. على الرغم من جسيمات متناهية الصغر الحديد الخلايا المسمى تسمح تتبع خلية في الجسم الحي بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي، دراسات الزمنية في الحيوانات الكبيرة تقتصر على عدد المرات التي يمكن أن تدار التخدير في كل نقطة زمنية لتنفيذ فحوصات الرنين المغناطيسي. وعلاوة على ذلك، النانوية الحديد هي hypointense على التصوير بالرنين المغناطيسي الذي يحد من المعلومات عن هجرة الخلايا المسمى في الجسم وتر. النظائر المشعة الأخرى التي يمكن استخدامها وتشمل الإنديوم-111 ولكن هذا يعاني من عيب أطول عمر النصف من TC-99m (2.8 أيام مقابل 6.0 ساعة) وارتفاع الطاقة انبعاث أشعة غاما. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن بقاء الخلية أن تنخفض عندما وصفت مع الإنديوم-111 14. TC-99m، من ناحية أخرى، ويستخدم بشكل روتيني في كل من الخيول والإنسان النوويةالطب لتسمية الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي ومتابعة توزيعها في الجسم الحي من قبل مضان. ويمكن بسهولة نسبيا التي اتخذت من قبل الخلايا باستخدام HMPAO كناقل رابط لربط تكنيتيوم، كما TC-99m-HMPAO، إلى الخلايا. وصفت TC-99m-HMPAO BMMSC تظهر قابلية جيدة، ويمكن أن تتكاثر في المختبر 4. هذا البروتوكول تفاصيل وضع العلامات وتتبع BMMSC ذاتي الخيول زرعها في الآفات التي تحدث بشكل طبيعي في SDFT forelimb.
ومن المهم أن نلاحظ أن البروتوكول يهدف فقط لاستخدامها كأداة بحثية. لا ينصح استخدامه كطريقة علاجية سريرية تأثير radiolabel على النمط الظاهري الخلوية لم توضح تماما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت الحالات المبينة في هذه الوثيقة التالية إذن الأخلاقية التي منحتها اللجنة الحيوان أخلاقيات ورفاهيته نقابة Veterinarios دي مالقة، إسبانيا، والكلية الملكية للطب البيطري وشمال Mymms، المملكة المتحدة والإجراءات المستخدمة على الخيول تعتمد على بروتوكولات المعتمدة التي هي المستخدمة في العيادة على الخيول تلقي الخلايا الجذعية العلاجات القائمة التي تشمل التخدير، وتطلع نقي العظم، حقن داخل تري، نضح الإقليمي، الحقن في الوريد، وإدارة العلاج والألم بعد الإجرائية والرصد بعد الزرع.
1. الترتيبات الأساسية ليكون مقدما
- تسعى أخلاقيات المؤسسية وموافقة الرفق بالحيوان والتمسك المتطلبات القانونية المحلية قبل بدء العمل.
- الحصول على موافقة المؤسسية للعمل مع الإشعاعات المؤينة وفقا لما تمليه اللوائح المحلية والقانونية بما في ذلك المستوى المناسب من حماية الأفراد والبيئة والتخلص من contamالنفايات inated.
- استخدام معايير الاشتمال التالية: الخيول الحالية بسبب اصابة في إرهاق غير المؤلمة (tendinopathy أو اعتلال رباطي) إلى وتر الرقمي المثنية السطحية للforelimb والآفات مما يؤدي إلى خلل في غضون وتر وعيب محاط وتر سليمة و / أو مجاورات الوتر .
ملاحظة: تم تفصيل الفحص والتشخيص لمثل هذه الإصابات وإعداد سريرية من الخيول لزرع الخلايا في أماكن أخرى 6،15.
ملاحظة: تم تفصيل العزل والتوسع في ثقافة BMMSC المشتقة من نخاع العظام للخيول سابقا 6،16. البروتوكول الحالي لحقن BMMSC لإصابات SDFT في الحصان يستخدم 10 ملايين الخلايا لكل مل 4 من العظم ذاتي نخاع طاف (BMS) 16. - استخدام الخلايا التي خضعت لا يزيد عن 4 ممرات للزرع في الجسم الحي لتجنب النمط الظاهري الخلوية المحتملين أو التعديلات الجينية المرتبطة عدد مرور عالية جملتعلمي اللغة اإلنكليزية.
- تسليم العدد المطلوب من الخلايا في BMS (في غضون 24 ساعة في مربع البرد في 4-8 درجة مئوية) إلى العيادة البيطرية حيث زرع الخلايا التي يتعين القيام بها.
