Abstract
Recentes avanços na aplicação de células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSC) para o tratamento de lesões de tendões e ligamentos no cavalo sugerem melhorou medidas de resultados em ambos os estudos experimentais e clínicos. Embora o BMMSC está implantado no interior da lesão do tendão em grandes números (geralmente 10 - 20 milhões de células), apenas um número relativamente pequeno sobrevivência (<10%), embora estes podem persistir por até 5 meses após a implantação. Esta parece ser uma observação comum em outras espécies onde BMMSC foram implantados em outros tecidos e é importante para entender quando ocorre esta perda, quantas sobreviver ao processo de implantação inicial e se as células são apagadas em outros órgãos. Acompanhando o destino das células pode ser conseguida por radiomarcação do BMMSC antes da implantação que permite não invasiva in vivo de imagens de localização da célula e a quantificação do número de células.
Este protocolo descreve uma célula labeling procedimento que usa Tecnécio-99m (Tc-99m), e acompanhamento destas células após a implantação em tendões flexores de feridos em cavalos. Tc-99m é uma (t 1/2 de 6,01 h) do isótopo de vida curta que emite raios gama e podem ser internalizados pelas células na presença do composto lipofílico hexametilpropilenoamina oxima (HMPAO). Essas propriedades tornam ideal para uso em clínicas de medicina nuclear para o diagnóstico de muitas doenças diferentes. O destino das células marcadas podem ser seguidas no curto prazo (até 36 horas) por cintigrafia gama para quantificar tanto o número de células retidos na lesão e distribuição das células nos pulmões, tireóide e outros órgãos. Esta técnica é uma adaptação da rotulagem dos leucócitos do sangue e pode ser utilizado para imagem BMMSC implantado em outros órgãos.
Introduction
Estratégias regenerativos para a reparação dos tecidos doentes ou danificados são baseados em células estaminais multipotentes derivadas de uma variedade de tecidos e implantados na área afectada. Os recentes avanços na aplicação das autólogo BMMSC para o tratamento do tendão e lesões ligamentares no cavalo têm mostrado melhorar as medidas de resultado, tanto experimental 1-5 e estudos clínicos 6. O cavalo é um modelo particularmente atraente para avaliar a eficácia de células-tronco tratamentos relacionados porque ele sofre de idade e overstrain lesões relacionadas com os tendões do membro anterior distal, é um animal atlético, e é uma facilitando a recuperação grande, medula óssea e implantação precisa. Lesões do tendão de curar naturalmente com fibrose mas o tendão curado é funcionalmente inferior 7 e tem um alto risco de nova lesão 8. O tendão flexor digital superficial (TFDS) é mais comumente afetados como tem evoluído a agir como uma energia elásticaloja e experiências de alta carga salienta a alcançar eficiência energética e locomoção de alta velocidade. Restaurar a função após a lesão é, portanto, fundamental. Estas lesões são semelhantes às que ocorrem no tendão de Aquiles em seres humanos, que desempenha uma função semelhante 9. Não existem opções boas de tratamento para tratar ou alcançar bom estado de conservação para essas lesões, as estratégias regenerativas, portanto, com base nas células oferecem uma oportunidade atraente para melhorar os resultados e reduzir a re-ferimento.
Na maioria dos estudos de 5 - 20 milhões de BMMSC autólogo são injectados directamente na lesão, que normalmente ocorrem no interior do núcleo do corpo que, por conseguinte, tendão actua como um receptáculo para as células. O destino das células injetadas uma vez não é métodos claros e diferentes de rotulagem celular para rastrear as células foram descritos recentemente. As células marcadas com um marcador de fluorescência foram mostrados para sobreviver apenas em quantidades relativamente pequenas (<10%) 10,11. Etiquetas de fluorescência exigirextracção de tecidos e para análise histológica de corte, que é moroso e não prontamente facilitar a análise temporal em um modelo animal grande ou nos casos clínicos. Em trabalhos mais recentes que temos usado o radioisótopo 99m Tc para rotular células e seguir seu destino por cintigrafia gama 1. Este método permite comparações rápidas para ser feita entre diferentes vias de administração de células, incluindo por via intravenosa, intralesional através da veia jugular 1 ou perfusão regional via intra-arterial ou intravenosa, 12 1,12 injecções. A persistência e distribuição de células podem então ser trabalhada por cintigrafia gama de vários órgãos. Isto demonstrou que apenas 24% das células injectadas intralesionalmente permaneceu na lesão por 1 h 24 e este é suportado por um outro estudo usando lesões criados experimentalmente e usando o mesmo marcador radioactivo 5. Além disso, as células apresentam capacidade limitada para casa em lesões tendíneas quando delivered por perfusão regional ou por via intravenosa, mas são dispersos nos pulmões pelas últimas vias 4.
