Summary
Bu protokolün amacı, insan dışı primatlarda glisemik kontrolü değerlendirmek ve dismetabolik sağlıklı onların metabolik durumunu değerlendirmek için intravenöz glikoz tolerans testi (IVGTT'ler) gerçekleştirmek için standart bir yöntem sunmaktır.
Abstract
İntravenöz glikoz tolerans testi (IVGTT) glikoz dengesinin karakterizasyonu önemli bir rol oynar. serum biyokimyasal profilleri, hem beslenen kan glikoz seviyelerinin kapsayıcı ve açlık durumunda, HbA1c, insülin düzeyleri, diyet klinik öykü, vücut kompozisyonu ve vücut ağırlığı durumu, normal ve anormal glisemik kontrolün değerlendirilmesi ile birlikte alındığında yapılabilir . Bir IVGTT'nin yorumlanması dekstroz meydan ilişkin zamanla kan şekeri ve insülin düzeylerinde değişiklikler ölçümü ile yapılır. Dikkate alınması gereken kritik bileşenleri şunlardır: T0 (glikoz infüzyon sonu), ilk 20 dakika içinde hızlı glikoz temizlenmesi eğiminden elde edilen glukoz temizlenme oranı K (T20 T1), zamana göre ulaşılan zirve glikoz ve insülin düzeyleri glikoz taban dönmek için, ve eğri (AUC) altındaki alan. Bu İVGTT önlemler sağlıklı bir t glikoz homeostasis hareket ettikçe karakteristik değişiklikler gösteriroa hastalıklı metabolik durumu 5. Bu yazıda gelen insanlarda Tip II diyabet (T2D) en alakalı hayvan modeli ve İVGTT ve bu hayvanların klinik profilleri insan dışı primatlarda (Rhesus ve sinomolgus makakları), karakterizasyonu anlatacağım bir obez dismetabolik için, sağlıklı yalın, ve T2D devlet 8, 10, 11.
Introduction
IVGTT rutin farklı metabolik Devletleri 5 7 insanlarda β-hücresi fonksiyonunu belirlemek için kullanılan uygun bir işlevsel tahlildir. T2D hayvan modellerinde, bu da iyi metabolik hastalık ilerlemesini gösteren hayvanlar karakterize etmek için bir araç olarak kabul edilmektedir bir dismetabolik hiperglisemik hal 8, 9 sağlıklı. T2D en yakın hayvan modeli, rhesus ve sinomolgus maymunları önemli örneklerdir olan insan olmayan primatlarda (NHPs), gösterilmektedir. Bu hayvanlar doğal insanlarda 10 gibi yaş ve sıklığı katkıda obezite aynı risk faktörleri ile T2D gelişir. Ayrıca, orada da benzer bir hastalık ilerlemesi ve dismetabolik hastalığı 11 ilerledikçe pankreas patoloji amiloid birikimi gösteren.
İşte bu hayvanlarda metabolik durumunun bizim koloni karakterizasyonu bir parçası olarak NHPs bir İVGTT gerçekleştirme standart yönteme rapor. Bu yöntem, birtüketen diğer, daha zaman ve pahalı teknikler 2 göreli gerçekleştirmek kolay. IVGTT hızlı ve sık sık hayvanların büyük bir koloni karakterize etmek için yararlıdır. Glike hemoglobin (HbA1C) düzeyi ile dikkate alındığında, hayvanın beslenme ve gıda alımı tarih, yanı sıra yüzde yağsız kütle ve vücut yağ, İVGTT normalde aşikar diyabet 6 doğru bir hayvanın metabolik durumunu ve ilerlemesini karakterize etmek için yeterlidir 8.
HbA1C üç ay önceki altı hafta içinde glikoz seviyelerinin güvenilir bir ölçümünü sağlayan bir kırmızı kan hücresinin ömrü boyunca ortalama glisemik düzeyini temsil eder. IVGTT'nin oruç bazal kan örneğinden ölçüldüğünde, bu değer prosedürleri arasında aylarda glisemik kontrol içine bir pencere sağlar. hayvan son IVGTT'nin beri diyabetik için dismetabolik dan geçiş ise, önceki değerinden çok daha yüksek bir HbA1C değeri işaret ederGeçiş yakında başladı son IVGTT'nin sonra ise, yakın önceki değere bir HbA1C değeri sadece son zamanlarda geçişini olduğunu işaret eder. Genel olarak, rhesus makak içinde, HbA1C% 6 kötü glisemik kontrolü 10, 23 anormal kabul edilir ve işaret edilir daha fazla değer verir.