ملاحظة: استخدام السريري من الخلايا الجذعية الوسيطة في نخاع العظم طاف هو إجراء براءة اختراع مملوكة من قبل شركة ReCellerate (الولايات المتحدة الأمريكية) واستخدامه قد تتطلب الترخيص.
ملاحظة: TC-99m هو باعث غاما (140 كيلو) مع نصف حياة قصيرة نسبيا (6.0058 ساعة، وبالتالي ما يقرب من 94٪ من ويتحلل إلى شكل مستقر لها 99 ح في 24 ساعة). الطاقة جاما يجعلها مناسبة للكشف بواسطة كاميرات جاما (مضان) والقصيرة النتائج نصف العمر في وقت محدود جدا من التعرض للإشعاع إلى كل من الحصان والموظفين التعامل مع الحيوانات. يصف هذا البروتوكول وصفها في الموقع من الخلايا باستخدام TC-99m-HMPAO [المسمى HMPAO مع TC-99m (كما بيرتكنيتات الصوديوم)]. - تأمر TC-99m جديدة من المورد بحيث يتم تسليمها واستخدامها لوصفها خفة دم الخلاياهين 2 ساعة من شطف من مولد TC-99m. ضمان أن يتم توفير TC-99m ك 1 GBq في (معيار عازلة المورد) 1 مل من محلول.
- استخدام جميع المخازن في RT. تنفيذ الإجراء وضع العلامات، وزرع الخلايا والتصوير (غاما مضان) في غرفة الاحتواء النظير مع جميع المعدات تنظيفها مع الكحول مناديل قبل بدء العمل.
2. إعداد الحصان والتصوير بالموجات فوق الصوتية للForelimb وتر
- مسح سجل الموجات فوق الصوتية في أول اعتراف لإصابة (عندما يستنشق نخاع العظام) ومن ثم في نقطة زمنية عندما يتم حقن الخلايا رديولبلد.
- أداء الموجات فوق الصوتية وزرع الخلايا مع الحصان تحمل الوزن بالتساوي في المماطلة وتحت التخدير واقفا (بدلا من التخدير العام). إدارة التخدير باستخدام مزيج من حمض الهيدروكلوريك وبوتورفانول detomidine طرطرات، كل في 0،01-0،02 ملغ / كغ IV.
ملاحظة: الانتعاش السريع وبعد الجراحة العلاج يتطلب أياعتبارات خاصة. - بعد تطبيق التخدير حول العصب (الخطوة 2.6) في الطرف المصاب، والحفاظ على الحصان في محطة تحت التخدير للحد من حركة الحصان أثناء فترة العلاج. تحقق بصريا على مستوى مناسب من التخدير الحكم من موقف رئيس خفضت وسلوك الحصان وأن الحصان هو مريح خلال حقن الخلايا وحركات الكاميرا جاما خلال اقتناء الصور scintigraphic.
ملاحظة: ليس من الضروري تطبيق مرهم التعليم والتدريب المهني على العينين (لمنع جفاف) لأنه في ظل تخدير امض لا يتأثر والحصان هو قادرة على الحفاظ على ترطيب العينين. رصد بعد زرع الخلايا غير الغازية (الموجات فوق الصوتية وأشعة غاما مضان). - كليب عن كثب الشعر المغطي وتر (مع كليبرز شعر الخيل) ثم تنظيف المنطقة قص باستخدام مزيج من فرك الجراحية الكلورهيكسيدين وأخيرا الكحول.
- تطبيق الصوتية هلام اقتران إلى المنطقة، ومسح منهجي لتسجيل بمسح المنطقة المشط تقران الراحة الكاملة، ومستويات وصفت بالتسلسل 1-7 17، مع محول الخطي (12 ميغاهيرتز أو ما شابه ذلك) للحصول على المسلسل عرضية على حدوث والصور الطولية. تخزين الصور رقميا بحيث يمكن الحصول على مساحة المقطع العرضي ومنطقة الإصابة القصوى 4 مع المعونة من برنامج تحليل الصور.
- إعداد المنطقة التي تغمر الأعصاب تقران الراحة البعيدة على الفور إلى رسغ للحقن معقمة من مخدر موضعي لضمان الحساسية كاملة من الجلد المغطي للوتر وسطحية وتر العضلة القابضة الرقمي. حقن 2 مل من mepivicaine على حد سواء تحت الجلد والمتاخمة للأعصاب تقران الراحة (في مكان شبه اللفافي بهم) بين الأوتار الباسطة والرباط المعلق البعيدة على الفور إلى رسغ على كلا الجانبين من أطرافهم.