BMMSC marcadas com nanopartículas de ferro é um método alternativo para controlar células implantadas em tendões 13 membros anteriores. Embora as células marcadas de nanopartículas de ferro permitir o rastreamento de células in vivo por ressonância magnética, os estudos temporais em um animal de grande porte são limitados pelo número de vezes que a anestesia pode ser administrada em cada ponto de tempo para realizar as imagens de ressonância magnética. Além disso, as nanopartículas de ferro são hipointensa em MRI que limita a informação sobre a migração de células marcadas no corpo do tendão. Outros isótopos radioactivos que podem ser utilizados incluem Índio-111, mas esta tem a desvantagem de uma meia-vida mais longa do que o Tc-99m (2,8 dias vs 6,0 h) e uma energia mais elevada de emissão de raios gama. Além disso, a viabilidade celular foi relatado para ser reduzida quando marcados com índio-111 14. Tc-99m, por outro lado, é rotineiramente utilizada em ambos nuclear equina e humanamedicina para rotular células mononucleares do sangue periférico e siga sua distribuição in vivo pela cintilografia. Ele pode ser relativamente facilmente absorvidos pelas células utilizando HMPAO como uma molécula de ligação para ligar o tecnécio, como Tc-99m-HMPAO, às células. Tc-99m-HMPAO marcado BMMSC mostrar boa viabilidade e podem proliferar in vitro 4. Este protocolo detalha a rotulagem e rastreamento de BMMSC autólogo eqüino implantados em lesões que ocorrem naturalmente no TFDS membro anterior.
É importante notar que o protocolo destina-se apenas a ser utilizado como uma ferramenta de pesquisa. A sua utilização como uma modalidade terapêutica clínica não é recomendada como o efeito do marcador radioactivo no fenótipo celular não foi totalmente elucidado.
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Protocol
Os casos aqui descritos foram realizados seguinte permissão de Ética concedidas pelo Comité de animal Ética e Bem-Estar da Colegio de Veterinarios de Málaga, em Espanha, e do Royal Veterinary College, North Mymms, Reino Unido Os procedimentos utilizados nos cavalos são baseados em protocolos aprovados que são utilizado na clínica em cavalos que recebem terapias baseadas células-tronco que inclui sedação, aspiração de medula óssea, a injeção intra-tendinosa, perfusão regional, injecção intravenosa, pós-tratamento processual e dor gestão e monitorização após a implantação.
1. As modalidades-chave a ser feitas com antecedência
- Procure ética institucionais e bem-estar dos animais aprovação e aderir aos requisitos legais locais antes de iniciar o trabalho.
- Buscar a aprovação institucional para trabalhar com radiação ionizante, como ditado pelos regulamentos locais e legais, incluindo o nível adequado de protecção do pessoal e do ambiente e à eliminação dos CONTAMnados resíduos.
- Utilize os seguintes critérios de inclusão: cavalos presentes com uma lesão overstrain não traumática (tendinopatia ou desmopathy) para o tendão flexor digital superficial do membro torácico e lesões resultantes de um defeito dentro do tendão eo defeito é cercado por tendão e / ou paratenon intacta .
Nota: O exame e diagnóstico para tais lesões ea preparação clínica dos cavalos para implante de células foi detalhado em outros lugares 6,15.
Nota: O isolamento e expansão em cultura de BMMSC derivada da medula óssea de cavalos tem sido descrito anteriormente 6,16. O protocolo atual para injetar BMMSC para lesões TFDS no cavalo usa 10 milhões de células por ml de sobrenadante 4 autólogo de medula óssea (BMS) 16. - Use células que sofreram não mais de 4 passagens para implantação in vivo, para evitar potenciais fenótipo celular ou alterações genéticas associadas com o número elevado passagem cells.