Glisemi düzeyleri bir bütün olarak hayvan davranışı ve genel sağlığı kapsamında değerlendirilmelidir. Diyabetik makakları - sergi hyperphagia, polidipsi, poliüri ve - insanlar gibi. Hayvanların grup konut dismetabolik ve diyabetik maymunlar için gerekli bu göstergeler ve bireysel bakım ölçümü için önemli zorluklar sağlar. Bu, tek başına fazla kişisel bakım sağlanabilir sırayla hayvanları konut tavsiye ve daha kolay bir şekilde maymun sağlığı davranışsal belirteçleri 8 izlenmelidir. Buna ek olarak, diyabetik makakları kilo kaybı, yanı sıra artan yüksek bir lipid profili (sergileyecekkolesterol, hipertrigliseridemi) ve serum kimyasında rahatsız mineral metabolizması. Bu organlara zarar metabolik bozukluk / diyabet ilerleyen komplikasyonları genellikle, ve glisemik, lipid ve mineral dengesizlikleri 9, 11, 18 ortak belirleyicileri olabilir 24 gibi, karaciğer ve serum kimyasında böbrek fonksiyonunun belirteçleri ölçmek önemlidir .
Bu yöntemi kullanırken bir maymunun hayat belirli değere sahip üzerine, tarihi değerleri çoklu sık karakterizasyonu oluşturulan. Böyle bir glikoz kelepçe veya kademeli glukoz infüzyon (GGI) gibi diğer işlemler, tam bir hayvanın sağlığını değerlendirmek için gerekli olup olmadığını kendi geçmişi kullanılamaz olduğunda, ilk karakterizasyonu üzerine yaygın olduğunu. her üç ayda bir bir sıklıkta bir temel oluşturulmuştur Ancak, bir kez tekrarlanan IVGTT'ler, operasyondan bir hayvanın ilerlemesini takip etmek için, normal olarak yeterlidir. hayvanlar üzerinde birden fazla çalışmalar alındı zaman bu özellikle önemlidirtakvim yılı metabolik durumuna dayalı. sağlık bir seferde yıl nispeten istikrarlı kalabilir sırasında bir hayvanın metabolik durumu kötüleşir zaman, insülin direnci ve glukoz intoleransı dramatik bir artış çok hızlı oluşabilir. HbA1C değerleri üç ay arayla planlanan prosedürleri arasında hayvan sağlık durumunun azalması ya da bazı gelişmeler enterpolasyon için izin verir. Bu nedenle, bu yöntem, doğal ömrü boyunca birden fazla uzunlamasına çalışmalarda kullanılan hayvanların vasıflandırılması için idealdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Butun hayvan prosedürleri, protokol 14-017 altında, Kuzey Karolina Araştırma Campus (NCRC) üzerinde yer alan David H. Murdock Araştırma Enstitüsü IACUC onaylı edildi, diyabet ve prediyabet / insülin direnci ve terapötik etkinliğinin bir insan olmayan üstün ırk modelinin karakterizasyonu geliştirmek insülin duyarlılığı ve metabolik fonksiyonu.
1. Hayvan Seçimi ve Çalışma Hazırlık
- aylık gıda alımı ve vücut ağırlığı kayıtlarına dayanarak Seç diyet ve kilo istikrarlı hayvanlar.
Not: yiyecek alımı stabilize kadar iştah son bir azalma sergiledi hayvanlar, özelliği olmamalıdır.- olgun hayvanlar için (> 5-6 yıl), bedeni ay üst üste arasındaki ağırlıklar ilk maymun incelenmesi ve ağırlık dramatik değişim için metabolik durumunu değiştirmeden başka nedenler ekarte etmeden% 10'dan fazla farklılık hayvanları seçmeyin.
