Summary
מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה סטנדרטית לבצע בדיקות סבילות לגלוקוז תוך ורידים (IVGTTs) להעריך שליטה הגליקמית בקרב פרימטים לא אנושיים ולהעריך המצב המטבולי שלהם בריאים dysmetabolic.
Abstract
המבחן הסביל לגלוקוז תוך ורידים (IVGTT) ממלא תפקיד מרכזי באפיון של הומאוסטזיס הגלוקוז. כאשר הוא נלקח יחד עם פרופילים ביוכימיות בסרום, כולל רמות הגלוקוז בדם בשתי הפד וצם המדינה, HbA1c, רמות אינסולין, ההיסטוריה הרפואית של דיאטה, הרכב הגוף, ומצב משקל הגוף, הערכת השליטה הגליקמית נורמלי נורמלי יכול להתבצע . פרשנות של IVGTT נעשתה באמצעות מדידה של שינויים ברמות הגלוקוז והאינסולין לאורך זמן ביחס לאתגר דקסטרוז. רכיבים קריטיים כדי להיחשב הם: רמות גלוקוז השיא והאינסולין הגיעו ביחס T0 (סוף עירוי גלוקוז), שיעור סיקול גלוקוז K נגזר מן המדרון של פינוי גלוקוז המהיר ב -20 הדקות הראשונות (T1 עד T20), הזמן לחזור בסיס גלוקוז, ואת השטח מתחת לעקומה (AUC). אמצעים אלה IVGTT יציגו שינויים אופייניים כמו מהלכי הומאוסטזיס הגלוקוז חולץ בריאמצב מטבולי חולה OA 5. בזאת אנו נתאר את האפיון של פרימטים לא אנושיים (רזוס ו Cynomolgus קופי), שהן במודל החיה הרלוונטי ביותר של סוכרת הסוג II (T2D) בבני אדם ואת IVGTT ופרופילים קליניים של בעלי חיים אלה מתוך רזה בריא, כדי dysmetabolic השמן, ו T2D המדינה 8, 10, 11.
Introduction
IVGTT הוא assay פונקציונלי נוח המשמש באופן שגרתי כדי לקבוע את הפונקציה β-cell בבני אדם בבית מדינות מטבוליים שונים 5, 7. במודלים של בעלי חיים T2D, הוא מוכר גם כלי לאפיין חיות שמראים התקדמות מחלה מטבולית מ בריא למצב 8 hyperglycemic dysmetabolic, 9. המודל החי הקרוב של T2D מודגם פרימטים לא אנושיים (NHPs), מתוכם קופי רזוס ו cynomolgus הם דוגמאות בולטות. חיות אלה לפתח T2D טבעי עם אותו גורמי הסיכון של גיל והשמנה לתרום שכיחותה כמו אצל בני אדם 10. יתר על כן, קיימת התקדמות מחלה דומה והפתולוגיה לבלב מראה פיקדונות עמילואיד ככל שהמחלה מתקדמת dysmetabolic 11.
כאן אנו מדווחים על השיטה הסטנדרטית שלנו של ביצוע IVGTT ב NHPs כחלק אפיון המושבה שלנו של המצב המטבולי אצל בעלי חיים אלה. שיטה זו היאקל לבצע ביחס אחר, זמן רב יותר וטכניקות יקרות 2. IVGTT שימושי לאפיון מושבה גדולה של חיות במהירות ולעתים קרובות. כאשר נלקחו בחשבון עם רמת המוגלובין מסוכרר (HbA1c), ההיסטוריה צריכת דיאטה ומזון של בעלי החיים, כמו גם מסת השומן ו גוף הרזה האחוז שלהם, IVGTT מספיקה בדרך כלל לאפיון מעמד חילוף החומרים של בעלי חיים והתקדמות לכיוון סוכרת גלויה 6 , 8.
HbA1C מייצג את רמת גליקמי הממוצעת לאורך תקופת החיים של תאי דם אדומים, מתן מדד אמין של רמות גלוקוז במהלך ששת השבועות הקודמים עד שלושה חודשים. כאשר נמדד על פי דגימת דם בסיס הצמה של IVGTT, ערך זה מספק חלון לתוך שליטה הגליקמית בחודשי בין הליכים. אם החיה מ שהועברה dysmetabolic כדי סוכרתית מאז IVGTT האחרון שלהם, ערך HbA1C גבוה בהרבה מהערך הקודם שלהם שיצביעשהמעבר החל זמן קצר לאחר IVGTT האחרון שלהם, ואילו, ערך HbA1C הקרוב לשווי הקודם שלהם היה מציין כי הם שהעבירו רק לאחרונה. באופן כללי, קופי רזוס, HbA1C מעריך יותר מ -6% נחשבים נורמלים, ומעידי שליטה הגליקמית עניה 10, 23.
רמות גליקמי יש לפרש בהקשר של התנהגות ובריאות כללית של החיה כולה. קופי סוכרתי - כמו בני אדם - תערוכת hyperphagia, פולידיפסיה, ומשתן. דיור של חיות קבוצה מספק אתגרים משמעותיים מדיד אינדיקטורים אלה ואת הטיפול היחיד הנדרשים dysmetabolic וקופים סוכרתיים. אנו ממליצים דיור החיות בנפרד על מנת טיפול אישי יותר יכול להינתן, וסמנים התנהגותיים של בריאות של הקוף יותר בקלות להיות במעקב 8. בנוסף, קופי סוכרת יפגין הרזיה, כמו גם פרופיל שומנים גבוה (גדלכולסטרול, hypertriglyceridemia) ומוטרד מטבוליזם מינרלים בכימיה בסרום. חשוב למדוד סמנים של תפקוד כבד כליות בכימיה סרום, כמו נזק לאיברים אלה הן בדרך כלל סיבוכים לקדם הפרעת / סוכרת מטבולית, ועלול להיות שותף הקובעים גליקמי, שומנים וחוסר איזון מינרלים 9, 11, 18, 24 .