- Entregar o número necessário de células do BMS (dentro de 24 horas numa caixa fria a 4 - 8 ° C) para a clínica veterinária, onde o implante de células é para ser realizado.
Nota: O uso clínico de células-tronco mesenquimais em sobrenadante de medula óssea é um processo patenteado de propriedade de ReCellerate Inc (EUA) e sua utilização pode exigir autorização.
Nota: Tc-99m é um emissor gama (140 KeV), com uma meia-vida relativamente curta (6,0058 h, por conseguinte, cerca de 94% de ele decai para a sua forma estável de 99 Tc em 24 horas). A energia gamma o torna adequado para a detecção através de câmaras gama (cintilografia) e os resultados a curto meia-vida em tempo muito limitado exposição à radiação para o cavalo eo pessoal de manipulação animal. Este protocolo descreve a rotulagem no local de células usando Tc-99m-HMPAO [HMPAO marcado com Tc-99m (como pertecnetato de sódio)]. - Ordenar a Tc-99m fresco do fornecedor de tal forma que é entregue e usado para rotular a sagacidade célulashin 2 horas de eluição a partir do gerador de Tc-99m. Assegurar que o Tc-99m é fornecido como 1 GBq em (tampão padrão do fornecedor) a 1 ml de solução.
- Use todos os buffers em RT. Realizar o processo de rotulagem, a implantação das células e imagiologia (cintigrafia gama) em um quarto de contenção isótopo com todo o equipamento limpa com álcool limpa antes do início do trabalho.
2. Preparação do Cavalo e ultra-sonografia do membro anterior Tendão
- Varreduras ficha de ultra-som na primeira admissão de lesão (quando é aspirado de medula óssea) e, em seguida, no ponto de tempo quando as células marcadas radioactivamente são injectados.
- Execute ultra-sonografia e implante de células com o cavalo carrega o peso uniformemente em uma tenda e sob sedação pé (ao invés de anestesia geral). Administrar sedação utilizando uma mistura de HCl a detomidina e tartarato de butorfanol, cada um na concentração de 0,01 para 0,02 mg / kg IV.
Nota: A recuperação é rápida e pós-cirúrgico não requer nenhum tratamentoconsiderações especiais. - Após anestesia perineural é aplicada (passo 2.6) no membro afectado, manter o cavalo na estação sob sedação para reduzir o movimento do cavalo durante o tratamento. Verifique visualmente o nível adequado de sedação julgados a partir da posição de cabeça baixa eo comportamento do cavalo e que o cavalo é confortável durante a injeção de células e os movimentos da câmara gama durante a aquisição das imagens cintilográficas.
Nota: Não é necessário aplicar a pomada veterinário em olhos (para evitar a secura) porque sob sedação piscar não é afectado e o cavalo é capaz de manter a hidratação dos olhos. O acompanhamento após a implantação das células é não-invasiva (ultra-som e cintigrafia gama). - Clipe de perto o cabelo que cobre o tendão (com cortar cabelo cavalo), em seguida, limpar a área cortada usando uma combinação de um matagal cirúrgica clorexidina e finalmente álcool.
- Aplique o gel de acoplamento acústico para a área emetodicamente varredura para gravar scans da região palmar metacarpo completo, níveis rotulados sequencialmente 1 - 7 17, com um transdutor linear (12 MHz ou similar) para obter série transversal on-incidência e imagens longitudinais. Armazenar as imagens digitalmente de modo a que a área de secção transversal e a zona de lesão máxima 4 pode ser obtida com o auxílio do software de análise de imagem.
- Preparar a área que se sobrepõe à nervos palmares imediatamente distal ao carpo por injecção asséptica de anestésico local para assegurar a dessensibilização completa da pele que recobre o tendão e o tendão flexor digital superficial. Injectar 2 ml de mepivicaine tanto por via subcutânea e adjacentes aos nervos palmares (na sua localização sub-fascial) entre os tendões flexores e o ligamento suspensor imediatamente distai ao carpo em ambos os lados do membro.
- Quando a verificação preliminar foi realizada preparar o local de implantação por esfregar a área com clorexidina s cirúrgicossolução crub por pelo menos 5 minutos e finalmente álcool com gaze embebida. Execute todas as etapas subsequentes de forma asséptica.
