Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو تقديم الطريقة القياسية لأداء الوريد اختبارات تحمل الغلوكوز (IVGTTs) لتقييم مراقبة نسبة السكر في الدم في الرئيسات من غير البشر وتقييم وضعهم الأيض من الأصحاء للdysmetabolic.
Abstract
اختبار تحمل الجلوكوز في الوريد (IVGTT) يلعب دورا رئيسيا في تحديد خصائص توازن الجلوكوز. عندما تؤخذ جنبا إلى جنب مع لمحات المصل البيوكيميائية، بما في مستويات السكر في الدم في كل من بنك الاحتياطي الفيدرالي وصام الدولة، نسبة HbA1c، ومستويات الانسولين، والتاريخ الطبي من النظام الغذائي، وتكوين الجسم، والجسم الوضع الوزن، وتقييما لمراقبة نسبة السكر في الدم طبيعية وغير طبيعية ويمكن إجراء . ويتم تفسير لIVGTT من خلال قياس التغيرات في مستويات السكر والانسولين مع مرور الوقت فيما يتعلق التحدي الدكستروز. العناصر الأساسية التي يتعين النظر فيها هي: ذروة مستويات السكر والانسولين تم التوصل إليه في ما يتعلق T0 (نهاية ضخ الجلوكوز)، ومعدل إزالة الجلوكوز K المستمدة من المنحدر من إزالة الجلوكوز سريع في دقيقة 20 الأول (T1 إلى T20)، والوقت للعودة إلى خط الأساس الجلوكوز، والمنطقة تحت المنحنى (AUC). ومن شأن هذه التدابير IVGTT تظهر تغييرات مميزة كما يتحرك توازن الجلوكوز من ر صحيالزراعة العضوية المريضة الدولة الأيض 5. هنا سنقوم بشرح توصيف الرئيسيات غير البشرية (قرود المكاك القرد وسينومولوغوس)، والتي هي النموذج الأكثر صلة حيوان من النوع الثاني من مرض السكري (T2D) في البشر وIVGTT وملامح السريرية لهذه الحيوانات من العجاف صحية، لdysmetabolic يعانون من السمنة المفرطة، والدولة 8، 10، 11 T2D.
Introduction
وIVGTT هو فحص وظيفي مناسب يستخدم عادة لتحديد وظيفة β خلايا في البشر في مختلف الدول الأيضية 5 و 7. وفي النماذج الحيوانية من T2D، فمن المعترف بها وكذلك أداة لوصف الحيوانات التي تظهر تطور المرض الأيضي من صحية لdysmetabolic دولة فرط سكر الدم 8 و 9. ويتجلى هذا النموذج أقرب الحيوانات من T2D في الرئيسيات غير البشرية (الرئيسيات)، والتي ريسوس والرباح قرود المكاك هي الأمثلة البارزة. هذه الحيوانات بشكل طبيعي تطوير T2D مع نفس عوامل الخطر من العمر والسمنة تساهم في حدوثه كما في البشر 10. وعلاوة على ذلك، هناك تطور المرض مماثل، وأمراض البنكرياس تظهر رواسب أميلويد كما تقدم المرض dysmetabolic 11.
نحن هنا تقريرا عن الطريقة المعتادة لدينا من إجراء عملية IVGTT في الرئيسيات كجزء من توصيف مستعمرة من الوضع الأيضي في هذه الحيوانات. هذا الأسلوب هومن السهل أن أداء النسبي على الآخرين المزيد من الوقت، وتستهلك وتقنيات مكلفة 2. وIVGTT هو مفيد لوصف مستعمرة كبيرة من الحيوانات بسرعة وبشكل متكرر. عندما تؤخذ بعين الاعتبار مع مستوى الهيموجلوبين السكري (نسبة HbA1c)، والتاريخ والنظام الغذائي والغذاء تناول الحيوان، وكذلك في المئة العجاف كتلة الجسم والدهون، وIVGTT عادة كافية لوصف الوضع الأيضي الحيوان والتقدم نحو السكري العلني 6 8.
يمثل نسبة HbA1c متوسط مستوى السكر في الدم على مدى عمر خلايا الدم الحمراء، وتوفير مقياس موثوق لمستويات السكر على مدى الأسابيع الستة الماضية إلى ثلاثة أشهر. عندما تقاس من صام عينة الدم الأساسي من IVGTT، هذه القيمة توفر نافذة على السيطرة على السكر خلال الأشهر بين الإجراءات. إذا انتقلت الحيوان من dysmetabolic لمرضى السكري منذ IVGTT آخر، وسيكون قيمة نسبة HbA1c أعلى بكثير من قيمتها السابقة تشيرأن التحول بدأ بعد وقت قصير من IVGTT آخر، وحين، قيمة نسبة HbA1c أقرب إلى قيمتها السابقة تشير إلى أن أنها قد انتقلت مؤخرا فقط. بشكل عام، في قرود المكاك ريسوس، نسبة HbA1c القيم أكبر من يعتبرون 6٪ غير طبيعي، وتشير إلى ضعف السيطرة على نسبة السكر في الدم 10، 23.