- مرة واحدة وقد تم إجراء الفحص الأولي إعداد الموقع زرع عن طريق تنقية المنطقة مع الكلورهيكسيدين الصورة الجراحيةحل crub لمدة 5 دقائق على الأقل، وأخيرا الكحول بشاش غارقة. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة بطريقة العقيم.
3. TC-99m وضع العلامات من فرسي الوسيطة الخلايا الجذعية
ملاحظة: الخطوات وسم الخلية لا يمكن أن يؤديها خلال الموجات فوق الصوتية من forelimb حيث سيؤدي ذلك إلى تقليل تسوس النظائر بين وضع العلامات الخلايا وزرع الخلايا المسمى في الوتر.
- إزالة BMS من الخلايا كما أنها تتعارض مع امتصاص النظائر. للقيام بذلك، استرداد قنينة من BMMSC (10 مليون خلية في 1 مل من BMS) من مربع البرد وبيليه الخلايا في microcentrifuge في 350 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة بعناية طاف مع 18G أو 19G إبرة (تعلق على حقنة 2 مل)، وترك قطرة صغيرة (≤0.1 مل) في أنبوب لمساعدة إعادة تعليق الخلية. حفظ طاف (وBMS) في أنبوب microcentrifuge العقيمة والحفاظ على الجليد لاحق إعادة استخدامها.
- resuspend الخلايا في الحبرية المتبقية من طاف بواسطة فلوريداicking أنبوب بلطف مع أصابعك (بدلا من الدوامة) وترك الأنبوب في رفوف في RT. ضمان الخلايا ومعلق تماما وأنه لا توجد كتل الخلايا مرئية.
- إعداد TC-99m النحو التالي. نقل 1 مل من تكنيتيوم بيرتكنيتات إلى قارورة من HMPAO باستخدام حقنة 1 مل و إبرة. المزيج بلطف ولكن بدقة ويترك لمدة 5 دقائق وراء الصدارة التدريع. ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة في حين أن الخلايا هي الغزل في الخطوة 2.1.
- إضافة كافة خليط TC-99m-HMPAO باستخدام حقنة 1 مل و إبرة لخلايا وتخلط بلطف. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT راء الرصاص التدريع.
- للخطوات المقبلة، واستخدام ملقط (أو قطعة من المناديل الورقية) لفتح غطاء أنبوب microcentrifuge للحد من التلوث النظير من (القفاز) الإبهام والمعدات الأخرى في وقت لاحق. استخدام حقنة 2 مل و 21 G إبرة لإضافة أو إزالة غسل العازلة.
ملاحظة: يتم تشجيع استخدام جهاز النظائر ميدانية لرصد تلوث الأسطح والمعدات. إضافة 1 مل PBS إلى خليط TC-99m-HMPAO الخلية، أغلق الغطاء، والمزيج بلطف وتدور لخلايا بيليه كما في الخطوة 3.1. - إزالة بعناية PBS إلى أنبوب جديد (حفظ هذا وراء التدريع الرصاص والتسمية كما W1). resuspend الكرية خلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب وإزالة طاف على النحو الوارد أعلاه (حفظ هذا والتسمية كما W2).
- حساب كفاءة العلامات عن طريق قياس التهم في أنابيب W1 وW2 وبيليه الخلية. القيام بذلك عن طريق وضع كل الأنابيب في بئر جرعة النظائر أداة تدريج وتسجيل النشاط الإشعاعي كما التهم لكل دقيقة (CPM). حساب الكفاءة وصفها باسم (النشاط الإشعاعي كما CPM من الخلايا) / (النشاط الإشعاعي من خلايا + طاف) × 100.
- resuspend الخلايا بدقة في برنامج تلفزيوني المتبقية ثم قم بإضافة حفظ BMS من الخطوة 3.1. الخلايا جاهزة للزرع داخل الآفة.
4. زرع خلايا TC-99m-HMPAO المسمى
- زرع داخل الآفةفي وتر تحت توجيه الموجات فوق الصوتية
- إدخال ببطء 1.5 أو 2 بوصة (50 مم) 20 G الإبرة إلى الحد الأقصى من منطقة الإصابة للآفة في اتجاه طولي مع محول بالموجات فوق الصوتية، وغطت في ثنى العقيمة، وذلك تمشيا مع الإبرة بحيث يكون طول الإبرة يمكن الكشف عن هويته ultrasonographically وغيض إذا كانت إبرة يقع بدقة في وسط الآفة.