בעת השימוש בשיטה זו, הערכים ההסטוריים המופקים מרובים, אפיונים תכופים לאורך חיי קוף הם בעלי ערך מסוים. אם נהלים אחרים, כגון מהדק גלוקוז או עירוי גלוקוז מדורג (GGI), יש צורך להעריך את הבריאות של בעלי החיים באופן מלא, זה נפוץ על אפיון ראשוני כאשר ההיסטוריה שלהם אינה זמינה. עם זאת, פעם בסיס כבר נקבע, חזר IVGTTs של בתדירות של אחת לשלושה חודשים מספיקים בדרך כלל למעקב אחר ההתקדמות של חיה. הדבר חשוב במיוחד כאשר החיות לומדות לתוך מחקרים רבים ברחבישנה קלנדרית מבוסס על המצב המטבולי שלהם. בעוד בריאותם יכולה להישאר יציבה יחסית במשך שנים בכל פעם, כאשר את המצב המטבולי של חיה מחמירה, עלייה דרמטית התנגדות לאינסולין חוסר סבילות לגלוקוז יכולה להתרחש במהירות רבה. ערכי HbA1C לאפשר אינטרפולציה חלק מהירידה או שיפור של מצב הבריאות של החיה בין תיאמו תורים בהפרש של שלושה חודשים. מסיבה זו, שיטה זו היא אידיאלית לאפיון בעלי החיים המשמשים מרובים, מחקרים ארוכי טווח במהלך תוחלת החיים הטבעית שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלי כל החיה אושרו על ידי IACUC דוד ח מרדוק מכון המחקר ממוקם בקמפוס המחקר צפון קרוליינה (NCRC), תחת פרוטוקול 14-017, אפיון מודל הפרימטים אנושי של סוכרת טרום סוכרת / עמידות לאינסולין ויעילות של תרופות לשיפור רגישות לאינסולין ותפקוד מטבולים.
1. בחירת Animal ומכין לימוד
- דיאטה ומשקל בחר חיות יציבות המבוסס על צריכת מזון חודשית ומשקל גוף רשום.
הערה: בעלי חיים הפגינו ירידה אחרונה בתיאבון לא צריכים להיות מאופיינים עד צריכת המזון שלהם התייצבה.- לבעלי חיים בוגרים (> 5 - 6 שנים), לא תבחר חיה שאין משקולות הגוף בין חודשים רצופים שונה על ידי יותר מ -10% מבלי לבחון את הקוף שלילת גורמים אחרים מאשר לשנות המצב המטבולי לשינוי הדרמטי במשקל.
- לקבלת גלוקוז, אינסולין ו- c-peptianalytes דה, להכין צינורות איסוף מדגם K 2 EDTA עם מעכבי פרוטאז (Aprotinin ו DPP4I).
הערה: קוקטייל DPP4I + Aprotinin מספק קשת רחבה של עיכוב פרוטאז יש לדרוש זה עבור analytes נוסף (גלוקגון, GLP-1). במקרה analytes הנוסף אינם נאסף, צינורות הדם צריכים להיות מוכנים באותה הדרך כדי לשמור על עקביות אוסף מדגם. דוגמאות עבור מבחנים לא תוקפים בשיטה זו יש לאסוף בנפרד, על פי ההמלצות של היצרן.- הכן את קוקטייל מעכב פרוטאז ידי ערבוב 100 מ"ג lyophilized Aprotinin עם 10 מ"ל של DPP4I. הוסף 10 μl של תערובת Aprotinin + DPP4I על צינור אחד דם לכל מיליליטר של דם שנאסף.
- הוסף 10 μl נוסף של קוקטייל מעכבי פרוטאז על צינור אחד עבור overage האוסף אפשרי. אחסן את צינורות הדם שטופלו ב -20 ° C עד השימוש. שמור את הצינורות על קרח רטוב במהלך proceduמחדש ספין על 4 מעלות צלזיוס.
- השתמש צינור בסרום מפריד לאסוף דגימת דם בתחילת המחקר לניתוח כימיה בסרום סטנדרטי. עבור ספירת דם מלאה (CBC), להשתמש EDTA תקן K 2 ללא מעכבי פרוטאז. השתמש cryovials לפלזמה וסרום aliquot לאחר דגימות דם כבר הסתחרר למטה.
- לייבל הצינורות הדם ואת cryovials כראוי עם זיהוי בעלי חיים, נכון להיום, ההליך, timepoint, ואת נפח דגימה. לייבל cryovials עם אנליטי (ים) בפלסמה עבור assay המתאים.
- מכינים את סומק מלוחים heparinized ידי הזרקת 0.15 מ"ל של 1,000 יחידות USP לכל הפרין מ"ל לתוך שקית 250 מ"ל של תמיסת מלח רגיל. להשיג פתרון של 0.06 מ"ג הפרין / מ"ל. צייר 40 - 60 מיליליטר של פתרון זה לתוך מנעול מלוח להדחה בין דגימות. צייר 1 מיליליטר נוסף ו -5 מיליליטר לתוך מזרקים נפרדים להדחת נמל עירוי דקסטרוז לפני ואחרי אינפוזיה, בהתאמה.
