Abstract
Recente vooruitgang bij de toepassing van beenmerg mesenchymale stamcellen (BMMSC) voor de behandeling van pezen en ligament verwondingen bij het paard stel meetinstrumenten in zowel experimentele als klinische studies verbeterd. Hoewel de BMMSC worden geïmplanteerd in de pees laesie in grote aantallen (gewoonlijk 10 - 20 miljoen cellen) slechts een relatief klein aantal overleven (<10%), hoewel deze kan gedurende maximaal 5 maanden na implantatie. Dit lijkt een gemeenschappelijke observatie in andere soorten waarin BMMSC geïmplanteerd in andere weefsels en het is belangrijk om te begrijpen wanneer deze optreedt, hoeveel overleven de initiële implantatie proces of de cellen worden vrijgemaakt in andere organen. Het volgen van het lot van de cellen kan worden bereikt door het radioactief merken BMMSC vóór implantatie waarbij niet-invasief in vivo beeldvorming van cellocatie en kwantificatie van celaantallen maakt.
Dit protocol beschrijft een cel Labellng procedure Technetium-99m (Tc-99m), en het volgen van deze cellen na implantatie gebruikt in verwond buigspieren bij paarden. Tc-99m is een kortstondige (t 1/2 van 6,01 uur) isotoop die gammastralen uitzendt en kan worden geïnternaliseerd door cellen in aanwezigheid van de lipofiele verbinding hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). Deze eigenschappen maken het ideaal voor gebruik in de geneeskunde klinieken nucleaire voor de diagnose van verschillende ziekten. Het lot van de gelabelde cellen te volgen op korte termijn (tot 36 uur) door gamma scintigrafie om zowel het aantal cellen behouden in de laesie en de verdeling van de cellen in de longen, schildklier en andere organen te kwantificeren. Deze techniek is een bewerking van de etikettering van bloed leukocyten en kunnen worden gebruikt om beeld BMMSC geïmplanteerd in andere organen.
Introduction
Regeneratieve strategieën voor het repareren van zieke of beschadigde weefsels op basis van multipotente stamcellen uit verschillende weefsels en geïmplanteerd in het getroffen gebied. Recente vooruitgang bij de toepassing van autologe BMMSC voor de behandeling van pezen en ligament verwondingen bij het paard verbeterd meetinstrumenten in zowel experimentele en klinische studies 1-5 6 getoond. Het paard is bijzonder aantrekkelijk voor de beoordeling van de effectiviteit van stamcellen tische behandelingen omdat het lijdt aan leeftijd en overspanning verwondingen aan de pezen van het distale voorpoot is een atletische dier, en het is een groot, vergemakkelijken beenmergherstel en nauwkeurige implantatie. Pezen heel natuurlijke wijze fibrose maar genezen pees functioneel inferieur 7 en heeft een hoog risico van re-letsel 8. De oppervlakkige digitale buigpees (SDFT) wordt meestal beïnvloed is geëvolueerd om als elastische energiewinkel en ervaringen hoge belasting wijst naar energie-efficiënte en snelle beweging te bereiken. Het herstellen van de functie na een blessure is daarom van cruciaal belang. Deze letsels zijn vergelijkbaar met die welke de achillespees mens die eenzelfde functie 9 uitvoert. Er zijn geen goede behandelingsmogelijkheden voor het behandelen of realiseren van een goede reparatie voor dergelijke verwondingen derhalve cel-gebaseerde regeneratieve strategieën bieden een aantrekkelijke mogelijkheid om de resultaten te verbeteren en re-letsel.
In de meeste studies 5 - zijn 20 miljoen autologe BMMSC rechtstreeks geïnjecteerd in de lesie die zich gewoonlijk in de kern van de pees instantie die derhalve fungeert als een houder van de cellen. Het lot van de cellen eenmaal geïnjecteerd is onduidelijk en andere cel etikettering methoden volgen de cellen zijn recent beschreven. Cellen gelabeld met een label fluorescentie bleken te overleven slechts in relatief kleine aantallen (<10%) 10,11. Fluorescentie labels noodzakelijkweefselextractie snijden en voor histologische analyse die tijdrovend en niet gemakkelijk vergemakkelijken temporele analyse in een groot diermodel of klinische gevallen. In meer recente werk hebben we de radio-isotoop Tc 99m gebruikt om cellen te labelen en volgen hun lot door gamma scintigrafie 1. Deze methode maakt een snelle vergelijking worden gemaakt tussen de verschillende routes van de cel levering, waaronder intralesionale, intraveneus via de halsader 1 of regionale perfusie via intra-arteriële 12 of intraveneuze injecties 1,12. De persistentie en verspreiding van cellen kunnen vervolgens worden afgebeeld door gamma scintigrafie van verschillende organen. Dit heeft aangetoond dat slechts 24% van de geïnjecteerde cellen intralesionally bleef in de laesie door 24 uur 1 en dit wordt ondersteund door een andere studie experimenteel gebruik gemaakt laesies en dezelfde radiolabel 5. Bovendien, de cellen vertonen beperkte mogelijkheid om thuis in pees letsels bij delivered regionale perfusie of intraveneus, maar verspreid in de longen door deze routes 4.