ينبغي أن تفسر مستويات السكر في الدم ضمن سياق السلوك والصحة العامة للحيوان ككل. قرود المكاك السكري - مثل البشر - فرط الأكل المعرض، عطاش، وبوال. الإسكان مجموعة من الحيوانات يوفر تحديات كبيرة لقياس هذه المؤشرات والرعاية الفردية اللازمة لdysmetabolic والقردة مرضى السكري. نوصي السكن منفردة الحيوانات من أجل أن الرعاية أكثر تخصيصا قد تكون المقدمة، ويتم رصد العلامات السلوكية للصحة القرد أكثر سهولة 8. بالإضافة إلى ذلك، سوف قرود المكاك السكري تظهر خسارة الوزن، فضلا عن ارتفاع مستوى الدهون (زيادةالكولسترول، وزيادة شحوم الدم) واضطراب استقلاب المعادن في الكيمياء في الدم. من المهم قياس علامات الكبد ووظائف الكلى في الكيمياء في الدم، والأضرار التي لحقت هذه الأجهزة غالبا ما تكون مضاعفات دفع الأيض اضطراب / مرض السكري، ويمكن أن يكون شارك في محددات نسبة السكر في الدم، الدهون وعدم التوازن المعدنية 9، 11، 18، 24 .
عند استخدام هذا الأسلوب، والقيم التاريخية ولدت من متعددة، الأوصاف المتكررة على مدى عمر قرد ذات قيمة خاصة. إذا إجراءات أخرى، مثل المشبك الجلوكوز أو السكر في متدرج ضخ (GGI)، وهناك حاجة لإجراء تقييم كامل الصحة حيوان، فمن عادة على توصيف الأولي عندما تاريخهم غير متوفر. IVGTTs ومع ذلك، مرة واحدة وقد تم إنشاء خط الأساس، وكرر من تردد كل ثلاثة أشهر تكفي عادة لتتبع التقدم المحرز الحيوان. وهذا أمر مهم خاصة عندما التحق الحيوانات في دراسات متعددة في جميع أنحاءالسنة التقويمية استنادا إلى وضعهم الأيض. بينما قد تبقى حالتهم الصحية مستقرة نسبيا لسنوات في وقت واحد، عندما يتأزم الوضع الأيضي للحيوان، يمكن أن تحدث زيادة كبيرة في مقاومة الانسولين والجلوكوز التعصب بشكل سريع جدا. قيم نسبة HbA1c تسمح لبعض الاستيفاء من تراجع أو تحسن من الحالة الصحية للحيوان بين الإجراءات المقرر ثلاثة أشهر على حدة. لهذا السبب، وهذه الطريقة مثالية لوصف الحيوانات المستخدمة في عدة دراسات طولية على مدار حياتها الطبيعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل معهد بحوث موردوك ديفيد اتش IACUC تقع في الحرم الجامعي ولاية كارولينا الشمالية بحوث (NCRC)، تحت بروتوكول 14-017، توصيف نموذج الرئيسيات غير البشرية من مرض السكري ومقدمات السكري / مقاومة الانسولين وفعالية العلاجات لتحسين حساسية الأنسولين وظيفة التمثيل الغذائي.
1. اختيار الحيوان وإعداد دراسة
- حدد النظام الغذائي والوزن الحيوانات مستقرة استنادا إلى سجلات الاستهلاك الغذائي ووزن الجسم الشهرية.
لا ينبغي أن تتميز الحيوانات التي عرضت على الانخفاض الأخير في الشهية حتى استقر تناول طعامهم: ملاحظة.- للحيوانات الناضجة (> 5-6 سنة)، عدم تحديد الحيوانات التي تختلف بأكثر من 10٪ دون النظر أولا القرد واستبعاد الأسباب الأخرى من تغيير الوضع الأيضي لتغيير جذري في وزن الأوزان بين أشهر متتالية الجسم.
- لالجلوكوز والأنسولين وج-peptiالتحاليل دي، وإعداد ك 2 EDTA أنابيب جمع العينات مع مثبطات الأنزيم البروتيني (أبروتينين وDPP4I).
ملاحظة: يوفر كوكتيل DPP4I + أبروتينين طائفة واسعة من تثبيط الأنزيم البروتيني ينبغي أن يطلب هذا من أجل التحاليل الإضافية (الجلوكاجون، GLP-1). في حال أن التحاليل الإضافية التي لم تجمع، يجب أن تكون على استعداد للأنابيب الدم في بنفس الطريقة للحفاظ على التناسق في جمع العينات. عينات للفحوصات يتم التحقق من صحة لهذا الأسلوب يجب أن تجمع على حدة، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.- تحضير الكوكتيل مثبط البروتياز عن طريق خلط 100 ملغ مجفف بالتجميد أبروتينين مع 10 مل من DPP4I. إضافة 10 ميكرولتر من خليط أبروتينين + DPP4I إلى كل أنبوب الدم لكل ملليلتر من الدم التي تم جمعها.
- إضافة 10 ميكرولتر إضافية من الكوكتيل مثبط البروتياز إلى كل أنبوب لاحتمال الفائض جمع. تخزين أنابيب المعاملة الدم عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. إبقاء الأنابيب على الجليد الرطب خلال proceduإعادة وتدور في 4 درجات مئوية.
- استخدام أنبوب فاصل مصل لجمع عينة الدم في الأساس لتحليل كيمياء الدم القياسية. لاستكمال عدد خلايا الدم (CBC)، واستخدام معيار ك 2 EDTA دون مثبطات الأنزيم البروتيني. وقد نسج استخدام cryovials إلى البلازما قسامة والمصل بعد عينات الدم باستمرار.
- تسمية أنابيب الدم وcryovials بشكل مناسب مع تحديد الحيوان والتاريخ والإجراء، timepoint، وحجم العينة. تسمية cryovials مع الحليلة (ق) في البلازما لفحص المناسب.
- إعداد تدفق المياه المالحة heparinized عن طريق حقن 0.15 مل من 1،000 وحدة جامعة جنوب المحيط الهادئ في الهيبارين مل في كيس 250 مل من محلول ملحي. الحصول على حل من 0.06 ملغ الهيبارين / مل. رسم 40 - 60 مل من هذا المحلول إلى قفل المالحة للبيغ بين العينات. رسم 1 مل إضافية و 5 مل إلى المحاقن منفصلة لغسل ميناء ضخ سكر العنب قبل وبعد التسريب، على التوالي.