3. Tc-99m-rotulagem de Equine Células-Tronco Mesenquimais
Nota: As etapas de rotulagem de células pode ser realizada durante a ultrassonografia do membro anterior como isso vai minimizar o decaimento do isótopo entre marcação celular e implantação de células marcadas no tendão.
- Remova a BMS a partir das células, uma vez que interfere com a absorção de isótopos. Para fazer isso, recuperar o frasco de BMMSC (10 milhões de células em 1 ml de BMS) da caixa de frio e sedimentar as células numa microcentrífuga a 350 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante cuidadosamente com uma agulha de 18G ou 19G (ligada a uma seringa de 2 ml), deixando uma pequena gota (≤0.1 ml) no tubo para ajudar a ressuspensão célula. Guardar o sobrenadante (BMS) num tubo de microcentrífuga estéril e manter em gelo para reutilização posterior.
- Ressuspender as células em a gota residual do sobrenadante por FLIcking o tubo suavemente com os dedos (ao invés de vórtice) e deixar o tubo num suporte à temperatura ambiente. Assegurar que as células são completamente ressuspenso e que não existem aglomerados de células visíveis.
- Prepara-se o Tc-99m como se segue. Transferir 1 ml de pertecnetato de tecnécio para um frasco de HMPAO utilizando uma seringa de 1 ml e agulha. Misture delicadamente mas completamente e deixe por 5 minutos atrás chumbo blindagem. Nota: Esta etapa pode ser feito enquanto as células estão girando no passo 2.1.
- Adicionar toda a mistura Tc-99m-HMPAO utilizando uma seringa de 1 ml e agulha para as células e misturar suavemente. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente por trás protecção de chumbo.
- Para os passos seguintes, utilizar uma pinça (ou um pedaço de papel de tecido) para abrir a tampa do tubo de microcentrífuga para minimizar a contaminação isotópica do polegar (enluvada) e subsequentemente outro equipamento. Use uma seringa de 2 ml e 21 G agulha para adicionar ou remover o tampão de lavagem.
Nota: O uso de um monitor de campo isótopo é estimulado para monitorar a contaminação das superfícies e equipamentos. Adicionar 1 mL de PBS à mistura-99m-HMPAO-célula Tc, fechar a tampa, agitar suavemente e centrifugação para sedimentar as células como no passo 3.1. - Retire cuidadosamente o PBS para um novo tubo (salvar esta atrás de blindagem de chumbo e etiqueta como W1). Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS fresco. Centrifugar o tubo e remover o sobrenadante como acima (e salvar este rótulo como W2).
- Calcula-se a eficiência de marcação medindo as contagens em tubos de W1 e W2 e no sedimento celular. Fazer isso colocando cada tubos em uma dose isótopo instrumento calibrador Bem e gravar a radioactividade em contagens por minuto (CPM). Calcula-se a eficiência de marcação como (A radioactividade como CPM de células) / (A radioactividade das células sobrenadante +) x 100.
- Volte a suspender as células completamente na PBS residual e, em seguida, adicione o BMS salvos a partir do passo 3.1. As células estão prontas para implantação intralesional.
4. Implantação de células Tc-99m-HMPAO-rotulados
- Implantação Intralesionalno tendão sob a orientação de ultra-som
- Lentamente introduzir uma polegada de 1,5 ou 2 (50 mm) de agulha de 20 G para a zona de máxima lesão da lesão numa orientação longitudinal, com o transdutor de ultra-sons, coberto de um campo estéril, em linha com a agulha de modo a que o comprimento da agulha pode ser identificados ultrassonografia e a ponta se a agulha está localizada com precisão no centro da lesão.
- Usando blindagem apropriado, recolher as células em uma seringa de 2 ml (de bloqueio Luer, para minimizar o risco de contaminação externa e uma tampa na seringa de blindagem de chumbo), utilizando uma agulha de 20 G. Deite fora a agulha com cuidado para não perder nenhum fluido. Agora fixar a seringa com as células marcadas para a agulha pré-localizado no tendão.
- Coloque a sonda de ultra-sons sob a agulha de modo que a agulha do aparelho no tecido é claramente visível. Injetar as células em um ritmo lento mas constante na lesão. Assegure-se que não há resistência à injecção. Se este for encontradocuidadosamente reposicionar a agulha sob a orientação de ultra-som. Verifique se o ejetando fluido na lesão é visível a imagem de ultra-som como fluido anecóica contendo bolhas de ar no hiperecogênicas.