BMMSC gelabeld met ijzer nanodeeltjes is een alternatieve methode om cellen geïmplanteerd in voorpoot pezen 13 te volgen. Hoewel ijzer nanodeeltjes gelabelde cellen mogelijk cell tracking in vivo MRI, worden tijdelijk onderzoeken in een groot dier beperkt door het aantal keren anesthesie kan op elk tijdstip voor het uitvoeren van de MRI-scans worden toegediend. Verder ijzer nanodeeltjes hypointense op MRI waarop de gegevens over de migratie van gelabelde cellen in de pees lichaam beperkt. Andere radioactieve isotopen die kunnen worden gebruikt omvatten indium-111 maar deze lijdt het nadeel van een langere halfwaardetijd dan Tc-99m (2,8 dagen versus 6,0 uur) en hogere gammastraal energie-emissie. Bovendien is cellevensvatbaarheid gerapporteerd te verlagen als gelabeld met indium-111 14. Tc-99m, anderzijds, wordt routinematig gebruikt in zowel paarden- en menselijke nucleairemedicijnen perifere mononucleaire cellen labelen en volgen de verdeling in vivo door scintigrafie. Het kan relatief gemakkelijk opgenomen door cellen behulp HMPAO als linker-molecule om het technetium te binden, zoals Tc-99m-HMPAO, aan cellen. Tc-99m-gelabelde HMPAO BMMSC vertonen een goede levensvatbaarheid en kunnen prolifereren in vitro 4. Dit protocol beschrijft de etikettering en tracering van paarden autologe BMMSC geïmplanteerd in de natuur voorkomende letsels in de voorpoot SDFT.
Het is belangrijk op te merken dat het protocol alleen bedoeld voor gebruik als onderzoeksinstrument. Het gebruik ervan als een klinische therapeutische modaliteit wordt niet aanbevolen omdat het effect van het radiolabel op de cellulaire fenotype is niet volledig opgehelderd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier beschreven gevallen werden uitgevoerd na Ethische toestemming van de Animal Ethics and Welfare Comité van het Colegio de Veterinarios de Malaga, Spanje, en het Royal Veterinary College, North Mymms, UK de gebruikte procedures op de paarden worden verleend, zijn gebaseerd op de goedgekeurde protocollen die gebruikt in de kliniek op paarden ontvangen stamcellen gebaseerde therapieën die sedatie, beenmerg aspiratie, intra-tendineuze injectie, regionale perfusie, intraveneuze injectie, post-procedurele behandeling en pijnbestrijding en monitoring omvat na implantatie.
1. Key toe te passen regeling in Advance
- Zoeken institutionele ethiek en dierlijke goedkeuring welzijn en zich te houden aan voorafgaand aan de aanvang van de werkzaamheden lokale wettelijke vereisten.
- Proberen institutionele goedkeuring te werken met ioniserende straling zoals voorgeschreven door de plaatselijke en wettelijke voorschriften, waaronder het juiste niveau van bescherming van het personeel en het milieu en de verwijdering van CONTAMstig zijn afval.
- Gebruik de volgende inclusiecriteria: paarden aanwezig met een niet-traumatische overbelasting schade (tendinopathy of desmopathy) aan de oppervlakkige flexor digitale pees van de voorpoot en lesies resulterend in een gebrek binnen de pees en het defect wordt omgeven door intacte pees en / of paratenon .
Opmerking: Het onderzoek en diagnose voor dergelijke verwondingen en de klinische voorbereiding van de paarden voor cel implantatie is elders 6,15 gedetailleerd.
Opmerking: De isolatie en groei in kweek van BMMSC verkregen uit het beenmerg van paarden eerder 6,16 uitgewerkt. Het huidige protocol voor het injecteren BMMSC voor SDFT verwondingen in het paard maakt gebruik van 10 miljoen cellen per ml 4 van autologe beenmerg supernatant (BMS) 16. - Met cellen die niet meer dan 4 doorgangen voor in vivo implantatie ondergaan potentiële cellulaire fenotype of genetische wijzigingen geassocieerd met hoge passageaantal c voorkomenells.