2.التخدير الحيوانية والتحضير
- إزالة الطعام من قفص الحيوان ما لا يقل عن 14 ساعة قبل إجراء العملية، وليس أكثر من 18 ساعة.
ملاحظة: من المهم أن صام الحيوانات لإجراء العملية لتجنب أي تغيير بعد prandial في القيم نسبة السكر في الدم. وإنما هو أيضا الاحتياطات اللازمة لتجنب قلس وتطلع محتويات المعدة في حين تخدير. - الحيوانات وقور لمدة الإجراء IVGTT مع الكيتامين تعطى في العضل كما التخدير العام، في 10 ملغم / كغم. إدارة الكيتامين إضافية (5-10 ملغ / كلغ) على فترات من 20 - 30 دقيقة، أو حسب الحاجة، أثناء العملية.
- وزن الحيوان مخدرا. وضع الحيوان في وضعية الاستلقاء أفقيا على طاولة إجراء ساخنة.
- مراقبة المعلمات السريرية كل 15 إلى 20 دقيقة لضمان الحيوان هو في الطائرة مستقرة من التخدير. قياس معدل ضربات القلب (100-200 نبضة في الدقيقة) ومكتب التخطيط الاستراتيجي 2 (> 92٪) مع مقياس التأكسج النبض. قياس معدل التنفس (20-50 الأنفاس / دقيقة) ث إيث ساعة توقيت، عد التنفس بصريا أو باليد أكثر من خمسة عشر ثانية، وضرب من قبل أربعة. درجة الحرارة قياس (> 97 ° F) عن طريق المستقيم. مراقبة لون الغشاء المخاطي حول اللثة والشفتين (رطبة والوردي).
- إعداد موقعين قنية. استخدام الشعر كليبرز لتقليم الشعر من منطقة ذات أهمية حيث سيتم ادخال القسطرة، وتعقيم المنطقة بأسرها بالتناوب مع الدعك من الكلورهيكسيدين و 70٪ كحول.
- وضع قسطرة واحدة في منطقة عروق اليمين أو اليسار رأسي أو الصافن وإرفاقه مطاردة الهيبارين المالحة (0.06 ملغ الهيبارين / مل) مع ثلاثي محبس. هذا هو أخذ العينات موقع سحب الدم.
- وضع القسطرة الثانية في الساق آخر أو تسليحها في منطقة عروق رأسي أو الصافن وإرفاق الميناء. استخدام هذا الموقع لتسريب الدكستروز. استخدام صغيرة، 1 مل دافق من المياه المالحة heparinized للحفاظ على البراءة قنية قبل ضخ الدكستروز.
ملاحظة: الإجراء IVGTT يتكون من 8 عينات سحب الدم مرة نقاط (الجدول 1).
- أخذ عينة خط الأساس واستخدام غلوكمتر باليد لقياس مستوى السكر في الدم الصيام. الحصول على عينة مصل الدم لتحليل الكيمياء القياسية، وكذلك عينة دم كاملة CBC لمن أجل تقييم الصحة العامة للحيوان. جمع عينات البلازما لفحص مستويات الجلوكوز والأنسولين من العينة الأساسية باستخدام مجموعة التحقق من صحتها للاستخدام مع قرود المكاك وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 8 و 9.
ملاحظة: من المهم أن يكون ما قبل التعادل من 0.5 مل مأخوذة من قنية قبل اتخاذ أي عينة لجمع الدم لإزالة بقايا الدم أو الهيبارين في الفضاء الميت من قنية. - بعد الحصول على عينة خط الأساس، ولبث جرعة من 50٪ سكر العنب (250 ملغ / كغ) أكثر من 30 ثانية إلى ميناء ضخ الدكستروز.
ملاحظة: نماذج الجرعة العالية (500 ملجم / كجم) يمكن استخدامها،على الرغم من أن جرعة ينبغي أن تكون ثابتة عبر إجراءات من أجل إجراء مقارنات الطولية.- مسح ميناء التسريب مع 5 مل من المياه المالحة heparinized للتأكد من أنه لا يوجد أي سكر العنب اليسار في الميناء. نهاية التسريب هو T0. هل لديك فني محل قفازات، وسكر العنب المتبقية من التسريب قد تلوث عينات من الدم لاحقة.
- أول ما بعد ضخ نقطة زمنية العينة في T3 دقيقة من نهاية ضخ سكر العنب، تليها T5 دقيقة، T7 دقيقة، T10 دقيقة، T15 دقيقة، T20 دقيقة، وآخر نقطة زمنية العينة في T30 دقيقة. جمع البلازما من كل timepoint إلى الجلوكوز فحص ومستويات الانسولين مع عينة خط الأساس (راجع الخطوة 3.1).
- في T3 دقيقة نقطة زمنية، استخدم غلوكمتر باليد للتأكد مرة أخرى من مستوى السكر في الدم.
ملاحظة: قراءات غلوكمتر في الأساس وT3 هي فقط لتأكيد ضخ سكر العنب. ينبغي أن يكون مستوى السكر في الدم في T3 دقيقة نقطة زمنية ~ 100 ملغ / دل أعلى التعاونmpared إلى مستوى الجلوكوز في البلازما الصيام الأساس.
- في T3 دقيقة نقطة زمنية، استخدم غلوكمتر باليد للتأكد مرة أخرى من مستوى السكر في الدم.