- Retirar a agulha e colocar imediatamente a pressão por cima do buraco da agulha para evitar perda de células injectadas e para minimizar a propagação de isótopo através da superfície externa do membro. Vestir imediatamente o membro com uma camada de atadura autoadhesive. O cavalo está pronto para cintigrafia gama. Execute este imediatamente.
Nota: Após a injecção das células no tendão, adquirir uma contagem da seringa vazia e agulha para avaliar a possível perda directa de células que podem permanecer na seringa.
- Perfusão de células Tc-99m-HMPAO-rotulados Regional
- Siga o passo 2.4.
- Aplique uma 100 milímetros torniquete de borracha bandagem no metacarpo proximal com dois 100 milímetros rolo de algodão gaze posicionada medial e lateralmente.
- Assepticamente preparar the a pele sobre a veia digitais palmar lateral ao nível da sesamóides proximais laterais esfregando a área com uma solução de limpeza cirúrgica clorexidina durante pelo menos 5 minutos e, finalmente, com gaze embebida em álcool. Execute todas as etapas subsequentes de forma asséptica.
- Prepara-se uma extensão de 100 mm ajustada com uma 21 G x ¾ "(0,8 x 19 mm) para a agulha de borboleta punção venosa de enchimento com soro fisiológico estéril heparinizado e, em seguida, introduzir a agulha na veia digitais palmar lateral. Uma vez que o sangue da veia é inserido irá preencher parcialmente o conjunto de extensão. Ao conector de bloqueio Luer anexar uma tampa de borracha de bloqueio Luer para facilitar subsequente injecção de células marcadas.
- Diluir as MSCs em 19 ml de PBS, recolhendo as células em uma seringa de 20 ml pré-carregado com o PBS. Aplicar as células através da taça de borracha utilizando um 18 g (1,2 x 40 mm) agulha hipodérmica a um ritmo lento mas constante (30 - 40 segundos). Limpar o cateter com 1 ml de PBS, pré-carregado num syringe.
- Remover a agulha e imediatamente aplicar pressão na pele sobre o orifio de agulha com uma camada de cinco 4 x 4 gazes de algodão. Em seguida, colocar uma ligadura elástica da luz com adesivo sobre a área sesamoid proximal e deixar o torniquete no lugar durante 30 minutos após a injecção.
- Solte o torniquete após 30 min. O cavalo está pronto para cintigrafia gama.
Nota: Depois de injetar as células, adquirir uma contagem da seringa vazia e agulha para avaliar possível perda direta de células que podem permanecer na seringa.
5. Gamma Cintilografia
- Imagens cintilografia
- Adquirir imagens planar cintilografia com uma câmara gama (fixado em 140 KeV pico fotoelétrico usando uma janela simétrica 20%), equipado com uma baixa energia, colimador buraco paralelo.
- Obter todas as imagens após o tempo 0 em cavalos sedados como no passo 2.2 em pé. Após o tempo de 0 scintigram, substituir a bandagem luz sobre a implantação site com uma bandagem acolchoada. Remover esta bandagem antes de cada exame de cintilografia.
- Adquirir imagens estáticas durante 60 segundos cada (matriz de 256 por 256), utilizando o software de processamento com a "adquirir" - "seleção do estudo" - opções "ósseos estáticos". É essencial que o cavalo não se mover durante o período de aquisição de imagem, porque a opção de modo estático não tem um módulo para a correcção de movimento.
- Para injecção intralesional, obter imagens laterais da área de lesão do carpo até a extremidade distal, a área equivalente do membro contralateral, o campo pulmão esquerdo eo esquerdo da tireóide. Durante a aquisição de membros dianteiros imagens, posicione a tela de liderança entre as pernas para evitar a formação de imagens do contralateral membro. Adquirir as imagens em 5 min após a injecção (tempo 0), e, em seguida, com 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 h.
- Para perfusão regional, obter imagens gama laterais e dorsal como por 5.1.1.3. Obter imagens 5 min afliberação do torniquete ter. Este será o tempo 0. Pode ser útil para a imagem do membro imediatamente após a injecção das células para avaliar as contagens de libertação antes de torniquete. Obtenção de imagens gama com 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 horas após a administração das células.