- باستخدام التدريع المناسب، وجمع الخلايا في 2 مل حقنة (لور قفل، للتقليل من مخاطر تلوث خارجي وغطاء حقنة محمية الرصاص) باستخدام 20 G الإبرة. تجاهل الإبرة والحرص على عدم فقدان أي سائل. الآن نعلق المحقنة مع الخلايا المسمى على الإبرة الموجودة مسبقا في الوتر.
- وضع مسبار الموجات فوق الصوتية تحت الإبرة بحيث المسالك الإبرة في النسيج واضحة للعيان. حقن الخلايا بخطى بطيئة ولكنها ثابتة في الآفة. ضمان عدم وجود مقاومة لحقن. إذا واجهت هذهبعناية موضع الإبرة تحت توجيه الموجات فوق الصوتية. تأكد من أن إخراج السوائل داخل الآفة مرئيا على صورة الموجات فوق الصوتية كسائل كاتمة للصدى تحتوي على فقاعات الهواء hyperechogenic.
- سحب الإبرة ووضع على الفور الضغط على ثقب إبرة لمنع فقدان حقن الخلايا وتقليل انتشار النظير على السطح الخارجي للأطرافهم. اللباس فورا أطرافهم مع طبقة واحدة من ضمادة autoadhesive. الحصان هو الآن على استعداد لجاما مضان. تنفيذ هذه على الفور.
ملاحظة: بعد حقن الخلايا في وتر، والحصول على عدد من حقنة فارغة وإبرة لتقييم الخسائر المباشرة ممكنة من الخلايا التي قد تبقى في المحقنة.
- نضح الإقليمي للخلايا TC-99m-HMPAO المسمى
- اتبع الخطوة 2.4.
- تطبيق 100 ملم وقف النزف المطاط ضمادة على سنع الداني مع اثنين من 100 ملم القطن لفة ضمادة الشاش وضعه بشكل إعلامي وأفقيا.
- جو معقم و مطهر إعداد عشرالبريد الجلد فوق الوريد الرقمي الراحي الوحشي على مستوى الجانبي القريب السمسمية العظام عن طريق تنقية المنطقة مع الكلورهيكسيدين الحل فرك الجراحية لمدة 5 دقائق على الأقل، وأخيرا مع الشاش غارقة في الكحول. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة بطريقة العقيم.
- إعداد 100 مم مع مجموعة 21 G س ¾ "(0.8 * 19 مم) فراشة إبرة بزل الوريد للتمديد عن طريق ملء مع محلول ملحي heparinized ثم إدخال الإبرة في الوريد الجانبي الرقمي الراحي. وبمجرد أن يتم إدخال الوريد الدم ملء جزء من مجموعة التمديد. وفي الموصل قفل لور إرفاق قفل الغطاء المطاطي لور لتسهيل الحقن لاحق من الخلايا المسمى.
- تمييع اللجان الدائمة في 19 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق جمع الخلايا في حقنة 20 مل مسبقة مع برنامج تلفزيوني. تطبيق الخلايا عن طريق الكأس المطاط باستخدام 18 G (1.2 × 40 ملم) إبرة تحت الجلد بمعدل بطيء ولكنه ثابت (30 - 40 ثانية). تدفق القسطرة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مسبقة في سيرينجه.
- إزالة الإبرة وعلى الفور الضغط على الجلد فوق حفرة إبرة بطبقة من خمسة 4 × 4 الشاش والقطن. ثم ضع ضمادة خفيفة بمادة لاصقة مرنة فوق المنطقة القريبة السمسمية وترك وقف النزف في مكان لمدة 30 دقيقة بعد الحقن.
- الافراج عن وقف النزف بعد 30 دقيقة. الحصان هو الآن على استعداد لجاما مضان.
ملاحظة: بعد حقن الخلايا، والحصول على عدد من حقنة فارغة وإبرة لتقييم الخسائر المباشرة ممكنة من الخلايا التي قد تبقى في المحقنة.
5. مضان غاما
- الصور مضان
- الحصول على صور مستو مضان مع كاميرا غاما (وضعت في 140 كيلو الذروة الكهروضوئية باستخدام إطار متناظرة 20٪) مجهزة الطاقة المنخفضة، وبالتوازي مع ثقب الموازاة.
- الحصول على جميع الصور بعد الوقت 0 على الخيول مخدرا كما في الخطوة 2.2 يقف. بعد الوقت 0 scintigram، استبدال ضمادة خفيفة على سي غرسالشركة المصرية للاتصالات مع ضمادة مبطن. إزالة هذه الضمادات قبل كل امتحان مضان.