4. استعادة الحيوانية وتجهيز العينات
- إزالة قنية وممارسة الضغط على المواقع مقسطر عن الارقاء بعد T30 دقيقة وقت نقطة. مراقبة الحيوانات حتى استعاد وعيه والجلوس. وتعافى تماما تغذية عرض مرة واحدة الحيوان.
- المكان على الفور كل عينة دم كاملة إلى K 2 أنابيب EDTA على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة 4 درجات مئوية في غضون 10 دقيقة من جمع. عينات قسامة البلازما في cryovials، تجميد وتخزين في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
- السماح للالدم في أنبوب المصل لتحليل كيمياء الدم القياسية للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 20 دقيقة ولا تزيد عن 30 دقيقة قبل الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة في RT. تجميد عينات المصل حتى يعاير خلال 48 ساعة من جمعها.
ملاحظة: بردت عينات الدم التي تم جمعها كلها لتحليل CBC حتى وقتسيد خلال 24 ساعة من جمعها.
- السماح للالدم في أنبوب المصل لتحليل كيمياء الدم القياسية للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 20 دقيقة ولا تزيد عن 30 دقيقة قبل الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة في RT. تجميد عينات المصل حتى يعاير خلال 48 ساعة من جمعها.
5. معالجة البيانات
- بعد إنشاء الانسولين البلازما والجلوكوز منحنيات، وتحديد معدل إزالة الجلوكوز K من منحدر سجل الطبيعي للقيم الجلوكوز فوق خط الأساس 16، 17.
ملاحظة: قد يكون من المتوقع أن يكون معدل إزالة الجلوكوز K أعلى بكثير من 1، غالبا ما تكون أكبر من 2 أو أكثر، وصحة الحيوان، وغالبا ما يعود إلى قيمها الجلوكوز الأساس في غضون 30 دقيقة وNHP صحي. ومع انخفاض إنتاج الأنسولين الخروج، فإن معدل إزالة الجلوكوز K إسقاط أكثر بشكل كبير، وانخفاض أقل من 1. - حساب مفوضية الاتحاد الأفريقي ككل، كمجموع مجاميع منطقة شبه المنحرف تمثل المنطقة تحت المنحنى لكل قطعة مستقيمة بين الساعة نقاط، من خلال T30 16 و 17.
ملاحظة: تقليديا، يعتبر الجامعة الأمريكية بالقاهرة من الدقائق العشر الأولى من الإجراء acutالبريد استجابة الأنسولين للجلوكوز (AIR)، في حين أن الجامعة الأمريكية بالقاهرة من دقيقة 20 الأخير من الإجراء يعتبر استجابة أواخر الأنسولين (LIR). كما يصبح الحيوان أكثر dysmetabolic، فإن الجامعة الأمريكية بالقاهرة الأنسولين يزيد، والتي تعكس التعويض عن زيادة حساسية الأنسولين. كما أن التحولات الحيوان لمرض السكري الصريح، ومع ذلك، فإن الجامعة الأمريكية بالقاهرة الانخفاض، في كثير من الأحيان في البداية في مرحلة الأنسولين الحادة، التي تم التقاطها بواسطة الهواء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتبين النتائج الموضحة في الشكل رقم 1 هي برهانية من نموذجية الجلوكوز والأنسولين منحنيات من قرود المكاك الرباح ناضجة وصحية لمرضى السكري وعلى مدار IVGTT 30 دقيقة. وتظهر بيانات من القرود السكري صحية والمتقدمة وذلك لتباين واختلافات واضحة بين الحيوانات من طرفي المتطرفة من مجموعة من توصيف الأيض. وقد استخدم هذا البروتوكول IVGTT بنجاح من قبل المؤلفين في قرود المكاك ريسوس مع نتائج مماثلة.
ووالقيم الجلوكوز الأساسية صام من قرود المكاك صحية (ريسوس والرباح) يمكن أن يكون ما يصل الى 50-60 ملغ / دل 8. كما هو موضح في الشكل، رحلة الجلوكوز الأولية - قياس في T3 - لNHP صحية قد لا تسلق مرتفعا كما بقيمة الجلوكوز الأساسية النموذجية للحيوان السكري، والتي هي في كثير من الأحيان ما يزيد على 200 ملغم / دل. وعلى مدار الثلاثين التاليةدقيقة، ومستويات الجلوكوز لصحة الحيوان، غالبا ما يعود إلى القيم الأساسية، في حين dysmetabolic والحيوانات السكري لا (الشكل 1؛ خطوط الصلبة). منحنى الأنسولين المصاحبة لصحة الحيوان المعارض قمتين (الشكل 1؛ متقطع الخط الأزرق)، والتي تتوافق مع انخفاض أولي وسريع في مستوى السكر في الدم (المرحلة 1) توسط في جزء أكبر من المعتاد من آثار هامشية من الأنسولين على سكر الدم نقل وامتصاص 3 و 4. إن حجم هذه التأثيرات المحيطية، حتى خلال المرحلة الأولى من الاستجابة للأنسولين، لا يساوي مساهمة في الكبد إلى جلوكوز خفض، والتي، في ذروة الأنسولين الثانية أصغر ولكن أكثر استدامة (المرحلة 2 )، لديه أكبر الأثر على مستويات السكر في الدم عن طريق قمع إنتاج السكر في الذاتية 1.