- Depois que as imagens tenham sido adquiridos, processar as imagens manualmente usando a opção "transformação" do software com opções selecionadas para cor "Sokoloff" e "Inverter" cor. Em seguida, selecione a "região de interesse" (ROI) e "elipse", pois isso permite reformulação da máscara de seleção e movimento sobre a área da lesão. Obter as contagens sobre o ROI, escolhendo a opção "adicionar as estatísticas". Certifique-se de que as regiões de tamanho idêntico de interesse (ROI) são gravadas para cada animal nos diferentes pontos de tempo.
- Em seguida, as contagens para corrigir o decaimento prevista do tecnécio em cada ponto de tempo. Use a seguinte equação para corrigir a decadência:A = O e - (0.693t / T 1/2), em que A é O a actividade inicial do isótopo, A é o decaimento da radioactividade corrigida no tempo zero, t é o tempo decorrido e o t 1/2 representa a metade -life do isótopo. Em seguida, expressar as contagens corrigidas em cada ponto de tempo como uma percentagem do ROI no tempo 0 para trabalhar a percentagem de células restantes, utilizando a seguinte fórmula:
- Adquirir imagens planar cintilografia com uma câmara gama (fixado em 140 KeV pico fotoelétrico usando uma janela simétrica 20%), equipado com uma baixa energia, colimador buraco paralelo.
% restantes células (t) = 100 - {[(decaimento previsto (T) - de decaimento (t)) / previu decaimento (t)]} x 100
decaimento (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.
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Representative Results
Tc-99m-HMPAO incorporação BMMSs não afeta negativamente a sua capacidade de aderir à cultura de tecidos de plástico e enquanto eles mostram capacidade de proliferação para formar monocamadas (Figura 1) que não tem completamente determinado se as taxas de proliferação ou outros fenótipos celulares são afetados. A sua morfologia é semelhante às células não marcadas com uma forma típica de fuso. A eficiência de marcação celular (isto é., A captação do marcador) tipicamente varia desde cerca de 1,5% a 25%. A principal razão para a baixa eficiência de marcação foi relacionado com o atraso na entrega do 99mTc para a clínica a partir do local onde o gerador de Mo-99 / Tc-99m foi eluída. Atrasos de mais de 2 horas resultar em um grande declínio na rotulagem das células. No entanto, é suficiente isótopo incorporada nas células para realizar cintigrafia gama de até 36 horas (Figura 2). Fatores que podem melhorar a eficiência de marcação são detalhados na discussão.
1 (directamente na lesão) ou por perfusão regional através de um conversor digital 1 veia ou artéria 12. Intralesional implante é possível quando a lesão é no núcleo do tendão e rodeados por tecido do tendão intacto que actua como um receptáculo para as células. Perfusão regional é uma via mais fácil de administrar as células como eles são injectados num vaso sanguíneo, mas o método baseia-se na expectativa de que as MSCs são capazes de "casa-in" para a lesão do tendão. Há uma evidência limitada que MSCs pode especificamente casa em locais de lesões do tendão, mas este método fornece uma abordagem experimental útil para o desenvolvimento de aplicações que podem aumentar a capacidade homing de MSCs.
Com a via de administração intralesional, as células irão ser visto como um sinal de domínio de concentração que permanece relativamente localizada ao longo do tempo isto é., Há s limitadospread ou migração das células para o tecido envolvente do tendão. Em contraste, haverá uma redução gradual de sinal com o tempo no local da injecção quando as células são administradas por perfusão regional através da veia digital palmar (Figura 2). É comum com injecção intralesional para os campos de pulmão a ser negativa, mas, em alguns casos, nos pontos de tempo muito precoces do pulmão pode mostrar sinais de isótopos que podem ser focais e, em seguida, torna-se mais generalizada (Figura 3). A tireóide permanece negativa com esta via de administração. Perfusão regional semelhante pode mostrar sinal focal nos pulmões que então se torna mais difusa mas o sinal é significativamente mais intensos em comparação com a observada com a via intralesional. A tireóide pode muitas vezes também mostram sinal focal.
A contagem de radioisótopo total inicial das células (tempo 0, pré-injecção) e as contagens da cintigrafia gama inicial na região de interesse (tempo 0, pós i-njection) são registadas e utilizadas para calcular a percentagem de decréscimo na contagem em cada ponto de tempo. Isto é usado para comparar com a deterioração prevista do Tc-99m a partir das contagens iniciais (Figura 4). A curva calculada vai seguir a curva prevista. No entanto, depois de tomar o decaimento predito em conta, a persistência de células que permanecem no local da injecção após a administração intralesional é de cerca de 32% (às 12 h) e 24% (às 24 h) (Figura 4).