- Lever het vereiste aantal cellen in het BMS (binnen 24 uur in een koude box bij 4 - 8 ° C) aan de veterinaire kliniek waar de cel implantatie wordt uitgevoerd.
Opmerking: Het klinisch gebruik van mesenchymale stamcellen in het beenmerg supernatant is een gepatenteerde procedure eigendom ReCellerate Inc (USA) en het gebruik ervan vergunning vereist.
Opmerking: Tc-99m is een gamma-emitter (140 keV) met een relatief korte halfwaardetijd (6,0058 uur, dus ongeveer 94% daarvan vervalt de stabiele vorm van 99 Tc in 24 uur). De gamma-energie maakt het geschikt voor detectie door gammacamera's (scintigrafie) en de korte halfwaardetijd resulteert in zeer beperkte straling tijd zowel paard en dier handling personeel. Dit protocol beschrijft de etikettering van cellen met behulp van Tc-99m-HMPAO [HMPAO gelabeld met Tc-99m (natrium pertechnetaat)] op het terrein. - Bestel de Tc-99m vers van de leverancier zodat wordt geleverd en gebruikt voor het labelen van de cellen within 2 h elutie uit de Tc-99m generator. Zorg ervoor dat de Tc-99m wordt geleverd als 1 GBq in (standaard buffer leverancier) een 1 ml oplossing.
- Gebruik alle buffers bij RT. Voer de labelingsprocedure, implantatie van de cellen en imaging (gamma scintigrafie) in een isotoop insluiting ruimte met apparatuur gereinigd met alcohol doekjes voor het begin van de werkzaamheden.
2. Voorbereiding van het Paard en Echografie van de voorpoot Tendon
- Neem echo in eerste opname voor schade (bij beenmerg wordt geaspireerd) en daarna op het tijdstip waarop radioactief gemerkte cellen worden geïnjecteerd.
- Voeren echografie en mobiele implantatie met het paard lager gewicht gelijkmatig in een stal en onder staande sedatie (in plaats van algemene anesthesie). Dien sedatie een mengsel van HCl en detomidine butorphanoltartraat, elk bij 0,01-0,02 mg / kg IV.
Opmerking: Herstel is snel en post-operatieve behandeling vereist geenspeciale overwegingen. - Nadat perineurale anesthesie wordt toegepast (stap 2,6) in het getroffen ledemaat, houdt het paard bij het station onder sedatie om beweging van het paard verminderen tijdens de behandeling. Controleer visueel het juiste niveau van sedatie beoordeeld vanuit de neergelaten positie van het hoofd en de houding van het paard en dat het paard is comfortabel tijdens cel injectie en de bewegingen van de gamma camera tijdens de overname van scintigrafische beelden.
Opmerking: Het is niet nodig om vet zalf op de ogen (tot droog voorkomen) omdat onder sedatie knipperen niet wordt verminderd en het paard kan hydratatie van het oog te handhaven. De controle na de implantatie van de cellen niet-invasief (echografie en gamma scintigrafie). - Clip nauw het haar bovenop de pees (met paard tondeuses) reinig dan het uitgeknipte gebied met behulp van een combinatie van een chloorhexidine chirurgische scrub en uiteindelijk alcohol.
- Solliciteer akoestische koppeling gel om het gebied enscannen methodisch om scans van de volledige palmar middenhandsbeentje regio, opeenvolgend gelabeld niveaus opnemen 1 - 7 17, met een lineaire transducer (12 MHz of vergelijkbaar) seriële on-incidentie transversale en longitudinale beelden te verkrijgen. Sla de beelden digitaal zodat de dwarsdoorsnede en de maximale schade zone 4 kan worden verkregen met behulp van beeldanalyse software.
- Bereid het gebied bovenop de handpalm zenuwen onmiddellijk distaal van de carpus voor aseptische injectie van plaatselijke verdoving om volledige desensibilisatie van de huid bovenop de pees en de oppervlakkige digitale buigpees garanderen. Injecteer 2 ml mepivicaine zowel subcutaan en grenzend aan de palmaire zenuwen (in hun sub-fascial locatie) tussen de flexor pezen en ophangband onmiddellijk distaal van de carpus aan beide zijden van de ledemaat.
- Nadat de voorlopige scan is uitgevoerd bereidt de implantatie door schrobben het gebied met een chloorhexidine chirurgische scrub oplossing gedurende ten minste 5 min en tenslotte met alcohol gedrenkt gaas. Voer alle volgende stappen in een aseptische wijze.