كما تقدم حيوان من الأصحاء للdysmetabolic، هناك عادة انتقاص من الالمرحلة الأولى من البريد استجابة الأنسولين إلى سكر العنب بلعة، الذي قد ينعكس في انخفاض AIR. ومع ذلك، قد تبقى الجامعة الأمريكية دون تغيير، كما سيكون هناك أكثر في كثير من الأحيان زيادة إجمالية في إنتاج الأنسولين، الذي ينص على مستويات السكر في الدم دون تغيير إلى حد كبير على مدى الإجراء كما يعوض زيادة إنتاج الأنسولين لانخفاض حساسية. مرة واحدة حيوان أصبح السكري بشكل علني، إنتاج الأنسولين انخفاض كبير في استجابة لبلعة سكر العنب (الشكل 1؛ متقطع خط أحمر). سوف تظل مستويات السكر في الدم مرتفعة على مدى الإجراء، لأن ما يحدث إزالة الجلوكوز بوساطة الآن بالكامل تقريبا من خلال آليات غير المعتمد على الأنسولين (الشكل 1).
الشكل 1: IVGTT الجلوكوز التخليص وإنتاج الأنسولين لمرضى السكري المنحنيات وHالحيوانات تحكم ealthy. يظهر هنا هي الجلوكوز (خط الصلبة) والانسولين (خط متقطع) منحنيات لصحي (الخط الأزرق) والسكري (خط أحمر) الحيوانات. هذه القيم هي متوسطات من البيانات الفعلية التي تم جمعها خلال IVGTTs أجريت على قرود المكاك الرباح (الجلوكوز السكري: ن = 27؛ الجلوكوز صحي: ن = 21؛ الأنسولين لمرضى السكري: ن = 23؛ الأنسولين صحي: ن = 20؛ أشرطة الخطأ المعياري معروضة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عداد زمني، موقت | نقاط الوقت (دقيقة) | في الوقت الحالى | كمية عينة الدم (مل) | الفحص عينة | الجلوكوز قراءة العداد (ملغم / دل) | |
| خط الأساس | 5 مل | 1.5 مل طائرة أسرع من الصوت - الكيمياء 0.5 مل ك 2 EDTA - CBC، نسبة HbA1c 3 مل ك 2 EDTA + 50 ميكرولتر بروت - الجلوكوز والأنسولين، C-بيب | ||||
| 0 | سكر العنب ضخ 250 ملغ / كغ الرابع، نظرا أكثر من 30 ثانية، تليها 5 مل الهيبارين تدفق المياه المالحة | |||||
| 3 | 2.0 مل | ك 2 EDTA + 30 ميكرولتر بروت: الجلوكوز، الوظائف، C-بيب | ||||
| 5 | 2.0 مل | ك 2 EDTA + 30 ميكرولتر بروت: الجلوكوز، الوظائف، C-بيب | ||||
| 7 | 2.0 مل | ك 2 EDTA + 30 ميكرولتر بروت: الجلوكوز، الوظائف، C-بيب | ||||
| 10 | 2.0 مل | ك 2 EDTA + 30 ميكرولتر بروت: الجلوكوز، الوظائف، C-بيب | ||||
| 15 | 2.0 مل | ك 2 EDTA + 30 ميكرولتر بروت: الجلوكوز، الوظائف، C-بيب | ||||
| 20 | 2.0 مل | ك 2 EDTA + 30 ميكرولتر بروت: الجلوكوز، الوظائف، C-بيب | ||||
| 30 | 2.0 مل | ك 2 EDTA + 30 ميكرولتر بروت: الجلوكوز، الوظائف، C-بيب | ||||
الجدول 1: IVGTT الإجراءات الجدول يظهر هنا هو تقرير الإجراء القياسي لIVGTT، بالتفصيل جميع المعلومات ذات الصلة استولي عليه خلال العملية. مرات على مدار الساعة لعينة توجه عقب سكر العنبينبغي أن تحسب ضخ من نهاية الحقن في الوريد. يجب أن تسجل الأوقات الفعلية لكل التعادل. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول على النحو مستند Microsoft Word.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وIVGTT يقيم قدرة اطلاق الانسولين حفز الجلوكوز من خلال ضخ الدكستروز واحد على أساس وزن الجسم 5 و 12 و 13. من الفحص، وتحقيق نسبة الجلوكوز في الدم أثناء الصيام ومستوى الأنسولين، وأنه يسمح بتقييم قدرة الحيوان ل الافراج عن الانسولين ويعود مستوى الجلوكوز المرتفع نحو خط الأساس. هذا يوفر للمستخدم مع المعلومات لوصف حيوان هو والجلوكوز العادي ومراقبة صحية مستوى الأنسولين، وهو حيوان dysmetabolic hyperinsulinemic مع سوائية سكر الدم، أو فرط سكر الدم ومقاومة للأنسولين الحيوان السكري.
من المهم أن عينات الدم، وخاصة من النقاط وقت مبكر، بعد ضخ سكر العنب، يتم رسمها ومعالجتها في الوقت المناسب وبطريقة متسقة. وهذا سوف يقلل التباين داخل وبين الموضوعات، وتقليل فرص الأخطاء في النظام الزمني للبيانات. توقيت T3 له أهمية حاسمة لأن رحلة سو بلازما الجلوكوز من خط الأساس إلى ثلاث دقائق بعد ضخ سكر العنب هي واحدة من نقاط النهاية التي تستخدم لوصف الوضع الأيضي للحيوانات. هناك تراجعا في إزالة الجلوكوز في أول 7 - 10 دقيقة بعد ضخ سكر العنب، والتي قد تضيع إذا كانت تلك الدماء توجه لايتم في الوقت المحدد. وهذه هي المنطقة الواقعة تحت هذا جزء من كل من الجلوكوز والأنسولين المنحنيات التي يتم استخدامها بمثابة نقطة النهاية، مؤكدا على أهمية هذه النقاط مرة الأولى. إذا اتخذ سحب الدم بعد T3 في وقت متأخر، يمكن إجراء تستمر، ولكن ينبغي الإبلاغ عن الوقت الفعلي للتعادل من أجل الحفاظ على الشكل الحقيقي للمنحنى قدر الإمكان. ومن الأهمية بمكان أن الانحرافات أكثر من دقيقة يتم القبض والإبلاغ عنها. بعد الدقائق العشر الأولى، وإزالة الجلوكوز تميل إلى أن تصبح أكثر تدرجا، وربما لن يعود إلى خط الأساس في غضون 30 دقيقة (الشكل 1). ويمكن تمديد هذا الإجراء عن طريق أخذ عينات كل 10 دقيقة بعد T30 لالقبض على الزمن الذي يستغرقه الحيوان للعودة إلى خط الأساس.