- الحصول على صور ثابتة لمدة 60 ثانية لكل (256 256 المصفوفة) باستخدام برامج معالجة مع "اكتساب" - "اختيار الدراسة" - "العظام ثابتة" الخيارات. ومن الضروري أن الحصان لا يتحرك أثناء فترة الحصول على الصور لأن الخيار وضع ثابت لايوجد وحدة لتصحيح الحركة.
- للحقن داخل الآفة، الحصول على الصور الجانبية من منطقة الآفة من رسغ إلى أقصى الطرف القاصي، ومنطقة ما يعادل من الطرف المقابل، مجال الرئة اليسرى والغدة الدرقية نقاط. خلال اقتناء الأمامية الصور، ضع شاشة الرصاص بين أرجل لتجنب التصوير من جانب المقابل أطرافهم. الحصول على صور في 5 دقائق بعد الحقن (الوقت 0)، ثم في 1 و 3 و 6 و 12 و 24 و 36 و 48 ساعة.
- لنضح الإقليمي، الحصول على صور جاما الجانبية والظهرية كما ل5.1.1.3. الحصول على صور 5 دقائق بالعربيةثالثا الافراج عن وقف النزف. هذا وسوف يكون الوقت قد حان 0. يمكن أن تكون مفيدة لصورة أطرافه مباشرة بعد حقن الخلايا لتقييم التهم السابقة لوقف النزف الإصدار. الحصول على صور أشعة غاما في 1، 3، 6، 12، 24، 36 و 48 ساعة بعد تناوله للخلايا.
- بعد أن تم الحصول على الصور، معالجة الصور يدويا باستخدام "معالجة" خيار البرنامج مع الخيارات المحددة ل "سوكولوف" لون و"المقلوب" اللون. التالي حدد "المنطقة ذات الاهتمام" (ROI) و "القطع الناقص" لأن هذا يتيح إعادة تشكيل قناع الاختيار والتنقل فوق منطقة الآفة. الحصول على التهم على العائد على الاستثمار عن طريق اختيار "إضافة إلى إحصاءات" الخيار. تأكد من أن مناطق الحجم مماثل من الاهتمام (ROI) يتم تسجيلها لكل حيوان في مختلف نقاط الوقت.
- المقبل، تصحيح التهم لتسوس المتوقعة للتكنيتيوم في كل نقطة زمنية. استخدام المعادلة التالية لتصحيح لتسوس:A = A س ه - (0.693t / T 1/2)، حيث A س هو النشاط الأول من النظائر، A هو تصحيح اضمحلال النشاط الإشعاعي في وقت الصفر، تي هو الوقت المنقضي وT 1/2 هو النصف -life من النظائر. ثم أعرب عن التهم تصحيح في كل نقطة زمنية كنسبة مئوية من العائد على الاستثمار في وقت و0 للعمل على النسبة المئوية للخلايا المتبقية، وذلك باستخدام الصيغة التالية:
- الحصول على صور مستو مضان مع كاميرا غاما (وضعت في 140 كيلو الذروة الكهروضوئية باستخدام إطار متناظرة 20٪) مجهزة الطاقة المنخفضة، وبالتوازي مع ثقب الموازاة.
خلايا٪ المتبقية (ر) = 100 - {[(تسوس توقع (ر) - تسوس (ر)) / توقع تسوس (ر)]} × 100
تسوس (ر) = العائد على الاستثمار (ر) / العائد على الاستثمار (0) × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TC-99m-HMPAO إدماجها BMMSs لا يؤثر سلبيا على قدرتهم على التمسك البلاستيك زراعة الأنسجة وعلى الرغم من أنها تظهر القدرة على الانتشار لتشكيل الطبقات الوحيدة (الشكل 1) لدينا لم يحدد تماما ما إذا كانت معدلات انتشار أو الظواهر الخلوية الأخرى تتأثر. مورفولوجيا يشبه خلايا غير المسماة مع شكل مغزل نموذجي. كفاءة العلامات الخلوية (أي.، الإقبال على التسمية) يختلف عادة من نحو 1.5٪ إلى 25٪. ويتعلق السبب الرئيسي لانخفاض كفاءة وضع العلامات على التأخير في تسليم 99m ح إلى العيادة من موقع حيث تم مزال المولد مو-99 / TC-99m. التأخير لأكثر من 2 ساعة تؤدي إلى انخفاض كبير في وضع العلامات من الخلايا. ومع ذلك، يتم إدراج النظائر الكافي في الخلايا لأداء جاما مضان لمدة تصل إلى 36 ساعة (الشكل 2). وفيما يلي تفصيل العوامل التي يمكن أن تحسن كفاءة وضع العلامات في المناقشة.