- glukoz, insülin ve C-peptidleri içinde analitler, proteaz inhibitörü (Aprotinin ve DPP4I) K 2 EDTA numune toplama tüpleri hazırlayın.
Not: DPP4I + Aprotinin kokteyli proteaz inhibisyonu geniş spektrumlu bir sağlar, bu ek analitler (glukagon, GLP-1) için gerekli olmalıdır. Ek analitler toplanan olmadığını durumunda, kan tüpleri Numune alımında tutarlılığı korumak için aynı şekilde hazırlanmalıdır. Bu yöntem için doğrulanmamıştır tahliller için alınan örnekler üreticinin önerilerine göre, ayrı ayrı toplanmalıdır.- DPP4I 10 ml Aprotinin, liyofilize 100 mg karıştırılarak proteaz inhibitör kokteyli hazırlanır. Toplanan kan, her mililitre için her kan tüpüne Aprotinin + DPP4I karışımı 10 ul ekle.
- olası tahsilat fazlalık her tüpe proteaz inhibitör kokteyli ilave 10 ul ekle. kullanılana kadar -20 ° C'de muamele kan tüpleri saklayın. procedu sırasında ıslak buz üzerinde tüpler tutunyeniden 4 ° C 'de dönel.
- Standart serum kimyası analiz için başlangıçta bir kan örneği toplamak için bir serum ayırıcı tüp kullanın. Tam kan sayımı (CBC) için, proteaz inhibitörleri olmadan standart K 2 EDTA kullanın. kan örnekleri sonrasında kısım plazma ve serum kullanın cryovials aşağı bükülmüş edilmiştir.
- hayvan tanımlama, tarih, prosedür, timepoint ve örnek hacmi ile uygun kan tüpleri ve cryovials etiketleyin. Uygun deney için plazmada analiz (ler) ile birlikte cryovials etiketleyin.
- normal tuzlu su içinde 250 ml'lik bir torbaya ml heparin 1.000 USP birim 0.15 ml enjekte ile heparinize edilmiş tuz akışı hazırlayın. 0.06 mg heparin / ml bir solüsyon elde edilir. örnekler arasında temizlenmesi için bir tuzlu su kilide Bu çözeltiye 60 ml - 40 çizin. sırasıyla infüzyon önce ve sonra dekstroz infüzyonu noktası yıkama için ayrı şırıngalar içine ilave 1 mL ve 5 mL çizin.
2.Hayvan Sedasyon ve Hazırlık
- hayvanın kafesinden işlem öncesi en az 14 saat ve en fazla 18 saat yiyecek çıkarın.
NOT: Bu hayvanların glisemik değerleri herhangi bir postprandial varyasyonu önlemek için prosedür için aç olması önemlidir. Ayrıca anestezi sırasında yetersizliği ve mide içeriğinin aspirasyonu önlemek için bir önlemdir. - Genel anestezik olarak kas içinden verilen ketamin ile IVGTT prosedür süresince oturaklı hayvanlar, 10 mg / kg. İşlem sırasında, gerektiğinde, 30 dakika ya da 20 - aralıklarla - (10 mg / kg ve 5), ek ketamin yönetme.
- sedasyon hayvan tartılır. ısıtılmış bir prosedür masaya yanal yatar pozisyonda hayvan yerleştirin.
- Hayvan anestezi istikrarlı bir düzlemde sağlamak için klinik parametrelerin her 15 ila 20 dakika izleyin. Bir pulse oksimetre ile - (200 bpm 100) ve DPT 2 (>% 92) kalp hızını ölçün. (- 50 nefes / dk 20) w solunum hızını ölçmek Bir kronometre i, görsel ya da on beş saniye boyunca elle solunumda sayarak ve dört ile çarpılarak. Tedbir sıcaklığı (> 97 ° F) rektal. sakız ve dudakların (nemli, pembe) etrafında mukoz membran rengini izleyin.
- İki kanül siteleri hazırlayın. Kateter eklenecek ilgi alanından saç kesme ve alternatif klorheksidin scrubs ve% 70 alkol ile tüm bölgeyi sterilize etmek için saç makasları kullanın.
- Sol veya sağ sefalik veya safen venlerin bölgesinde bir kateter yerleştirilir ve üç yollu ile (mg heparin / ml 0.06) bir heparin tuzlu floş ekleyin. Bu örnekleme kan alımı sitesidir.