3. Tc-99m-etikettering van Equine mesenchymale stamcellen
Opmerking: De cel labeling stappen kunnen tijdens echografie van de voorpoot, omdat dit zal minimaliseren isotoop verval tussen cel etikettering en de inplanting van gelabelde cellen in de pees worden uitgevoerd.
- Verwijder het BMS uit de cellen het interfereert met de opname van isotopen. Hiertoe halen de flacon BMMSC (10 miljoen cellen in 1 ml van BMS) vanaf het vak chill pellet en de cellen in een microcentrifuge bij 350 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant met een 18G en 19G naald (bevestigd aan een injectiespuit 2 ml), waarbij een kleine druppel (≤0.1 ml) in de buis cel resuspensie steun. Sla de supernatant (BMS) in een steriele microcentrifugebuis en blijf op ijs voor later hergebruik.
- Resuspendeer de cellen in de resterende druppel supernatant met flIcking de buis voorzichtig met de vingers (in plaats van vortex) en laat de buis in een rek bij RT. Zorg ervoor dat de cellen volledig geresuspendeerd en dat er geen zichtbare klonten cel.
- Bereid de Tc-99m als volgt. Breng 1 ml van technetium pertechnetaat in een flesje van HMPAO met behulp van een 1 ml spuit en naald. Meng grondig, maar voorzichtig en laat gedurende 5 minuten achter lood afscherming. Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd terwijl de cellen spinnen in stap 2,1.
- Voeg al het Tc-99m-HMPAO mengsel met behulp van een 1 ml injectiespuit en naald om de cellen en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur achteren loden mantel.
- Voor de volgende stappen, gebruik een pincet (of een stukje tissuepapier) om het deksel van de microcentrifugebuis openen om verontreiniging van de isotoop (gehandschoende) duim en vervolgens andere apparatuur te minimaliseren. Gebruik een 2 ml spuit en 21 G naald toe te voegen of te verwijderen wasbuffer.
Opmerking: het gebruik van een veld isotoop beeldscherm wordt aangemoedigd om contaminatie van oppervlakken en apparatuur te controleren. Voeg 1 ml PBS aan de Tc-99m-HMPAO-cel mengsel, sluit het deksel, meng voorzichtig en spin om pellet de cellen zoals in stap 3.1. - Verwijder de PBS voorzichtig naar een nieuwe buis (bewaar deze achter lood afscherming en label als W1). Resuspendeer de celpellet in 1 ml verse PBS. Centrifugeer de buis en verwijder het supernatant zoals hierboven (sparen en dit label als W2).
- Bereken de efficiëntie van labeling door meting van de tellingen in W1 en W2 buizen en de celpellet. Doe dit door het plaatsen van elke buizen in een goed isotoop dosiskalibrator instrument en het opnemen van de radioactiviteit als tellingen per minuut (CPM). Bereken de etikettering efficiëntie (Radioactiviteit als CPM van cellen) / (Radioactiviteit van cellen + supernatant) x 100.
- Resuspendeer de cellen grondig in de resterende PBS en voeg vervolgens de BMS gered uit stap 3.1. De cellen zijn klaar voor intralesionale implantatie.
4. Implantatie van Tc-99m-gelabelde cellen HMPAO
- Intralesionale implantatiein de pees onder echografische begeleiding
- Langzaam introduceren 1,5 of 2 inch (50 mm) 20 G naald in de maximale schade zone van de laesie in een longitudinale oriëntatie van de ultrasone transducer, bedekt met een steriel laken, overeenkomstig de naald, zodat de lengte van de naald kan ultrasoon worden geïdentificeerd en de punt als de naald nauwkeurig in het midden van de laesie.
- Met behulp van geschikte afscherming, het verzamelen van de cellen in een 2 ml spuit onder toepassing van een 20 G naald (Luer-lock, om het risico van externe besmetting en een lead-afgeschermde injectiespuit deksel minimaliseren). Gooi de naald voorzichtig om geen vocht verliezen. Bevestig nu de spuit met de gelabelde cellen op de naald vooraf in de pees.
- Plaats de ultrasone sonde onder de naald zodat het naaldspoor in het weefsel duidelijk zichtbaar. Injecteren van de cellen in een traag maar gestaag tempo in de laesie. Zorg ervoor dat er geen weerstand tegen injectie. Wanneer dit wordt aangetroffennauwkeurig de positie van de naald onder echografische begeleiding. Controleer of de vloeistof uitwerpen in de laesie zichtbaar op het ultrasone beeld als echovrije vloeistof die hyperechogeen luchtbellen.