Figura 1. Rotulagem celular, Injeção e cintigrafia gama (A) Transferência de BMMSC em uma microcentrífuga antes da marcação com Tc-99m-HMPAO trás revestida de chumbo blindagem (tela e suporte de seringa) e monitor de radiação e microcentrifuge.; (B) Uma alíquota de células marcadas com Tc-99m-HMPAO semeadas num prato de cultura de tecidos mostram boa morphology, viabilidade e proliferação; (C) Injeção de células Tc-99m-HMPAO rotulados sob a orientação do ultra-som no local da lesão do TFDS membro anterior direito; (D) Gamma cintilografia do membro anterior. A gama câmara é posicionada precisamente usando um braço hidráulico manobrável e qualquer potencial de células marcadas no membro contralateral são eliminados por um escudo de chumbo realizada entre as pernas. A câmara gama é semelhante posicionado no peito para monitorar o campo pulmonar ou no pescoço para monitorar o campo da tireóide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ultra-som e Gama cintilografias do TFDS. Ultrasonographs típicos do membro anterior na região centro-metacarpo em (A B. A lesão no TFDS é claramente visto como uma área hipoecoica (na direcção do topo da varredura) em comparação com o tecido não lesionado integridade (normal) do tendão flexor digital profundo (DDFT) adjacente e por baixo da TFDS. A área da lesão e as posições relativas dos tendões são ilustrados no esquema abaixo. Scintigraphs Gamma realizada às 3, 6 e 12 h pós-injecção de células radiomarcadas são apresentados para as células injectadas (C) para a lesão ou (D), por perfusão regional intravenosa através da veia digital palmar. No caso mostrado, houve absorção de células radiomarcadas no local da lesão no TFDS (setas a cheio). Persistência da absorção pela veia digitais palmar é indicado pela seta tracejada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Gama cintilografias do pulmão e tireóide. Scans típicos de pontos de tempo iniciais são mostrados para a injeção intralesional e perfusão regional de células marcadas. Observe o sinal focal e difusa em campos pulmonares e da tiróide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Decay de radioactividade Gravado das Regiões de Interesse após injeção intralesional. Neste cavalo, as contagens foram medidos a partir cintilografias gama do TFDS mais de 36 horas após a injeção na lesão. Painel esquerdo: a radioatividade em cada ponto de tempo foi calculada em relação ao valor tempo 0. Depoisatural decaimento da radioactividade do 99mTc é mostrado para comparação. Painel direito: a porcentagem estimada de células restantes. Este é calculado a partir do nível de radioactividade a partir das regiões de interesse. Neste caso, a percentagem restante de células às 24 horas foi de aproximadamente 24%. Efetuamos este protocolo (rotulagem de MSC e implantação) em 21 cavalos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Além de medula óssea, as células estaminais isoladas a partir de fontes tais como o tecido adiposo são adequados para marcação com este protocolo. Além disso, as células de um estado congelado pode ser revivido e expandidas em cultura para os números desejados para estudos de rotulagem 12.
Um factor crítico que determina a eficiência de marcação do BMMSC é o tempo entre a eluição do Tc-99m a partir do gerador de molibdénio no radiopharmacy, Preparação de Tc-99m-HMPAO e uso do radiofármaco na clínica. Existe uma relação inversa entre a eficiência de marcação e tempo após Tc-99m de eluição a partir do gerador de tal modo que os atrasos para além deste período pode prejudicar significativamente a eficiência da marcação celular. Portanto, é necessária uma estreita coordenação entre a entrega das células de laboratório e a entrega do Tc-99m para a clínica no dia em que as células serão radiolabeled e implantado. O tempo de transporte para a clinic é portanto um factor importante. Folha de dados do fornecedor especificar que a deterioração do Tc-99m reduz a pureza da radioquímica após 2 h após a eluição, que pode interferir com a ligação do HMPAO ao Tc-99m e, posteriormente, a quantidade de Tc-99m-HMPAO tomadas pelas células. Observamos também que a rotulagem de células cultivadas em um ambiente de laboratório deu rotulagem mais eficiente do que na clínica. Isso também tem relatado por um outro estudo em cavalos 5, onde as células foram marcadas em um ambiente de laboratório. Além disso, na nossa experiência, a etiqueta é tomado pelas células de forma mais eficiente que são marcados imediatamente após a sua preparação a partir de sangue ou amostras de tecidos em comparação com as células preparadas a partir de cultura. No entanto, mesmo com a baixa eficiência de rotulagem existe suficiente rótulo ligado às células para realizar cintilografia mais de 36 h.