2.בעלי חיים סדציה והכנה
- סור מזון מן הכלוב של בעלי החיים לא פחות מ -14 שעות לפני ההליך, ולא יותר מ -18 שעות.
הערה: חשוב כי בעלי החיים להיות צמו במשך ההליך, כדי למנוע כל וריאציה שלאחר סעודה בערכים גליקמי. זהו גם אמצעי זהירות כדי למנוע regurgitation והשאיפה של תוכן הקיבה תוך מורדם. - חיות שלווים למשך ההליך IVGTT עם קטמין נתון לשריר כמו הרדמה כללית, ב -10 מ"ג / ק"ג. נהל קטמין נוספים (5 - 10 מ"ג / ק"ג) במרווחים של 20 - 30 דקות, או לפי הצורך, במהלך ההליך.
- לשקול את החיה המסוממת. מניח את החיה במצב שכיבה רוחבית על שולחן הליך מחומם.
- צג פרמטרים קליניים כל 15 עד 20 דקות על מנת להבטיח את החיה היא מטוס יציב של הרדמה. למדוד את קצב הלב (100 - 200 פעימות לדקה) ו -2 SPO (> 92%) עם דופק oximeter. למדוד את קצב הנשימה (20 - 50 נשימות / דקה) w ה- i סטופר, ספירת נשימות חזותיות או ביד במשך חמש עשר שניות ומכפילים אותו הארבעה. טמפרטורה מדודה (> 97 ° F) רקטלי. צג הצבע של הקרום הרירי סביב החניכיים ושפות (לחות, ורוד).
- כן שני אתרי צינורית. השתמש קוצץ שיער לקצץ את השיער מאזור העניינים אם הקטטר יוכנס, לעקר את האזור כולו עם סקראבס לסירוגין של chlorhexidine ו -70% אלכוהול.
- מניח קטטר אחד באזור של הוורידים שמאלה או ימינה כאפאליך או saphenous וצרף אותו סומק מלוח הפרין (0.06 מ"ג הפרין / מיליליטר) עם שסתום משולש. זהו אתר לקיחת דם הדגימה.
- מניחים את הקטטר השני ברגל אחר או שלובי באזור של הוורידים כאפאליך או saphenous ולצרף הנמל. השתמש באתר זה עבור עירוי דקסטרוז. השתמש קטן, 1 מ"ל סומק של מלוחים heparinized כדי לשמור על פטנט צינורית לפני עירוי דקסטרוז.
הערה: הליך IVGTT מורכב מ 8 דם תיקו דגימה בזמן נקודות (טבלה 1).
- קח במדגם הבסיס ולהשתמש glucometer כף יד למדוד את רמת הגלוקוז בדם בצום. השג מדגם בסרום לניתוח כימיה סטנדרטי, כמו גם דגימת דם שלמה עבור CBC כדי להעריך את הבריאות הכללית של החיה. לאסוף דגימות פלזמה assay רמות גלוקוז ואינסולין מהדגימה הבסיס באמצעות ערכת תוקף לשימוש עם קופי לפי הוראות היצרן 8, 9.
הערה: חשוב יש א-תייק מראש של 0.5 מיליליטר שנלקח הצינורית לפני נטילת דגימה עבור איסוף דם כדי להסיר דם שיורית או הפרין באישון-השטח של הצינורית. - לאחר קבלת מדגם הבסיס, להחדיר את המינון של דקסטרוז 50% (250 מ"ג / ק"ג) מעל 30 שניות ליציאת עירוי דקסטרוז.
הערה: מודלים מינון גבוה יותר (500 מ"ג / ק"ג) יכול לשמש,למרות המינון צריך להיות קבוע על פני נהלים על מנת לערוך השוואות אורך.- שטוף את הנמל עירוי עם 5 מ"ל של תמיסת מלח heparinized לוודא שאין דקסטרוז עזב בנמל. סופו של העירוי הוא T0. יש הטכנאי להחליף את הכפפות, כמו דקסטרוז שיורית מן אינפוזיה עלול לזהם דגימות דם עוקבות.
- נקודת הזמן מדגם שלאחר העירוי הראשונה היא דק T3, מסוף עירוי דקסטרוז, ואחריו T5 דקות, דקות T7, T10 דקות, T15 דקות, T20 דקות, ואת נקודת זמן המדגם האחרונה היא ב דקות T30. אסוף פלזמה מכל timepoint לרמות גלוקוז ואינסולין assay עם מדגם הבסיס (ראה שלב 3.1).
- באותו T3 דקות נקודת זמן, השתמש glucometer כף היד כדי שוב לבדוק את רמת הגלוקוז בדם.
הערה: קריאות glucometer בתחילת המחקר ו- T3 הם רק כדי לאשר את העירוי של דקסטרוז. רמת הגלוקוז בדם על T3 דקות נקודת זמן צריכה להיות ~ 100 מ"ג / ד"ל שיתוף גבוהmpared לרמת הגלוקוז בפלסמה הבסיס צום.
- באותו T3 דקות נקודת זמן, השתמש glucometer כף היד כדי שוב לבדוק את רמת הגלוקוז בדם.