- Trek de naald onmiddellijk plaats druk via naaldgat verlies van geïnjecteerde cellen te voorkomen en de verspreiding van isotoop over de buitenkant van de ledemaat te minimaliseren. Onmiddellijk de kleding van de ledemaat met één laag van zelfklevende bandage. Het paard is nu klaar voor gamma-scintigrafie. Voer deze onmiddellijk.
Opmerking: Na de injectie van de cellen in de pees verkrijgen van een telling van de lege injectiespuit en naald om mogelijke directe verlies van cellen die in de injectiespuit kan blijven beoordelen.
- Regionale perfusie van Tc-99m-gelabelde cellen HMPAO
- Volg stap 2.4.
- Breng een 100 mm rubber tourniquet pleister op de proximale polsen met twee 100 mm katoen roll gaasverband mediaal en lateraal geplaatst.
- Aseptisch th bereidene huid over de laterale palmaire digitale ader op het niveau van de laterale proximale sesambeen door schrobben het gebied met een chloorhexidine chirurgische scrub oplossing ten minste 5 min en tenslotte met een gaasje gedrenkt in alcohol. Voer alle volgende stappen in een aseptische wijze.
- Bereid een 100 mm uitbreidingsset met een 21 G x ¾ "(0,8 x 19 mm) vlinder naald voor venapunctie door het vullen met gehepariniseerde steriele zoutoplossing en vervolgens te introduceren de naald in de laterale palmaire digitale ader. Zodra de ader wordt ingevoerd bloed zal gedeeltelijk vullen de uitbreidingsset. Aan het Luer lock connector bevestig een Luer lock rubberen dop voor het vergemakkelijken van daaropvolgende injectie van gelabelde cellen.
- Verdun de MSCs in 19 ml PBS door het verzamelen van de cellen in een 20 ml injectiespuit geladen met PBS. Breng de cellen via de rubber beker met behulp van een 18 G (1,2 x 40 mm) injectienaald in een langzaam maar gestaag tempo (30-40 sec). Spoel de katheter met 1 ml PBS voorgeladen in een Syringe.
- Verwijder de naald en onmiddellijk toe te passen druk aan de huid over de naald gat met een laag vijf 4 x 4 katoenen gaas. Plaats dan een lichte bandage met elastische lijm over het proximale sesamoid gebied en laat de tourniquet in de plaats voor 30 minuten na de injectie.
- Laat de tourniquet na 30 min. Het paard is nu klaar voor gamma-scintigrafie.
Opmerking: Na het injecteren van de cellen, het verwerven van een telling van de lege injectiespuit en naald om mogelijke directe verlies van cellen die in de injectiespuit kan blijven beoordelen.
5. Gamma Scintigrafie
- Scintigrafie beelden
- Verwerven planaire scintigrafie beelden met een gammacamera (vastgesteld op 140 KeV optische piek met behulp van een 20% symmetrisch venster) uitgerust met een lage energie, parallel hole collimator.
- Verkrijgen alle afbeeldingen na verloop van tijd 0 op staande paarden verdoofd zoals in stap 2.2. Na de tijd 0 scintigram, vervang het licht pleister over de inplanting siTE met een gewatteerde bandage. Verwijder dit verband voor elke scintigrafie examen.
- Acquire statische beelden gedurende 60 seconden elk (256 bij 256 matrix) met de verwerking van software met de "verwerven" - "studie selectie" - "bone statische" opties. Het is essentieel dat het paard niet beweegt tijdens de beeldacquisitie periode, omdat de modusoptie static geen module voor het corrigeren van beweging hebben.
- Voor intralesionale injectie krijgen laterale beelden van de laesie gebied van de carpus naar het distale uiteinde, het equivalente gebied van de contralaterale ledemaat, de linker long veld en de linker schildklier. Tijdens de overname van voorpoten beelden, plaatst een loden scherm tussen de benen om beeldvorming van de contralaterale ledematen te voorkomen. Het verwerven van de beelden op 5 min na injectie (tijd 0) en vervolgens bij 1, 3, 6, 12, 24, 36 en 48 uur.
- Voor regionale perfusie, krijgen laterale en dorsale gamma beelden als voor 5.1.1.3. Verkrijgen beelden 5 min after tourniquet release. Dit zal de tijd 0. Het kan nuttig zijn om de afbeelding van de ledematen onmiddellijk na het injecteren van de cellen tellingen voorafgaand aan vrijlating tourniquet beoordelen. Verkrijgen gamma afbeeldingen op 1, 3, 6, 12, 24, 36 en 48 uur na toediening van de cellen.