ق ق = "jove_content"> والخلايا المسمى يمكن زرعها إما عن طريق زرع داخل الآفة 1 (مباشرة إلى آفة) أو عن طريق نضح الإقليمي عن طريق الوريد رقمي 1 أو الشريان 12. زرع داخل الآفة هو ممكن عندما كانت الإصابة في جوهر وتر ومحاطة سليمة الأنسجة وتر التي تعمل بمثابة وعاء للخلايا. نضح الإقليمي هو الطريق الأسهل لإدارة الخلايا حيث يتم حقنها داخل الأوعية الدموية ولكن يعتمد الأسلوب على التوقع بأن اللجان الدائمة هي قادرة على "في المنزل" لالآفة وتر. هناك أدلة محدودة على أن اللجان الدائمة يمكن على وجه التحديد منزل في مواقع الآفات وتر ولكن يوفر هذا الأسلوب المنهج التجريبي مفيد لتطوير التطبيقات التي قد تزيد من قدرة صاروخ موجه من اللجان الدائمة.
مع الطريق تسليم داخل الآفة، سيتبين الخلايا كمنطقة محورية للإشارة التي لا تزال المترجمة نسبيا مع مرور الوقت أي.، هناك الصورة محدودةpread أو هجرة الخلايا في الأنسجة المحيطة وتر. في المقابل، سيكون هناك تخفيض تدريجي للإشارة مع مرور الوقت في موقع الحقن عند إعطاء الخلايا عن طريق نضح الإقليمي عن طريق الوريد الراحي الرقمي (الشكل 2). ومن الشائع مع حقن داخل الآفة للحقول الرئة لتكون سلبية ولكن في بعض الحالات عند نقاط الوقت مبكر جدا من الرئة قد تظهر إشارة النظائر التي يمكن أن تكون الوصل ومن ثم يصبح أكثر المعمم (الشكل 3). تبقى الغدة الدرقية السلبية مع هذا الطريق الإدارة. نضح الإقليمي وبالمثل يمكن أن تظهر إشارة تنسيق في الرئتين والتي تصبح بعد ذلك أكثر انتشارا ولكن الإشارة بشكل ملحوظ أكثر كثافة مقارنة مع تلك التي لوحظت مع الطريق داخل الآفة. يمكن الغدة الدرقية غالبا ما تظهر أيضا إشارة التنسيق.
عدد النظائر المشعة الكلي الأولي للخلايا (الوقت 0، قبل الحقن) والتهم من scintigram جاما الأولية في المنطقة ذات الاهتمام (الوقت 0، بعد طوأشار njection) والمستخدمة في حساب نسبة انخفاض في التهم في كل نقطة زمنية. يستخدم لمقارنة لتسوس المتوقعة للTC-99m من التهم الأولية (الشكل 4). فإن منحنى المحسوبة تتبع منحنى المتوقعة. ومع ذلك، بعد أخذ تسوس توقع في الاعتبار، واستمرار الخلايا المتبقية في موقع الحقن بعد تناوله داخل الآفة حوالي 32٪ (في 12 ساعة) و 24٪ (في 24 ساعة) (الشكل 4).
الشكل 1. وصفها الخليوي، حقن ومضان غاما (A) نقل BMMSC إلى microfuge قبل وضع العلامات مع TC-99m-HMPAO وراء مبطنة الرصاص التدريع (الشاشة وحامل حقنة) ورصد الإشعاع وmicrocentrifuge ل؛ (B) قسامة من TC-99m-HMPAO الخلايا المسمى المصنف في زراعة الأنسجة تظهر طبق متر جيدةorphology، والسلامة والانتشار. (C) حقن خلايا TC-99m-HMPAO المسمى تحت توجيه الموجات فوق الصوتية الى مكان الاصابه حق forelimb SDFT. (D) مضان غاما من forelimb. كاميرا جاما يتم وضع بدقة باستخدام ذراع الهيدروليكي المناورة وأي احتمال يتم استبعاد الخلايا في الطرف المقابل من قبل درع الرصاص الذي دار بين الساقين المسمى. يتم وضع كاميرا جاما بالمثل في الصدر لمراقبة المجال الرئة أو في الرقبة لمراقبة المجال الغدة الدرقية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الموجات فوق الصوتية وغاما Scintigrams من SDFT. ultrasonographs نموذجي من forelimb في المنطقة منتصف المشط في (A ز>) المقطع الطولي و(B) المقطع العرضي. ويعتبر آفة في SDFT بوضوح كمجال ناقص الصدى (نحو الجزء العلوي من المسح الضوئي) مقارنة لم يصب (العادية) سلامة الأنسجة في وتر العضلة القابضة عميق الرقمي (DDFT) المجاور لوتحت SDFT. وصفت مجال الآفة والمواقع النسبية للالأوتار في التخطيطي أدناه. scintigraphs جاما أجريت في 3 و 6 و 12 ساعة بعد الحقن الخلايا رديولبلد تظهر لحقن الخلايا (C) في الآفة أو (D) من خلال نضح الإقليمي عن طريق الحقن الوريدي عبر الوريد الراحي الرقمي. في حالة معروضة، وكان هناك امتصاص الخلايا رديولبلد في موقع الآفة في SDFT (السهام الصلبة). يرمز استمرار امتصاص الوريد الرقمي الراحي بواسطة السهم متقطع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