IVGTTs محدودة بسبب قدرتها على قياس مباشرة الحساسية للانسولين. ومن المفيد في المقام الأول كوسيلة لتقييم إنتاج الأنسولين وإزالة الجلوكوز. ومع ذلك، واستخراج الأنسولين كبدي من العرض المدخل الدم يهدد قياسات "إفراز الأنسولين" من إمدادات الدم النظامية. هذا يمكن التغلب عليها جزئيا، مع ذلك، عن طريق قياس ج الببتيد، الذي يفرز بكميات متساوي المولية من البنكرياس ولكن لم يتم إزالتها عن طريق الكبد قبل دخول إمدادات الدم العام. وهذا يعطي صورة أوضح لإنتاج الأنسولين لتقييم أفضل وظيفة خلايا بيتا 16. أيضا، IVGTTs لا تميز بين آليات المعتمد على الأنسولين من إزالة الجلوكوز وغير المعتمد على الأنسولين آليات تعتمد 1، 6، بينما الحساسية للانسولين قد يتم تقييم بشكل غير مباشر من خلال النمذجة الحد الأدنى من البيانات من IVGTT، لا يمكن أن يتحقق تدابير أكثر موثوقية من خلال الاستخدام البريد من الإجراءات مثل متدرج الجلوكوز تسريب (GGI)، الذي يوفر منحنى β خلايا الاستجابة للجرعة 14 و 15.
ومع ذلك، حساسية الأنسولين لا يزال يقيم بشكل غير مباشر مع GGI. جرعة الأنسولين القياسية يمكن أن تدار على الحيوان خلال IVGTT لتحسين تقدير حساسية الأنسولين، ولكن هذا سوف تحجب إنتاج الأنسولين الذاتية، وتقييم وظيفة β خلايا المساومة. وفرط سكر الدم وتقنيات Hyperinsulinemic المشبك قياس تنظيم الجلوكوز مباشرة عبر التعرض الأنسولين التي تسيطر عليها. العيب على كل من GGI وتقنيات المشبك هو أن تكون مكلفة لأداء وتتطلب المزيد من الموظفين والوقت لاستكمال (في بعض الأحيان ما دام ستة إلى ثمانية ساعة، اعتمادا على تصميم الإجراءات) 16. وIVGTT، من ناحية أخرى، لا يمكن أن يؤديها أقل من ساعة ومع الحد الأدنى من القوى العاملة.
عموما، فإن صحة الحيوان، التخلص من الجلوكوز سريع جدالاي، في كثير من الأحيان العودة إلى القيم الأساسية في غضون 30 دقيقة، وسوف منحنى الأنسولين تظهر قمتين متميزة للردود الأنسولين الحادة والمتأخرة. كما يصبح حيوانا أكثر dysmetabolic، الجلوكوز صام ورحلة الجلوكوز في الدقائق الثلاث الأولى بعد الحقن قد يزيد. ومع ذلك، قد تختلف هذه القيم على نطاق واسع بين الحيوانات السليمة، وهي أكبر قدر من المعلومات من تطور المرض بالمقارنة مع القيم التاريخية من نفس الحيوان. عموما، ومع ذلك، فإن إزالة الجلوكوز من حيوان dysmetabolic قد لا تختلف كثيرا فيما بعد عندما كانوا في صحة جيدة. أولى بوادر تطور المرض ستكون أكثر وضوحا في منحنى الأنسولين. في حين أن مستوى الأنسولين صام قد تكون فقط مرتفع بشكل معتدل، ومفوضية الاتحاد الأفريقي الأنسولين تزيد عادة بشكل كبير في الحيوانات dysmetabolic، مما يعكس تعويضا عن عدم حساسية الانسولين النامية. كما انخفاض وظيفة β-خلية، على الرغم من يمكن أن ينظر إليها على تصد للاستجابة الأنسولين المرحلة الحادة. توسوف تنعكس له في الهواء انخفض، الذي، عندما تطبيع الأساس، قد نقترب 0 في قرد السكري. ويعقب ذلك حدوث انخفاض عام في إنتاج الأنسولين وانخفاضا كبيرا في إزالة الجلوكوز 8، 9، 10، 11.