- Nadat de beelden zijn verkregen, verwerken de beelden handmatig met de "verwerking" optie van de software met de opties geselecteerd voor "Sokoloff" kleur "Omkeren" kleur. Selecteer vervolgens de "regio van belang" (ROI) en "ellips", zoals dit maakt hervorming van de selectie masker en beweging over de laesie gebied. Het verkrijgen van de graven over de ROI door te kiezen voor de "toe te voegen aan de statistieken" optie. Zorg ervoor dat identiek bemeten regio's van belang (ROI) worden geregistreerd voor elk dier op de verschillende tijdstippen.
- Vervolgens corrigeren geldt voor de voorspelde verval van het technetium op elk tijdstip. Gebruik de volgende vergelijking te corrigeren voor verval:A = Ao e - (0.693t / T 1/2), waarbij Ao de initiële activiteit van de isotoop, A is het verval gecorrigeerd radioactiviteit op tijdstip nul, t de verstreken tijd en T 1/2 is helft -life van de isotoop. Drukken dan de gecorrigeerde tellingen op elk tijdstip als percentage van het ROI op tijdstip 0 uitwerken het percentage cellen die overblijven, met de volgende formule:
- Verwerven planaire scintigrafie beelden met een gammacamera (vastgesteld op 140 KeV optische piek met behulp van een 20% symmetrisch venster) uitgerust met een lage energie, parallel hole collimator.
% cellen die overblijven (t) = 100 - {[(voorspelde decay (t) - verval (t)) / voorspelde verval (t)]} x 100
verval (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tc-99m-HMPAO opname in BMMSs geen nadelige hun vermogen om zich aan weefselkweek plastic beïnvloeden en terwijl ze tonen proliferatievermogen monolagen te vormen (figuur 1) hebben we niet volledig bepaald of proliferatiesnelheden of andere cellulaire fenotypes worden beïnvloed. De morfologie is vergelijkbaar met ongelabelde cellen met een typische vorm spindel. De cellulaire merkingsrendement (bijv., Opname van label) varieert gewoonlijk van ongeveer 1,5% tot 25%. De belangrijkste reden voor de lage labelingsefficiëntie was gerelateerd aan de vertraging in de oplevering van het 99mTc naar de kliniek van de plaats waar de Mo-99 / Tc-99m generator geëlueerd. Vertragingen van meer dan 2 uur tot een belangrijke afname van labeling van de cellen. Echter voldoende isotoop opgenomen in de cellen gammascintigrafie voeren tot 36 uur (Figuur 2). Factoren die labelingsefficiëntie kan verbeteren worden beschreven in de discussie.
1 (direct in de laesie) of regionale perfusie via een digitale 1 ader of slagader 12. Intralesionale implantatie mogelijk wanneer de schade in de kern van de pees en omgeven door intacte pees weefsel dat fungeert als een houder van de cellen. Regionale perfusie is een eenvoudiger route naar de cellen toe te dienen als ze worden geïnjecteerd in een bloedvat maar de werkwijze berust op de verwachting dat de MSC in staat zijn aan "in" naar de pees laesie. Er is beperkt bewijs dat MSC's kunnen specifiek thuis in plaatsen van pees letsels maar deze methode levert een nuttige experimentele benadering voor het ontwikkelen van toepassingen die de homing capaciteit van MSC's kunnen verhogen.
Met intralesionale afleveringsroute, zullen de cellen worden gezien als een concentratiegebied signaal dat vrij blijft gelokaliseerd tijd ie., Er beperkte spread of migratie van de cellen in het omringende weefsel pees. Daarentegen zal er een geleidelijke vermindering van het signaal met de tijd op de injectieplaats wanneer cellen worden beheerd door regionale perfusie via de digitale palmaire ader (figuur 2). Het is bij intralesionale injectie voor de longvelden negatief, maar in sommige gevallen in het vroege tijdstippen de long isotoop signaal dat focale kan worden en vervolgens wordt meer gegeneraliseerd (figuur 3) kunnen vertonen. De schildklier blijft negatief met dit toedieningsweg. Regionale perfusie soortgelijke wijze kan focale signaal in de longen, die vervolgens diffuser maar het signaal is significant intenser in vergelijking met die waargenomen bij de intralesionale route tonen. De schildklier kan ook vaak centraal signaal tonen.
De aanvankelijke totale radioisotoop telling van de cellen (tijdstip 0, pre-injectie) en de tellingen van de oorspronkelijke gamma scintigram op het gebied van belang (tijdstip 0, na i-njection) worden genoteerd en gebruikt om het percentage afname in tellingen op elk tijdstip berekend. Dit wordt gebruikt om te vergelijken met de voorspelde verval van de Tc-99m van de initiële tellingen (Figuur 4). De berekende curve de voorspelde curve volgen. Echter, na de voorspelde verval in aanmerking, de persistentie van cellen die overblijven in de injectieplaats na intralaesionale toediening bedraagt ongeveer 32% (bij 12 uur) en 24% (bij 24 uur) (Figuur 4).