Eficiências de rotulagem de 40% - 80% pode ser conseguido, por leucócitos se o Tc-99m é usado a partir de umfresco eluato gerador dentro de 30 min e a reacção foi realizada num pequeno volume (1 - 0,5 ml) 18. Eficiências de rotulagem de 47% - 71% foram alcançados para o MSC 19 equina demonstrar que é possível aumentar a eficiência de marcação das MSCs em condições ideais.
Rotineiramente implante 20 milhões de células para o tratamento de lesões do núcleo TFDS embora até 40 milhões de células foram implantadas para as lesões maiores. Um número semelhante de células poderiam ser implantadas através de perfusão regional, embora este método não é vulgarmente utilizado por causa do processo mais complexo. No entanto, pode ser útil para as lesões que se estendem para a periferia da superfície de tendão com a expectativa de que células suficientes casa na lesão. Seguimento das células por cintigrafia gama pode fornecer informações úteis sobre o movimento das células administradas por diferentes vias. Neste protocolo, as células implantadas por via intralesional são mostlY retidos no local da injecção por via intralesional. Radioisótopos de sinal podem ser observadas nas áreas pulmonares, em alguns casos, mas verifica-se, em geral, que há pouca migração de células longe do local da lesão. Entrega de BMMSC por perfusão regional sugere que pode haver retenção de células no local da lesão, mas quando entregue por injecção intravenosa 4 não observamos homing das células. A etiqueta de Tc-99m-HMPAO não afecta a capacidade de migração de células 20 e, como o Tc-99m-HMPAO é internalizada pelas células e retido no citoplasma, é pouco provável que interfiram com as propriedades de adesão.
O cálculo do sinal de regiões de interesse pode ser uma subestimativa, uma vez que é possível que possa haver que dissociação significativa da etiqueta a partir de células (libertado a partir de células mortas ou a outros mecanismos de libertação a partir de células vivas). A tireóide captura isótopo livre (Tc-99m) lançado a partir de células mortas ou a morrer, e Tc-99m-HMPAO pode ser eliminada pelo rim e intestino. Estes tecidos podem ser monitorizada por cintigrafia gama para avaliar a perda de potencial de etiqueta.
O procedimento de marcação celular pode ser adaptado para testar a retenção celular e captação em vários locais (órgãos e lesão) utilizando diferentes vias de administração. A natureza focal do sinal nos pulmões pode ser indicativo de agregados de células, que presumivelmente se quebrar com o tempo ou entram lise celular. A tireóide, que capta isótopo livre, presumivelmente mostra um aumento na captação seguinte perfusão regional porque as células injetadas e detritos resultantes de células mortas têm um caminho mais acessível para a tiróide através da circulação. Apesar de apenas cerca de 24% das células permanecem depois de 24 horas, a via intralesional no tendão é a via de administração mais eficaz como a maioria dos casos não mostrou Tc-99m livre na tiróide. As informações obtidas a partir de utilização de tais protocolos podem informar futura concepção e desenvolvimento de aplicações de células-tronco para more terapias clínicas eficazes.
O protocolo de marcação de células foi adaptada para uso no cavalo de marcação com Tc-99m-HMPAO de leucócitos em aplicações médicas humanas. Seu uso neste protocolo demonstra a aplicabilidade em um grande animal em que a doença tendão ocorre espontaneamente para investigações de terapias baseadas em células. O recrutamento de casos clínicos podem ajudar a compensar os custos mais elevados associados com o trabalho com um animal maior. O procedimento de marcação para utilização como uma modalidade de imagem tenha sido descrita em modelos animais pequenos 21 e nós acreditamos que o protocolo pode igualmente ser utilizado em animais maiores, tais como as ovelhas para investigações de outras doenças do tendão.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
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