4. שחזור בעלי חיים עיבוד המדגם
- הסר את קנולות ולהפעיל לחץ כדי באתרי צינתור עבור המוסטאסיס לאחר T30 דקות נקודת זמן. צג את החיה עד שהוא שב להכרתו והוא יושב. עדכון מבצע פעם החיה הוא התאושש לחלוטין.
- מיד למקם כל דגימת דם שלם לתוך צינורות EDTA 2 K על הקרח. צנטריפוגה ב -3,000 סל"ד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתוך 10 דקות של איסוף. דגימות פלסמה Aliquot לתוך cryovials, הקפאת ולאחסן ב -80 ° C עד הניתוח.
- אפשר הדם לתוך הצינור בסרום לניתוח כימיה סרום רגיל לשבת בטמפרטורת החדר למשך לא פחות מ -20 דקות ולא יותר מ -30 דקות לפני צנטריפוגה ב -3,000 סל"ד ב RT. להקפיא את דגימות סרום עד assayed בתוך 48 שעות של האוסף.
הערה: למקרר דגימות דם כולו שנאספו לניתוח CBC עד כפיסייד תוך 24 שעות של האוסף.
- אפשר הדם לתוך הצינור בסרום לניתוח כימיה סרום רגיל לשבת בטמפרטורת החדר למשך לא פחות מ -20 דקות ולא יותר מ -30 דקות לפני צנטריפוגה ב -3,000 סל"ד ב RT. להקפיא את דגימות סרום עד assayed בתוך 48 שעות של האוסף.
5. טיפול נתונים
- לאחר הקמת עקומות אינסולין וגלוקוז פלזמה, לקבוע את שיעור סיקול גלוקוז K מן המדרון של הלוג הטבעי של ערכי הסוכר מעל הבסיס 16, 17.
הערה: NHP בריא שניתן לצפות כי יש שיעור סיקול גלוקוז K הרבה מעל 1, לעתים קרובות יותר מ -2 או יותר, כחיה בריאה לעתים קרובות תחזור ערכי סוכר הבסיס שלהם תוך 30 דקות. כמו ייצור אינסולין יורד, שיעור סיקול גלוקוז K ירד יותר דראמטי, נופל מתחת ל -1. - חשב את AUC בכללותו, כסכום של סיכומים של האזור של הטרפזים המייצגים את השטח מתחת לעקומה של כל קטע קו בין נקודות-זמן, באמצעות T30 16, 17.
הערה: באופן מסורתי, AUC של עשר הדקות הראשונות של ההליך נחשב acutדואר תגובת אינסולין לגלוקוז (AIR), בעוד AUC מ -20 הדקות האחרונות של ההליך נחשב תגובת האינסולין מאוחר (LIR). כמו החיה הופכת יותר dysmetabolic, את AUC אינסולין יגדל, המשקף פיצוי בגין הגדלת הרגישות לאינסולין. כמו המעברים לבעלי החיים לסוכרת גלויה, לעומת זאת, AUC יקטן, לעתים קרובות בתחילה בשלב האינסולין החריף, שנתפס על ידי AIR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות מוצגות באיור 1 הם הפגנתיים של עקומות גלוקוז ואינסולין אופייניות קופי cynomolgus בוגרת, בריא סוכרת במהלך של IVGTT 30 דקות. נתוני מקופים סוכרתיים בריאים ומתקדמים מוצגים כדי לעמת ההבדלים הברורים בין בעלי החיים משני הקצוות הקיצוניים של הטווח של אפיון מטבולים. פרוטוקול IVGTT זה שימש בהצלחה על ידי המחברים קופי רזוס עם תוצאות דומות.
צם, ערכי הסוכר הבסיס של קופי בריא (רזוס ו cynomolgus) יכול להיות נמוך כמו 50 עד 60 מ"ג / ד"ל 8. כפי שמודגם באיור, טיול גלוקוז הראשוני - הנמדדים T3 - עבור NHP בריא לא יכול לטפס גבוה ככל ערך גלוקוז בסיס טיפוסי עבור חיית סוכרת, דבר קורה לעתים קרובות העולה על 200 מ"ג / ד"ל. במהלך שלושים הבאיםדקות, הרמות גלוקוז של חיה בריאה לעתים קרובות לחזור ערכי הבסיס שלהם, בעוד dysmetabolic וחי סוכרת לא (איור 1; שורות מוצקות). עקומת האינסולין הנלווית לשנת חיה בריאה מפגינה שתי פסגות (איור 1; קו מקווקו כחול), אשר תואמות את הירידה הראשונית, המהירה ברמת הגלוקוז בדם (שלב 1) בתיווך גדול מרגיל חלק ידי השפעות שנלוות של אינסולין על גלוקוז תחבורה ספיגה 3, 4. עוצמת השפעות שנלוות אלה, אפילו במהלך השלב הראשון של התגובה לאינסולין, אינו שווה את התרומה של הכבד לגלוקוז הורדה, אשר, בתקופת שיא האינסולין השני הקטן יותר אבל יותר וממושך יותר (שלב 2 יש), את ההשפעה הגדולה ביותר על רמות גליקמי באמצעות דיכוי ייצור גלוקוז אנדוגני 1.