EP-together.within صفحة = "1"> 
ويبين الشكل 3. Scintigrams غاما من الرئة والغدة الدرقية. بالاشعة النموذجية من نقطة زمنية مبكرة لكلا حقن داخل الآفة ونضح الإقليمي من الخلايا المسمى. لاحظ الوصل وإشارة منتشر في مجالات الرئة والغدة الدرقية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. تسوس من النشاط الإشعاعي المسجلة من المناطق ذات الاهتمام بعد حقن داخل الآفة. وفي هذا الحصان، تم قياس التهم من scintigrams جاما من SDFT أكثر من 36 ساعة بعد الحقن في الآفة. اللوحة اليسرى: تم حساب النشاط الإشعاعي في كل نقطة زمنية مقابل قيمة الوقت 0. ثميظهر تسوس atural في النشاط الإشعاعي من 99m ح للمقارنة. اللوحة اليمنى: النسبة التقديرية من الخلايا المتبقية. ويحسب هذا من مستوى النشاط الإشعاعي من المناطق المثيرة للاهتمام. في هذه الحالة كانت النسبة الباقية من الخلايا في 24 ساعة حوالي 24٪. وقد أجرينا هذا البروتوكول (وسم MSC والزرع) في 21 الخيول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بالإضافة إلى نخاع العظام، والخلايا الجذعية المعزولة من مصادر مثل الأنسجة الدهنية هي مناسبة لوصفها مع هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، الخلايا من حالة تجمد يمكن إحياء وتوسيع في الثقافة إلى الأرقام المطلوبة للدراسات وسم 12.
العامل الحاسم الذي يحدد كفاءة وصفها BMMSC هي المرة بين شطف من TC-99m من مولد الموليبدينوم في صيدلة المشعات، وإعداد TC-99m-HMPAO واستخدام مواد الاشعاعية في العيادة. هناك علاقة عكسية بين الكفاءة ووضع العلامات ومرة بعد TC-99m شطف من المولد مثل أن التأخير إلى ما بعد هذه الفترة يمكن أن يضعف بشكل كبير من كفاءة وسم الخلية. لذلك، لا بد من تنسيق وثيق بين تسليم الخلايا من المختبر وتسليم TC-99m إلى العيادة في اليوم أن الخلايا ستكون رديولبلد وزرع. الوقت النقل إلى كلينيلذا ج هو عامل مهم. ورقة بيانات المورد تحدد أن اضمحلال TC-99m يقلل من نقاء الإشعاعية بعد 2 ساعة بعد شطف التي يمكن أن تتداخل مع الربط من HMPAO إلى TC-99m، وبعد ذلك مبلغ TC-99m-HMPAO اتخاذها من قبل الخلايا. وقد لاحظنا أيضا أن وضع العلامات من الخلايا المستزرعة في بيئة معملية أعطى الوسم أكثر كفاءة مما كانت عليه في العيادة. وقد ذكرت هذا أيضا دراسة أخرى في الخيول 5 حيث وصفت الخلايا في بيئة معملية. بالإضافة إلى ذلك، في تجربتنا، ويتم أخذ التسمية حتى أكثر كفاءة من خلال الخلايا التي وصفت مباشرة بعد إعداد عينات من الدم أو الأنسجة مقارنة مع خلايا المعدة من الثقافة. ولكن، حتى مع انخفاض كفاءة الوسم هناك علامة كافية بد أن الخلايا لأداء مضان أكثر من 36 ساعة.
ويمكن تحقيق 80٪ لكريات الدم البيضاء إذا تم استخدام TC-99m من - الكفاءة وسم 40٪شطافة مولد جديدة خلال 30 دقيقة وردود الفعل التي أجريت في حجم صغير (1-0،5 مل) 18. وقد تم تحقيق 71٪ عن الخيول اللجان الدائمة 19 مما يدل على أنه من الممكن لزيادة كفاءة وسم اللجان الدائمة في ظل ظروف مثالية - الكفاءة وصفها من 47٪.