الوضع الأيضي للحيوان قد يكون من الصعب تحديد مع IVGTT احد. وهذا يمكن أن يكون عليه الحال عند محاولة التمييز حيوان إما dysmetabolic المبكر أو ما قبل السكري. عندما تصبح تدريجيا أكثر dysmetabolic، ويزيد من انتاج الانسولين للحفاظ على سوائية سكر الدم. بينما القيم الجلوكوز صام قد تصبح مرتفعة قليلا، لا تصبح ضعف التخلص من الجلوكوز واضح جدا حتى تم اختراق وظيفة β-الخلايا وإنتاج الأنسولين يبدأ في الانخفاض 18 و 20. لفترة من الزمن، قبل أن يحل السكري العلني في والقيم الانسولين قد يشبه منحنى حيوان dysmetabolic في وقت مبكر من الذين تم اختراق الاستجابة المرحلة الأولى، ولكن بعض الانسولين هو STIليرة لبنانية يتم إنتاجها فوق القيم صام، خط الأساس. وبسبب هذا، والجامعة الأمريكية بالقاهرة من منحنى الأنسولين من dysmetabolic المبكر والحيوان prediabetic يمكن أن تكون مشابهة جدا. في هذه الحالة، منحنى الجلوكوز المرتفعة، التي تتأثر كلا آليات المعتمد على الأنسولين وغير المعتمد على الأنسولين، ليس كافيا لتمييز الحيوان إما dysmetabolic المبكر أو ما قبل السكري. قد يكون هذا التمييز عن طريق إجراء / المشبك سوي سكر الدم hyperinsulinemic، والتي سوف تظهر مباشرة الحساسية للانسولين 19. بدلا من ذلك، قد يكون هذا التمييز على أداء IVGTT آخر على الحيوان بعد عدة أشهر. في الحالة الأخيرة، إذا مفوضية الاتحاد الأفريقي للزيادات منحنى الأنسولين، والحيوان ويمكن اعتبار أنه قد تم dysmetabolic في وقت مبكر في وقت الإجراء الأول. إذا يقلل من الجامعة الأمريكية بالقاهرة، ومع ذلك، يمكن اعتبار وضع dysmetabolic الحيوان قد تقدمت / prediabetic في وقت توصيف الأول. ويمكن أيضا أن accompan والدولة prediabeticالعبوات الناسفة التي كتبها فقدان الوزن وزيادة تناول السوائل خلال فترة من الزمن التدخل الإجراءات IVGTT اثنين. هذه الظروف توضح لماذا IVGTT هو أداة مفيدة بشكل خاص عند النظر في ضوء تاريخ هذه الإجراءات بدلا من كونها تستخدم لقطة من صحة الحيوان.
وقد ثبت استخدام كرسي ضبط النفس مع الحيوانات واعية لإنتاج ارتفاع كبير في مستويات السكر في الدم خلال تحمل الغلوكوز اختبار 25. لهذا السبب، مخدرا الحيوانات لهذا الإجراء. ومع ذلك، لا بد من توخي الحذر في اختيار مخدر. وقد أفيد أن استخدام ofα2-الأدرينية منبهات مثل زيلازين وديكسميديتوميدين عن التخدير يمكن أن تزيد بشكل كبير من مستويات السكر في الدم في الرئيسيات غير البشرية 17 و 21. طريقة ذكرت هنا يستخدم فقط الكيتامين للتخدير، والذي لا يسبب مستويات السكر في الدم في الارتفاع 22. في بعض الأحيان، قد يحمل حيوانهذه الصلابة وتوتير التي قد يشعر فني المرخي ضرورية. في مثل هذه الحالات، أثبتت ديازيبام وTelazol أن يكون لها تأثير أقل عمقا بكثير على إنتاج الأنسولين وأيض الجلوكوز ثم منبهات α2-الأدرينية 21. ومن ثم فمن المهم النظر في نظام مخدر في اختبارات التمثيل الغذائي، مثل IVGTT. وباختصار، فإن IVGTT هو اختبار بسيط وظيفة التمثيل الغذائي التي يتم تنفيذها بشكل روتيني في الرئيسيات، إلا أنها يمكن أن توفر معلومات قيمة لتصنيف الحيوانات داخل مستعمرة في الدول الأيض المختلفة، وبالتالي إبلاغ رعايتهم الحيوانية والإدارة الصحية، فضلا عن فائدتها المحتملة في نماذج من أمراض التمثيل الغذائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وينتمي الكتاب مع منظمة أبحاث العقد (ولي العهد العلوم البيولوجية) النشطة في مجال أمراض التمثيل الغذائي.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن نشيد بالدعم القوي من موظفي رعاية الحيوانات DHMRI CLAS، مدير مرفق السيد دانيال بيرالتا وحضور الطبيب البيطري الدكتور Glicerio اجناسيو، DVM MRCVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-15R Centrifuge | plasma: 4 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Sorvall ST16R Centrifuge | serum: 22 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Thermo Scientific -86 °C Freezer, Forma 88000 Series | Model: 88500A | ||
| Dextrose 50% (D50) | Webster | 07-8008986 | I.V. glucose infusate |
| 3 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | serial blood draws | |
| 5 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | heparinized saline flush | |
| 10 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | delivery of I.V. D50 | |
| Gauze sponges 2 x 2 | Midwest Veterinary Suppy | 366.23000.4 | Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution |
| 4 ml serum separator tubes | Midwest Veterinary Supply | 366.45000.4 | blood collection tube for superchem panel |
| K2EDTA, 2 ml | VWR | 95057-239 | blood collection tubes |
| Aprotinin, 100 mg | Sigma | A1153-100MG | blood collection tube protease additive |
| 22 G x 1" Catheters | Midwest Veterinary Suppy | 193.75250.2 | I.V. catheter |
| Injection Plug W/ Cap | Midwest Veterinary Suppy | 001.11500.2 | %50 dextrose infusion port |
| Porus Tape, 1/2" x 10 yd | Midwest Veterinary Suppy | 001.85000.2 | maintain adherance of catheters and hep. Locks |
| Chlorhexidine Solution 2% | Midwest Veterinary Suppy | 193.08855.3 | prep catheter site |
| 70% Ethanol | VWR | 71001-654 | prep catheter site |
| tourniquet | Webster | 07-8003432 | |
| 3-way stopcock | Midwest Veterinary Supply | 366.28510.4 | hep. lock |
| 37" extension set | Webster | 07-8454200 | hep. lock |
| Exel 50-60cc LL Syringes | Midwest Veterinary Suppy | 001.12250.2 | Heparinized saline flush |
| 250 ml bag 0.9% saline | Webster | 07-8365593 | flush |
| 1,000 U Heparin, 10 ml | Webster | 07-883-4916 | |
| Ketamine (Ketaset) 100 mg/ml | Fort Dodge | (AV ordered) | |
| Precision Xtra glucose test strips 50/bx | Abbott (American Diabetes Wholesale) | 9381599728K7 | test baseline/T3 blood glucose levels |
| Masimo Rad 57 | DRE | 6052057V | pulse-oximeter |
| Pavia rectal thermometer | Patterson | 07-8391335 | |
| Precision Xtra Glucometer | Abbott | 9381599728K7 | Handheld glucometer |
References
- Bergman, R., Phillips, L., Cobelli, C. Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man. J. Clin. Invest. 68, 1456-1457 (1981).