כחיה עם התקדמות מן בריא dysmetabolic, יש בדרך כלל הפחתה של הדואר השלב הראשון של תגובת האינסולין אל בולוס דקסטרוז, אשר עשוי לבוא לידי ביטוי אוויר מופחת. עם זאת, AUC עשוי להישאר ללא שינוי, כמו יהיה בתדירות גבוהה יותר להיות עלייה כוללת בייצור אינסולין, מתן הרמות גליקמי במידה רבה ללא שינוי במהלך ההליך כמו ייצור האינסולין המוגבר מפצה על הירידה ברגישות. לאחר חיה הפכה סוכרת גלויה, ייצור אינסולין יורד באופן דראמטי בתגובת בולוס דקסטרוז (איור 1; קו מקווקו אדום). רמות גליקמי יישאר מורם במהלך ההליך, כפי מה סיקול גלוקוז מתרחש כעת מתווכת כמעט לחלוטין על ידי מנגנונים שאינם תלויים-אינסולין (איור 1).
איור 1: עמילות גלוקוז IVGTT והפקת אינסולין Curves עבור סוכרתי ו- Hחיות בקרת ealthy. המוצגות כאן הן גלוקוז (קו מוצק) ואינסולין (קו מקווקו) עקומים עבור (קו כחול) בריא סוכרת (קו אדום) חיות. ערכים אלה הם ממוצעים של נתונים בפועל שנאספו במהלך IVGTTs שבוצע על קופי cynomolgus (גלוקוז סוכרת: n = 27; גלוקוז בריא: n = 21; אינסולין סוכרת: n = 23; אינסולין בריא: n = 20; ברי סטיית התקן מוצגים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שעון זמן | זמן נקודות (דקות) | זמן אמת | דגימת דם הסכום (מ"ל) | Assay לדוגמא | גלוקוז בקריאה מונה (מ"ג / ד"ל) | |
| Baseline | 5 מ"ל | 1.5 מ"ל SST - כימיה 0.5 מ"ל K 2 EDTA - CBC, HbA1c 3 מ"ל K 2 EDTA + 50 prot μl -. גלוקוז, אינסולין, C-פפ | ||||
| 0 | עירוי דקסטרוז 250 מ"ג / ק"ג IV, נתון מעל 30 שניות, ואחריו 5 מ"ל סומק מלוחים הפרין | |||||
| 3 | 2.0 מ"ל | K 2 EDTA + 30 μl Prot .: גלוקוז, Ins, C-פפ | ||||
| 5 | 2.0 מ"ל | K 2 EDTA + 30 μl Prot .: גלוקוז, Ins, C-פפ | ||||
| 7 | 2.0 מ"ל | K 2 EDTA + 30 μl Prot .: גלוקוז, Ins, C-פפ | ||||
| 10 | 2.0 מ"ל | K 2 EDTA + 30 μl Prot .: גלוקוז, Ins, C-פפ | ||||
| 15 | 2.0 מ"ל | K 2 EDTA + 30 μl Prot .: גלוקוז, Ins, C-פפ | ||||
| 20 | 2.0 מ"ל | K 2 EDTA + 30 μl Prot .: גלוקוז, Ins, C-פפ | ||||
| 30 | 2.0 מ"ל | K 2 EDTA + 30 μl Prot .: גלוקוז, Ins, C-פפ | ||||
טבלה 1:. לוח נוהל IVGTT המוצג כאן הוא דו"ח הליך סטנדרטי עבור IVGTT, המפרט את כל המידע הרלוונטי שנתפס במהלך ההליך. פעמים שעוני מדגם שואבת בעקבות דקסטרוזעירוי צריך להיות מחושב מסוף העירוי. זמנים בפועל יש לרשום עבור כל תיקו. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה כמסמך Word של מיקרוסופט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IVGTT מעריך את היכולת של שחרור אינסולין מגורה גלוקוז על ידי עירוי דקסטרוז יחיד המבוסס על משקל גוף 5, 12, 13. מתוך assay, הגלוקוז בדם בצום ורמת אינסולין מושג, והוא מאפשר הערכה של יכולתו של בעל החיים לשחרר אינסולין ולהחזיר את רמת גלוקוז הגבוהה לקראת בסיס. זה מספק למשתמש מידע לאפיין את החיה כמו גלוקוז נורמלי ושליטה בריאה רמת אינסולין, חית dysmetabolic Hyperinsulinemic עם normoglycemia, או חית סוכרת אינסולין עמיד hyperglycemic.
חשוב כי דגימות דם, במיוחד מנקודות הזמן מוקדם, לאחר העירוי של דקסטרוז, נמשכות ומעובד במועד ועקבי. זה יקטין השתנות בתוך ובין נושאים, ולהקטין הזדמנויות שגיאות בסדר הזמניים של הנתונים. העיתוי של T3 היא בעלת חשיבות מכרעת משום o טיולf הגלוקוז בפלסמה מתחילת המחקר עד שלוש דקות לאחר אינפוזיה של דקסטרוז הוא אחד הקצה המשמש לאפיין את המצב המטבולי של החיות. ישנה ירידה בסילוק גלוקוז בתוך 7 ראשון - 10 הדקות לאחר עירוי דקסטרוז, אשר עלול לרדת לטמיון אם אלה הדם שואב לא נלקחים בזמן. זהו האזור תחת החלק הזה של שני גלוקוז עקומות האינסולין משמשת נקודת סיום, תוך שימת דגש על החשיבות של נקודות הזמן המוקדמות אלה. אם תיקו דם לאחר T3 נלקח מאוחר, ההליך יכול להימשך, אך הזמן בפועל של ההגרלה יש לדווח על מנת לשמר את הצורה האמיתית של העקומה ככל האפשר. זה חשוב במיוחד כי סטיות של יותר מדקה ליפול בפח ודיווחה. לאחר אישור העשר דקות, גלוקוז הראשונה נוטה להיות הדרגתי יותר, וייתכן שלא לחזור בסיס תוך 30 דק '(איור 1). ההליך יכול להתארך באמצעות דגימת כל 10 דקות לאחר T30 כדיללכוד כמה זמן לוקח את החיה לחזור לנקודת ההתחלה.