نحن زرع روتيني 20 مليون خلايا لعلاج الآفات الأساسية SDFT على الرغم من أن ما يصل إلى 40 مليون خلية تم زرعها لأكبر الآفات. يمكن زرع عدد مماثل من الخلايا عن طريق نضح الإقليمي على الرغم من أن هذه الطريقة لا تستخدم عادة بسبب إجراءات أكثر تعقيدا. ومع ذلك، قد يكون من المفيد للآفات التي تمتد إلى المحيط من سطح وتر مع توقع أن خلايا كافية المنزل إلى الآفة. يمكن تتبع الخلايا التي جاما مضان تقديم معلومات مفيدة عن حركة الخلايا بطرق مختلفة يديرها. في هذا البروتوكول، والخلايا المزروعة بالطريق داخل الآفة هي mostlذ الاحتفاظ في موقع الحقن بالطريق داخل الآفة. ويمكن ملاحظة إشارة النظائر المشعة في المجالات الرئة في بعض الحالات ولكن يبدو بشكل عام أن هناك هجرة صغيرة من الخلايا بعيدا عن موقع الآفة. تسليم BMMSC التي نضح الإقليمي يوحي أنه قد يكون هناك الإبقاء على الخلايا في موقع الإصابة، ولكن عندما ألقاه الحقن في الوريد 4 نحن لم يلاحظ صاروخ موجه من الخلايا. التسمية TC-99m-HMPAO لا يؤثر على قدرة خلايا الهجرة 20، وكما هو المنضوية في TC-99m-HMPAO من قبل الخلايا والاحتفاظ بها في السيتوبلازم، فمن غير المحتمل أن تتداخل مع خصائص التصاق.
حساب إشارة من المناطق ذات الاهتمام قد تكون أقل من الواقع كما أنه من الممكن أن أنه قد يكون هناك تفكك كبير من التسمية من الخلايا (أفرج عنه من الخلايا الميتة أو آليات أخرى للإفراج عنهم من الخلايا الحية). الغدة الدرقية تلتقط النظائر مجانا (TC-99m) صدر من الخلايا الميتة أو التي تحتضر، وTC-99M-HMPAO يمكن القضاء عليها عن طريق الكلى والأمعاء. ويمكن رصد هذه الأنسجة عن طريق جاما مضان لتقييم الخسائر المحتملة من التسمية.
يمكن تكييفها الإجراء وضع العلامات خلية لاختبار الاحتفاظ الخلية وامتصاص في مواقع مختلفة (الأجهزة واصابة) باستخدام طرق مختلفة للإنجاز. طبيعة التنسيق للإشارة في الرئتين قد يكون مؤشرا على المجاميع الخلية التي كسر يفترض أن يصل مع مرور الوقت أو أدخل تحلل الخلية. الغدة الدرقية، الذي يجسد النظائر مجانا، ويظهر يفترض زيادة في امتصاص التالية نضح الإقليمي لحقن الخلايا وما ينتج عنها من الحطام من الخلايا الميتة لها طريقا للوصول إلى الغدة الدرقية عن طريق الدورة الدموية. على الرغم من أن 24٪ فقط من خلايا تظل بعد 24 ساعة، والطريق داخل الآفة في وتر هو الطريق تسليم الأكثر فعالية حيث أظهرت معظم الحالات لا المجانية TC-99m في الغدة الدرقية. المعلومات المكتسبة من استخدام هذه البروتوكولات يمكن أن تبلغ تصميم وتطوير المستقبلي لتطبيقات الخلايا الجذعية لموإعادة العلاجات السريرية فعالية.
تم تعديل بروتوكول وضع العلامات خلية للاستخدام في الحصان من العلامات TC-99m-HMPAO من الكريات البيض في التطبيقات الطبية الإنسان. استخدامه في هذا البروتوكول يوضح تطبيق في الحيوانات الكبيرة التي يحدث المرض وتر تلقائيا للتحقيق في العلاجات القائمة على الخلية. توظيف من الحالات السريرية يمكن أن تساعد في تعويض ارتفاع التكاليف المرتبطة بالعمل مع حيوان أكبر. وقد وصفت الإجراء وضع العلامات لاستخدامها كعامل طريقة التصوير في النماذج الحيوانية الصغيرة 21 ونحن نعتقد أن البروتوكول يمكن بالمثل استخدامها في الحيوانات الكبيرة مثل الغنم لتحقيقات من الأمراض وتر الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, Suppl S23. 23-26 (1997).
- O'Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