- Başka bir bacak ikinci kateter yerleştirin veya sefalik veya safen venlerin bölgede kol ve bir bağlantı noktası ekleyin. dekstroz infüzyon için bu siteyi kullanın. önce dekstroz infüzyon için kanül patent tutmak için, küçük heparinize salin 1 ml floş kullanın.
Not: IVGTT Prosedür 8 kan alımı numune zaman noktaları (Tablo 1) oluşur.
- Bazal örneği alın ve açlık kan şekeri düzeyini ölçmek için bir el glukometre kullanın. hayvanın genel sağlığını değerlendirmek için bir CBC standart kimya analizi için bir serum numunesi, aynı zamanda, bütün bir kan örneği alın. Imalatçının talimatlarına 8, 9 uyarınca makaklarda kullanılmak için kabul edilmiş bir kit kullanılarak taban numuneden glikoz ve insülin seviyelerini analiz etmek için plazma numuneleri toplamak.
Not: Bu, önceden kanülün ölü boşluk kalan kan veya heparin çıkarmak için kan toplanması için numune alma kanül alınan 0.5 ml'lik bir ön çekmesi önemlidir. - Bazal örnek alınmasını takiben, dekstroz infüzyonu portuna 30 saniye içinde% 50 dekstroz (250 mg / kg) infüzyonu.
Not: yüksek doz modelleri (500 mg / kg), kullanılabilirgerçi doz uzunlamasına karşılaştırmalar yapmak amacıyla prosedürler arasında sabit olmalıdır.- Limanda kalmadı dekstroz olduğundan emin olmak için heparinli serum fizyolojik 5 ml infüzyon portu yıkayın. infüzyon sonu T0 olduğunu. infüzyon arta kalan dekstroz sonraki kan örnekleri kontamine olabilir teknisyen, eldiven yerine var.
- sonrası ilk infüzyon örnek zaman noktası T5 dakika T7 dakika, T10 dakika, T15 dakika, T20 min ardından dekstroz infüzyon sonunda, gelen, T3 dk ve son örnek zaman noktası T30 min yer almaktadır. Başlangıç numunesi ile deney glikoz ve insülin düzeyleri her bir zaman noktasında plazmanın kazan (adım 3.1).
- zaman noktasında dk T3, bir kez daha kan şekeri seviyesini kontrol etmek için el glukometre kullanın.
NOT: Başlangıçta Glucometer okumalar ve T3 dekstroz infüzyon onaylamak için sadece. zaman noktasında dk T3 kan glukoz düzeyi ~ 100 mg / dl daha yüksek eş olmalıdıraçlık bazal plazma glukoz düzeyine mpared.
- zaman noktasında dk T3, bir kez daha kan şekeri seviyesini kontrol etmek için el glukometre kullanın.
4. Hayvan Kurtarma ve Örnek İşleme
- kanüller çıkarın ve zaman noktası dk T30 sonra hemostaz için kateterize sitelere basınç uygulayın. o kendine geldi ve oturmuş kadar hayvan izleyin. hayvan kez Teklif besleme tamamen iyileşti edilir.
- Hemen buz üzerine K 2, EDTA tüpleri içine her bir tam kan örneği yerleştirin. toplama, 10 dakika içinde 4 ° C arasındaki bir sıcaklıkta 3000 rpm'de santrifüj. analize kadar -80 ° C 'de cryovials, dondurulması ve depolanması içine kısım plazma numuneleri.
- Standart serum kimyası analizleri için serum tüpü içine, kan az 20 dakika ve oda sıcaklığında 3000 rpm'de santrifüjlemeden önce en fazla 30 dakika süreyle, oda sıcaklığında bekletin. toplama 48 saat içerisinde deneye tabi tutulana kadar, serum örnekleri dondurun.
NOT: olarak kadar CBC analizi için toplanan buzdolabında tam kan örnekleritoplama 24 saat içinde sayed.
- Standart serum kimyası analizleri için serum tüpü içine, kan az 20 dakika ve oda sıcaklığında 3000 rpm'de santrifüjlemeden önce en fazla 30 dakika süreyle, oda sıcaklığında bekletin. toplama 48 saat içerisinde deneye tabi tutulana kadar, serum örnekleri dondurun.