IVGTTs מוגבל על ידי היכולת שלהם ישירות למדוד את רגישות לאינסולין. זה שימושי בעיקר כשיטה להערכת ייצור אינסולין ופינוי גלוקוז. עם זאת, מיצוי אינסולין בכבד מאספקת דם פורטל פשרות מדידות של "הפרשת אינסולין" מאספקת הדם המערכתית. זו ניתן להתגבר חלקית, עם זאת, על ידי מדידת-פפטיד C, אשר מופרש בכמויות equimolar מהלבלב אך היא לא מוסרת על ידי הכבד לפני הכניסה את אספקת הדם הכללית. זה נותן תמונת מצב ברורה של ייצור אינסולין על מנת להעריך טוב יותר β-cell תפקוד 16. כמו כן, IVGTTs אינו מבחין בין מנגנוני תלויית אינסולין של פינוי גלוקוז ומנגנונים שאינם תלויים באינסולין 1, 6. בעוד רגישות לאינסולין ניתן להעריך בעקיפין באמצעות מודל מתמטי מינימאלי של נתונים מתוך IVGTT, אמצעים אמינים יותר יכולים להיות מושגים באמצעות הדואר שימוש בהליכים כגון עירוי גלוקוז מדורגים (GGI), אשר מספק עקומת β-cell מנה-תגובה 14, 15.
עם זאת, הרגישות לאינסולין עדיין נבחנת רק בעקיפין עם GGI. מינון אינסולין רגיל יכול להיות מנוהל על החיה במהלך IVGTT לשפר להערכת הרגישות לאינסולין, אבל זה יהיה מסכה ייצור אינסולין אנדוגני, להתפשר להערכת תפקוד β-cell. Hyperglycemic ואת טכניקות קלאמפ Hyperinsulinemic למדוד ישירות ויסות הגלוקוז באמצעות חשיפת אינסולין מבוקרת. החסרון הוא GGI ואת טכניקות קלאמפ הוא שהם יקרים לבצע ודורשים יותר כוח אדם וזמן כדי להשלים (לפעמים כל עוד שש עד שמונה שעות, בהתאם לעיצוב של ההליכים) 16. IVGTT, מצד שני, יכול להתבצע פחות משעה ועם כוח אדם מינימלי.
באופן כללי, חיים בריאים ייפטרו גלוקוז מהיר מאודly, לעתים קרובות חוזר ערכי הבסיס שלהם בתוך 30 דקות, ולאחר עקומת האינסולין שלהם תפגין שני שיאים ברורים עבור תגובות האינסולין החריפות ומאוחרות. כחיה הופכת יותר dysmetabolic, גלוקוז בצום שלהם טיול הגלוקוז שלהם בשלוש הדקות הראשונות לאחר העירוי עלול להגביר. עם זאת, ערכים אלה יכולים להשתנות במידה רבה בקרב בעלי חיים בריאים, והם הכי אינפורמטיבי של התקדמות מחלה בהשוואת ערכים הסטוריים מאותה החיה. עם זאת, ככלל, אישור גלוקוז של חיה dysmetabolic לא שונה בהרבה כאשר הם היו בריאים. הסימנים הראשונים של התקדמות המחלה הולכים לתת את אותותיהן ביותר עקומת האינסולין. בעוד רמת האינסולין בצום יכולה להיות רק גבוהה מעט, את AUC האינסולין בדרך כלל יגדל באופן דראמטי בחיות dysmetabolic, המשקף פיצוי על חוסר הרגישות לאינסולין מתפתח. כפונקציה β-cell ירידות, אם כי, הקהיה של תגובת האינסולין בשלב החריף ניתן לראות. Tישתקף בתוך AIR ירד, אשר, כאשר מנורמל הבסיס, רשאי לפנות 0 קוף סוכרתי. זה ואחריו ירידה כוללת בייצור האינסולין וירידה דרמטית בסילוק גלוקוז 8, 9, 10, 11.