- Bergman, R., Prager, R., Volund, A., Olefsky, J. M. Equivalence of the insulin sensitivity index in man derived by the minimal model and the euglycemic glucose clamp. J. Clin. Invest. 79, 790-800 (1987).
- Hovorka, R., et al. Partitioning glucose distribution/transport, disposal, and endogenous production during IVGTT. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282, E992-E1007 (2002).
- Salinari, S., Guidone, C., Bertuzzi, A., Manco, M., Asnaghi, S., Mingrone, G. First-phase insulin secretion restoration and differential response to glucose load depending on the route of administration in type 2 diabetic subjects after beriatric surgery. Diabetes Care. 32 (3), 375-380 (2009).
- Clinical Diabetes Research: Methods and Techniques. Roden, M. , John Wiley & Sons. (2007).
- Cobelli, C., Pacini, G. Insulin secretion and hepatic extraction in humans by minimal modeling of c-peptide and insulin kinetics. Diabetes. 37, 223-231 (1988).
- Lorenzo, C., et al. Disposition index, glucose effectiveness, and conversion to type 2 diabetes: the insulin resistance atherosclerosis study. Diabetes Care. 33, 2098-2103 (2010).
- Hansen, B. C. Investigation and treatment of type 2 diabetes in nonhuman primates. Methods Mol Biol. 933, 177-185 (2012).
- Hansen, B. C., Bodkin, N. L. Standardization of IVGTT. Importance of method used to calculate glucose disappearance. Diabetes Care. 16 (5), 847 (1993).
- Hardwood, J. H., Listrani, P., Wagner, J. D. Nonhuman primates and other animal models in diabetes research. J Diabetes Sci Tech. 3, 503-514 (2012).
- De Koning, E. J., Bodkin, N. L., Hansen, B. C., Clark, A. Diabetes mellitus in Macaca mulatta monkeys is characterized by islet amyloidosis and reduction in beta-cell population. Diabetologia. 36, 378-384 (1993).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Insulin secretion, clearance and action before and after gastroplasty in severely obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 18, 295-300 (1994).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Postgastroplasty recovery of ideal body weight normalizes glucose and insulin metabolism in obese women. J Clin Endocrinol Metab. 80, 364-369 (1995).
- Kim, S. H., Abbasi, F., Chu, J. W., McLaughlin, T. L., Lamendola, C., Polonsky, K. S., Reaven, G. M. Rosiglitazone reduces glucose-stimulated insulin secretion rate and increases insulin clearance in nondiabetic, insulin-resistant individuals. Diabetes. 54, 2447-2452 (2005).
- Toffolo, G., Breda, E., Cavaghan, M. K., Ehrmann, D. A., Polonsky, K. S., Cobelli, C. Quantitative indexes of beta-cell function during graded up and down glucose infusion from C-peptide minimal models. Am J Physiol Endocrinol Metab. 280, E2-E10 (2001).
- Wang, X., et al. Quantification of beta-cell insulin secretory function using a graded glucose-infusion with C-peptide deconvolution in dysmetabolic, and diabetic cynomolgus monkeys. Diabetology and Metabolic Syn. 5, 40 (2013).
- Xiao, Y. F., Wang, B., Wang, X., Du, F., Benzinou, M., Wang, Y. X. Xylazine-induced reduction of tissue sensitivity to insulin leads to acute hyperglycemia in diabetic and normoglycemic monkeys. Anesthesiology. 13 (33), (2013).
- Porte, D., Kahn, S. β-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes potential mechanisms. Diabetes. 50, Suppl 1. S160-S163 (2001).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), G214-G223 (1979).
- Ferrannini, E., Gastaldelli, A., Miyazaki, Y., Matsuda, M., Mari, A., DeFronzo, R. A. β-cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J Clin Endocrinol Metab. 90 (1), 493-500 (2005).
- Vaughan, K. L., Szarowicz, M. D., Herbert, R. L., Mattison, J. A. Comparison of anesthesia protocols for intravenous glucose tolerance testing in rhesus monkeys. J Med Primatol. 43, 162-168 (2014).
- Kemnitz, J. W., Kraemer, G. W. Assessment of glucoregulation in rhesus monkeys sedated with ketamine. American Journal of Primatology. 3, 201-210 (1982).
- Dutton, C. J., Parvin, C. A., Gronowski, A. M. Measurement of glycated hemoglobin percentages for use in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus in nonhuman primates. Am J Vet Res. 64, 562-568 (2003).
- Rai, V., Iyer, U., Mani, I., Mani, U. V. Serum biochemical changes in insulin dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus and their role in the development of secondary complications. Int J Diab Dev Countries. 17, 33-37 (1997).
- Shirasaki, Y., Yoshioka, N., Kanazawa, K., Maekawa, T., Horikawa, T., Hayashi, T. Effect of physical restraint on glucose tolerance in cynomolgus monkeys. J Med Primatol. 42, 165-168 (2013).