Figuur 1. Cell Labeling, Injection en Gamma Scintigrafie (A) Overdracht van BMMSC in een microcentrifuge voorafgaand aan labeling met Tc-99m-HMPAO achter-lood beklede afscherming (scherm en spuithouder) en straling monitor en microcentrifuge.; (B) Een hoeveelheid van Tc-99m-HMPAO gelabelde cellen gezaaid in een weefselkweekplaat toon good morphology, levensvatbaarheid en proliferatie; (C) Injectie van Tc-99m-HMPAO gelabelde cellen onder echografische begeleiding in het letsel site van de rechter voorpoot SDFT; (D) Gamma scintigrafie van de voorpoot. De gamma-camera is geplaatst precies met behulp van een hydraulische arm wendbaar en eventuele gelabelde cellen in de contralaterale ledemaat worden geëlimineerd door een loden schild gehouden tussen de benen. De gamma-camera is eveneens gepositioneerd op de borst naar het veld longen monitor of in de nek naar het veld schildklier te controleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Ultrasound en Gamma scintigrammen van de SDFT. Typische ultrasonographs van de voorpoot op de mid-metacarpale regio (A (B) doorsnede. Het letsel in de SDFT wordt duidelijk gezien als hypoechoic gebied (naar de bovenkant van de scan) vergeleken met de niet-beschadigde (normaal) weefsel integriteit van de diepe digitale buigpees (DDFT) aangrenzend aan en onder de SDFT. Het gebied van de laesie en de relatieve posities van de pezen zijn weergegeven in onderstaand schema. Gamma scintigrafische uitgevoerd op 3, 6 en 12 uur na injectie van radioactief gemerkte cellen worden getoond voor de geïnjecteerde cellen (C) in de laesie of (D) door intraveneuze regionale perfusie via de digitale palmaire ader. In het getoonde geval was opname van radioactief gelabelde cellen in de laesie in de SDFT (vaste pijlen). Persistentie van opname door de palmar digitale ader wordt aangeduid door de gestippelde pijl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Gamma scintigrammen van de long en de schildklier. Typische scans vanaf de vroege tijdstippen worden getoond voor zowel intralesionale injectie en regionale perfusie van gelabelde cellen. Let op de focale en diffuse signaal in de longen en de schildklier velden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Verval van radioactiviteit Opgenomen van de Regio's van belang na Intralesionale Injection. In dit paard, werden tellingen gemeten van gamma scintigrammen van de SDFT meer dan 36 uur na injectie in de laesie. Linkerpaneel: de radioactiviteit op elk tijdstip werd berekend tegen de tijd 0 waarde. Danatural bederf radioactiviteit van 99mTc wordt ter vergelijking getoond. Rechts panel: het geschatte percentage van de cellen die overblijven. Dit wordt berekend uit het radioactiviteitsniveau van de gebieden van belang. In dit geval is het resterende percentage cellen in 24 uur ongeveer 24%. We hebben dit protocol (etikettering van MSC en implantatie) op 21 paarden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Naast beenmerg stamcellen geïsoleerd uit bronnen zoals vetweefsel zijn geschikt voor labeling met dit protocol. Verder kunnen cellen van een bevroren toestand nieuw leven worden ingeblazen en uitgebreid in de cultuur om de gewenste nummers voor labeling studies 12.
Een kritische factor die de efficiëntie van het merken van de BMMSC bepaalt de tijd tussen elutie van de Tc-99m generator van het molybdeen aan de radiofarmacie, bereiding van Tc-99m-HMPAO en het gebruik van de radiofarmaceutische in de kliniek. Er is een omgekeerde relatie tussen merkingsrendement en na Tc-99m elutie van de generator zodat vertragingen na deze periode aanzienlijk kan afbreuk doen aan de efficiëntie van de cel labeling. Daarom is nauwe samenwerking nodig tussen de levering van de cellen van het laboratorium en de levering van de Tc-99m naar de kliniek op de dag dat de cellen radioactief gemerkt en geïmplanteerd worden. Het transport tijd om de clinic is daarom een belangrijke factor. De leverancier productbeschrijving aangeven dat het verval van het Tc-99m vermindert de zuiverheid van de radiochemische na 2 uur na elutie die kunnen interfereren met de binding van het HMPAO de Tc-99m en vervolgens de hoeveelheid van Tc-99m-HMPAO genomen door de cellen. We hebben ook opgemerkt dat de etikettering van gekweekte cellen in een laboratoriumomgeving gaf efficiënter dan etikettering in de kliniek. Dit is ook gerapporteerd door andere studie bij paarden 5 waarbij de cellen werden gelabeld in een laboratoriumomgeving. Bovendien, in onze ervaring label efficiënter opgenomen door cellen die direct worden gelabeld na de bereiding uit bloed of weefselmonsters vergelijking met cellen die zijn bereid uit de kweek. Maar zelfs met lage efficiëntie van labeling voldoende label gebonden aan de cellen scintigrafie presteren dan 36 uur.