את המצב המטבולי של חיה יכול להיות קשה לקבוע עם IVGTT יחיד. זה יכול להיות המקרה כאשר מנסים להבדיל חיה כמו גם מוקדם dysmetabolic או טרום סוכרת. כאשר הופכים יותר ויותר dysmetabolic, מגביר ייצור אינסולין כדי לשמור על euglycemia. בעוד ערכי גלוקוז בצום עלולים להיות מעט מורמים, סילוק הגלוקוז לקוי לא מתחזק מאוד עד פונקצית β-cell נפרצה וייצור אינסולין מתחיל לרדת 18, 20. במשך תקופה של זמן, לפני הסוכרת גלויה קבעה, ערכי אינסולין עשוי להיות דומה העקומה של חית dysmetabolic מוקדם שאצלם תגובת השלב הראשונה נפרצת, אבל כמה אינסולין הוא Still שיופק מעל צם, ערכי בסיס. בגלל זה, AUC של עקומת האינסולין של dysmetabolic מוקדם ובעלי חיים prediabetic יכול להיות דומה מאוד. במצב זה, עקום גלוקוז גבוהה, להיות מושפע על ידי שני מנגנונים תלויי האינסולין ולא תלוי אינסולין, אינו מספיק כדי להבחין את החיה כמו גם מוקדם dysmetabolic או טרום סוכרת. הבחנה זו יכולה להיעשות על ידי ביצוע מלחציים Hyperinsulinemic / euglycemic, אשר תדגים את הרגישות לאינסולין ישירות 19. לחלופין, הבחנה זו עשויה להתבצע אחרי שביצעתי אחר IVGTT על החיה לאחר מספר חודשים. במקרה האחרון, אם AUC של העליות העקומות אינסולין, החיה עשויה להיחשב כבר dysmetabolic מוקדם בעת ההליך הראשון. אם AUC פוחתת, לעומת זאת, מעמד dysmetabolic של החיה עשוי להיחשב הועלה / prediabetic בעת האפיון הראשון. מדינה prediabetic יכול להיות גם accompanמטען על ידי ירידה במשקל וגדילת צריכת הנוזלים בתקופת הזמן להתערב ושני הליכי IVGTT. בנסיבות אלו ממחישות מדוע IVGTT הוא כלי שימושי במיוחד כאשר נשקלים לאור היסטוריה של נהלים כאלה להבדיל בשימוש כתמונת מצב של הבריאות של בעל חיים.
שימוש ריסון כיסא עם חיות בהכרה הודגם לייצר העלאה משמעותית ברמות סוכר בדם במהלך הבדיקות סבילות לגלוקוז 25. מסיבה זו, בעלי חיים מורדמים לצורך הליך זה. עם זאת, טיפול חייב להיות מופעל בבחירת ההרדמה. זה כבר דווח כי השימוש אגוניסטים ofα2-adrenoceptor כגון xylazine ו dexmedetomidine להרגעה יכולה להגדיל באופן משמעותי את רמות הגלוקוז בדם אצל פרימטים לא אנושי 17, 21. השיטה דיווחה כאן רק משתמשת קטמין להרגעה, אשר אינו גורם רמות הגלוקוז בדם לעלות 22. בהזדמנות, חיה עשויה להפגיןקשיחות להבחין אצלו באיזו דריכות כך הטכנאי עלול להרגיש להרפיית הכרחית. במקרים כאלה, דיאזפאם ו Telazol הוכחו להיות השפעה הרבה פחות עמוקה על ייצור האינסולין והגלוקוז אז 21 אגוניסטים-adrenoceptor α2. לכן חשוב לשקול את משטר ההרדמה בבדיקות מטבוליות, כגון IVGTT. לסיכום, IVGTT הוא מבחן פונקציה פשוט מטבולית מבוצע באופן שגרתי NHPs, עדיין הוא יכול לספק מידע רב ערך על מנת לסווג חיות בתוך מושבה לתוך מדינות חילוף חומרים שונות, ומכאן ליידע טיפול בבעלי החיים ובריאותם וניהול, כמו גם תועלת הפוטנציאלית שלהם במודלים של מחלות מטבוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מזוהים עם ארגון מחקר חוזה (ביוסיינס קראון) פעיל בתחום מחלות מטבוליות.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות תמיכה חזקה של צוות טיפול בבעלי חיים DHMRI CLAS, מנהל מתקן מר דניאל פרלטה הווטרינר המטפל ד"ר Glicerio איגנסיו, DVM MRCVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-15R Centrifuge | plasma: 4 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Sorvall ST16R Centrifuge | serum: 22 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Thermo Scientific -86 °C Freezer, Forma 88000 Series | Model: 88500A | ||
| Dextrose 50% (D50) | Webster | 07-8008986 | I.V. glucose infusate |
| 3 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | serial blood draws | |
| 5 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | heparinized saline flush | |
| 10 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | delivery of I.V. D50 | |
| Gauze sponges 2 x 2 | Midwest Veterinary Suppy | 366.23000.4 | Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution |
| 4 ml serum separator tubes | Midwest Veterinary Supply | 366.45000.4 | blood collection tube for superchem panel |
| K2EDTA, 2 ml | VWR | 95057-239 | blood collection tubes |
| Aprotinin, 100 mg | Sigma | A1153-100MG | blood collection tube protease additive |
| 22 G x 1" Catheters | Midwest Veterinary Suppy | 193.75250.2 | I.V. catheter |
| Injection Plug W/ Cap | Midwest Veterinary Suppy | 001.11500.2 | %50 dextrose infusion port |
| Porus Tape, 1/2" x 10 yd | Midwest Veterinary Suppy | 001.85000.2 | maintain adherance of catheters and hep. Locks |
| Chlorhexidine Solution 2% | Midwest Veterinary Suppy | 193.08855.3 | prep catheter site |
| 70% Ethanol | VWR | 71001-654 | prep catheter site |
| tourniquet | Webster | 07-8003432 | |
| 3-way stopcock | Midwest Veterinary Supply | 366.28510.4 | hep. lock |
| 37" extension set | Webster | 07-8454200 | hep. lock |
| Exel 50-60cc LL Syringes | Midwest Veterinary Suppy | 001.12250.2 | Heparinized saline flush |
| 250 ml bag 0.9% saline | Webster | 07-8365593 | flush |
| 1,000 U Heparin, 10 ml | Webster | 07-883-4916 | |
| Ketamine (Ketaset) 100 mg/ml | Fort Dodge | (AV ordered) | |
| Precision Xtra glucose test strips 50/bx | Abbott (American Diabetes Wholesale) | 9381599728K7 | test baseline/T3 blood glucose levels |
| Masimo Rad 57 | DRE | 6052057V | pulse-oximeter |
| Pavia rectal thermometer | Patterson | 07-8391335 | |
| Precision Xtra Glucometer | Abbott | 9381599728K7 | Handheld glucometer |
References
- Bergman, R., Phillips, L., Cobelli, C. Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man. J. Clin. Invest. 68, 1456-1457 (1981).