5. Veri Tedavisi
- Plazma insülin ve glikoz eğrisi oluşturulması başlangıçta, 16, 17, yukarıda glukoz değerleri için doğal log A eğiminden glukoz klirensi oranı K belirler.
Not: Sağlıklı bir NSP sağlıklı hayvan genellikle 30 dakika içinde, başlangıç glukoz değerlerine geri döner olarak, genellikle daha büyük bir 2 veya daha fazla, iyi 1'in üzerinde bir glükoz klirensi oranı K olması beklenebilir. insülin üretimi devre dışı bırakır gibi, glikoz temizlenme oranı K 1'in altına düşen, daha önemli ölçüde düşecek. - T30 16, 17 vasıtasıyla, zaman noktaları arasında, her çizgi parçasının eğri altında kalan alan temsil yamuk alanının toplamları toplamı olarak, bir bütün olarak AUC hesaplayın.
Not: Geleneksel olarak, işlemin ilk on dakika AUC akut olarak kabul edilirprosedürün son 20 dk AUC geç insülin yanıtı (LIR) kabul edilir ise insülin cevabı e, (AIR) glukoz. Hayvan daha dismetabolik hale geldikçe, insülin AUC insülin duyarsızlığı artırmak için tazminat yansıtan artacaktır. Aşikar diyabet hayvan geçişleri gibi, ancak, AUC AIR tarafından yakalanan, akut insülin aşamasında genellikle başlangıçta, azalacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 'de gösterilen sonuçlar, bir 30 dakika IVGTT'nin boyunca, olgun, sağlıklı ve diyabetik sinomolgus makaklar tipik glükoz ve insülin eğrilerinin gösterim bulunmaktadır. Sağlıklı ve ilerlemiş diyabetik maymunlar elde edilen veriler metabolik karakterizasyonu aralığının her iki uç ucundan hayvanlar arasında belirgin farklılıklar kontrast için gösterilmiştir. Bu İVGTT protokol benzer sonuçlar ile rhesus makak yazarlar tarafından başarıyla kullanılmaktadır.
Sağlıklı bir makak (Rhesus ve sinomolgus) ve aç bırakılmış, bazal glukoz değerleri düşük 60-50 olarak mg / dl 8 olabilir. Şekilde gösterildiği gibi, ilk glukoz tur - T3 ölçülen - Sağlıklı NHP 200 mg / dl fazla sık olan diyabetik hayvan için tipik bir başlangıç glükoz değeri kadar yüksek tırmanmaya olmayabilir. Aşağıdaki otuz boyuncadismetabolik ve diyabetik hayvanlar değil (katı çizgiler Şekil 1) yaparken dakika sağlıklı bir hayvanın glikoz düzeyleri genellikle kendi başlangıç değerlerine geri döner. Glukoz insülin periferik etkileri ile büyük-daha-normal bir parçası olarak aracılık kan şekerinin ilk hızlı düşüş (faz 1) karşılık; sağlıklı bir hayvan için eşlik eden insülin eğrisi iki tepe (kesikli mavi çizgi Şekil 1) sergileyen ulaşım ve alımı 3, 4. hatta insülin cevabının ilk aşamasında bu çevresel etkilerin büyüklüğü, düşürücü glikoz karaciğer katkısını eşit değil daha küçük ama daha sürekli ikinci insülin zirve sırasında, hangi (faz 2 ), endojen glukoz üretiminin 1 bastırılması yoluyla glisemik düzeylerde üzerinde en büyük etkiye sahiptir.
Bir hayvan dismetabolik sağlıklı dan ilerledikçe, genellikle inci bir azalma varazaltılmış AIR yansıması olabilir dekstroz bolus insülin yanıtı, e ilk aşaması. Daha sık insülin üretiminde genel bir artış olacaktır Ancak, EAA artmış insülin üretim duyarlılığı azalmayı telafi prosedür boyunca büyük ölçüde değişmeden glisemik düzeyleri sağlayan, değişmeden kalabilir. Bir hayvan açıkça diyabetik hale geldikten sonra, insülin üretimi dekstroz bolus cevaben ölçüde düşer (Şekil 1; kırmızı kesikli çizgi). Ne glikoz boşluk oluşur şimdi olmayan insüline bağımlı mekanizmalar (Şekil 1) neredeyse tamamen aracılık olarak glisemi düzeyleri, prosedürün boyunca yüksek kalır.