Labeling rendement van 40% - 80% kan worden bereikt voor leukocyten als de Tc-99m wordt van eenverse generator eluaat binnen 30 min en de reactie uitgevoerd in een klein volume (1 - 0,5 ml) 18. Labeling rendement van 47% - 71% is bereikt voor paarden MSCs 19 aangetoond dat het mogelijk is de labelingsefficiëntie van MSC's te verhogen onder ideale omstandigheden.
We implanteren routinematig 20 miljoen cellen voor de behandeling van SDFT kern laesies hoewel tot 40 miljoen cellen zijn geïmplanteerd voor het grootste laesies. Een vergelijkbaar aantal cellen kunnen worden geïmplanteerd via regionale perfusie alhoewel deze methode niet algemeen gebruikt vanwege de complexe procedure. Het kan echter nuttig zijn voor letsels die zich aan de omtrek van de pees oppervlak met de verwachting dat er voldoende cellen huis in de laesie. Het bijhouden van de cellen door gamma scintigrafie kunnen nuttige informatie over de verplaatsing van cellen door verschillende routes toegediend bieden. In dit protocol, de cellen geïmplanteerd door de intralesionale route zijn mostly vastgehouden op de injectieplaats door intralesionale route. Radio-isotoop signaal kan worden waargenomen in de long gebieden in sommige gevallen maar wordt in het algemeen dat er weinig migratie van cellen verwijderd van de laesie. Levering van BMMSC regionale perfusie suggereert dat retentie van cellen zijn op de beschadigde plaats, maar wanneer afgegeven door intraveneuze injectie 4 hebben we waargenomen homing van de cellen. Het Tc-99m-HMPAO label laat de cellen migratievermogen 20 en de Tc-99m-HMPAO wordt geïnternaliseerd door de cellen en vastgehouden in het cytoplasma, is het onwaarschijnlijk verstoren hechtingseigenschappen.
De berekening van signaal van gebieden van belang kan een onderschatting aangezien het mogelijk is dat die kunnen er aanzienlijke dissociatie van het label uit cellen (vrij van dode cellen of andere mechanismen van afgifte uit levende cellen) zijn. De schildklier vangt vrije isotoop (Tc-99m) vrijgelaten uit dode of stervende cellen en Tc-99m-HMPAO kan worden geëlimineerd door de nieren en darmen. Deze weefsels kunnen worden gecontroleerd door gamma scintigrafie om potentiële verlies van label te beoordelen.
De cel labeling procedure kan worden aangepast voor het testen van retentie en opname cellen op verschillende plaatsen (organen en schade) via verschillende toedieningsroutes. De focale aard van het signaal in de longen indicatief celaggregaten die vermoedelijk breken tijd of voer cellyse zijn. De schildklier, die vrij isotoop vastlegt, toont vermoedelijk een toename opname volgende regionale perfusie omdat de geïnjecteerde cellen en de resulterende afval van dode cellen een toegankelijker route naar de schildklier via de bloedsomloop. Hoewel slechts ongeveer 24% van de cellen achterblijven na 24 uur, de intralesionale route in de pees is de meest effectieve levering route de meeste gevallen vertoonden geen vrij Tc-99m in de schildklier. Informatie die uit het gebruik van dergelijke protocollen kunnen toekomstige ontwerp en de ontwikkeling van stamcellen aanvragen voor mo informerenre effectieve klinische therapieën.
De cel labeling protocol werd aangepast voor gebruik bij het paard Tc-99m-HMPAO labeling van leukocyten in menselijke medische toepassingen. Het gebruik ervan in dit protocol demonstreert toepasbaarheid in een groot dier waarbij pees ziekte komt spontaan voor onderzoeken van cel-gebaseerde therapieën. De werving van klinische gevallen kan helpen de hogere kosten werken met een groter dier compenseren. De procedure voor toepassing als beeldvormende modaliteit etikettering beschreven in kleine diermodellen 21 en wij geloven dat het protocol eveneens kan worden gebruikt in grotere dieren zoals schapen voor onderzoeken van andere pees ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, Suppl S23. 23-26 (1997).
- O'Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