- Bergman, R., Prager, R., Volund, A., Olefsky, J. M. Equivalence of the insulin sensitivity index in man derived by the minimal model and the euglycemic glucose clamp. J. Clin. Invest. 79, 790-800 (1987).
- Hovorka, R., et al. Partitioning glucose distribution/transport, disposal, and endogenous production during IVGTT. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282, E992-E1007 (2002).
- Salinari, S., Guidone, C., Bertuzzi, A., Manco, M., Asnaghi, S., Mingrone, G. First-phase insulin secretion restoration and differential response to glucose load depending on the route of administration in type 2 diabetic subjects after beriatric surgery. Diabetes Care. 32 (3), 375-380 (2009).
- Clinical Diabetes Research: Methods and Techniques. Roden, M. , John Wiley & Sons. (2007).
- Cobelli, C., Pacini, G. Insulin secretion and hepatic extraction in humans by minimal modeling of c-peptide and insulin kinetics. Diabetes. 37, 223-231 (1988).
- Lorenzo, C., et al. Disposition index, glucose effectiveness, and conversion to type 2 diabetes: the insulin resistance atherosclerosis study. Diabetes Care. 33, 2098-2103 (2010).
- Hansen, B. C. Investigation and treatment of type 2 diabetes in nonhuman primates. Methods Mol Biol. 933, 177-185 (2012).
- Hansen, B. C., Bodkin, N. L. Standardization of IVGTT. Importance of method used to calculate glucose disappearance. Diabetes Care. 16 (5), 847 (1993).
- Hardwood, J. H., Listrani, P., Wagner, J. D. Nonhuman primates and other animal models in diabetes research. J Diabetes Sci Tech. 3, 503-514 (2012).
- De Koning, E. J., Bodkin, N. L., Hansen, B. C., Clark, A. Diabetes mellitus in Macaca mulatta monkeys is characterized by islet amyloidosis and reduction in beta-cell population. Diabetologia. 36, 378-384 (1993).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Insulin secretion, clearance and action before and after gastroplasty in severely obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 18, 295-300 (1994).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Postgastroplasty recovery of ideal body weight normalizes glucose and insulin metabolism in obese women. J Clin Endocrinol Metab. 80, 364-369 (1995).
- Kim, S. H., Abbasi, F., Chu, J. W., McLaughlin, T. L., Lamendola, C., Polonsky, K. S., Reaven, G. M. Rosiglitazone reduces glucose-stimulated insulin secretion rate and increases insulin clearance in nondiabetic, insulin-resistant individuals. Diabetes. 54, 2447-2452 (2005).
- Toffolo, G., Breda, E., Cavaghan, M. K., Ehrmann, D. A., Polonsky, K. S., Cobelli, C. Quantitative indexes of beta-cell function during graded up and down glucose infusion from C-peptide minimal models. Am J Physiol Endocrinol Metab. 280, E2-E10 (2001).
- Wang, X., et al. Quantification of beta-cell insulin secretory function using a graded glucose-infusion with C-peptide deconvolution in dysmetabolic, and diabetic cynomolgus monkeys. Diabetology and Metabolic Syn. 5, 40 (2013).
- Xiao, Y. F., Wang, B., Wang, X., Du, F., Benzinou, M., Wang, Y. X. Xylazine-induced reduction of tissue sensitivity to insulin leads to acute hyperglycemia in diabetic and normoglycemic monkeys. Anesthesiology. 13 (33), (2013).
- Porte, D., Kahn, S. β-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes potential mechanisms. Diabetes. 50, Suppl 1. S160-S163 (2001).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), G214-G223 (1979).
- Ferrannini, E., Gastaldelli, A., Miyazaki, Y., Matsuda, M., Mari, A., DeFronzo, R. A. β-cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J Clin Endocrinol Metab. 90 (1), 493-500 (2005).
- Vaughan, K. L., Szarowicz, M. D., Herbert, R. L., Mattison, J. A. Comparison of anesthesia protocols for intravenous glucose tolerance testing in rhesus monkeys. J Med Primatol. 43, 162-168 (2014).
- Kemnitz, J. W., Kraemer, G. W. Assessment of glucoregulation in rhesus monkeys sedated with ketamine. American Journal of Primatology. 3, 201-210 (1982).
- Dutton, C. J., Parvin, C. A., Gronowski, A. M. Measurement of glycated hemoglobin percentages for use in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus in nonhuman primates. Am J Vet Res. 64, 562-568 (2003).
- Rai, V., Iyer, U., Mani, I., Mani, U. V. Serum biochemical changes in insulin dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus and their role in the development of secondary complications. Int J Diab Dev Countries. 17, 33-37 (1997).
- Shirasaki, Y., Yoshioka, N., Kanazawa, K., Maekawa, T., Horikawa, T., Hayashi, T. Effect of physical restraint on glucose tolerance in cynomolgus monkeys. J Med Primatol. 42, 165-168 (2013).