Şekil 1: Diyabetik ve H İVGTT Glikoz Gümrükleme ve İnsülin Üretim Eğrileriealthy Kontrol Hayvanlar. Burada gösterilen glikoz (düz çizgi) ve insülin (kesikli çizgi) eğrileri sağlıklı (mavi çizgi) ve diyabetik (kırmızı çizgi) hayvanlar vardır. (Diyabetik glükoz: n = 27, sağlıklı glükoz: n = 21; diyabetik ensülin: n = 23, sağlıklı insülin: n = 20; gösterilen standart hata çubukları) Bu değerler sinomolgus makaklarda gerçekleştirilen IVGTT'ler toplanan fiili verilerin ortalamasıdır. Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| Saat zamanı | Zaman noktaları (dakika) | Gerçek zaman | Kan Numune miktarı (ml) | örnek Deneyi | Glikoz Sayaç Okuma (mg / dl) | |
| Baseline | 5 mi | 1.5 ml SST - kimya 0.5 ml K 2 EDTA - CBC, HbA1c 3 mi K 2 EDTA + 50 ul PROT -. Glukoz, insülin, Cı-Pep | ||||
| 0 | 5 ml heparin tuz akışı ve ardından 30 saniye boyunca verilen Dekstroz infüzyon 250 mg / kg IV, | |||||
| 3 | 2.0 mi | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: Glikoz, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2.0 mi | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: Glikoz, Ins, C-Pep | ||||
| 7 | 2.0 mi | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: Glikoz, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2.0 mi | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: Glikoz, Ins, C-Pep | ||||
| 15 | 2.0 mi | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: Glikoz, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2.0 mi | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: Glikoz, Ins, C-Pep | ||||
| 30 | 2.0 mi | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: Glikoz, Ins, C-Pep | ||||
Tablo 1:. İVGTT Prosedürü Masa Burada gösterilen işlem sırasında yakalanan tüm ilgili bilgileri ayrıntılı bir IVGTT'nin için standart bir prosedür rapordur. numune için Saat süreleri dekstroz takip berabereinfüzyon infüzyon ucundan hesaplanmalıdır. Gerçek kez her beraberlik için kaydedilmelidir. Microsoft Word belgesi olarak bu tabloyu indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İVGTT tahlil itibaren, açlık kan şekeri ve insülin seviyesinin elde edilir. Vücut ağırlığı 5, 12, 13 dayalı tek bir dekstroz infüzyon ile glukoz ile uyarılmış insülin salınımı kapasitesini değerlendirir ve hayvanın kapasitesinin değerlendirilmesini sağlar insülin bırakın ve başlangıca doğru yükselmiş glukoz düzeyi döndürür. Bu normal bir glukoz ve insülin düzeyi, sağlıklı kontrol, Normogliseminin ile hiperinsülinemik dismetabolik hayvan veya bir hiperglisemik insüline dirençli diyabetik hayvan olarak hayvan karakterize bilgi ile kullanıcıya sunar.
Özellikle, erken zaman noktalarında kan örnekleri, dekstroz infüzyonu sonra çekilir ve zamanında ve tutarlı bir şekilde işlenmiş olması önemlidir. Bu içinde ve bireyler arasında değişkenlik azaltmak ve verilerin zamansal sırayla hatalar için fırsatlar azalacaktır. T3 zamanlaması kritik öneme sahiptir gezi o çünküdekstroz infüzyonu sonrası üç dakika başlangıca F plazma glikoz hayvanlar metabolik durumunu karakterize etmek için kullanılır bitiş noktası biridir. Bu kan zamanında alınmadığı berabere cevapsız olabilir dekstroz infüzyon sonra 10 dakika, - ilk 7 içinde glikoz klerensinde bir azalma var. Bu erken zaman noktalarında önemini vurgular, glukoz ve bir bitiş noktası olarak kullanılan insülin eğrileri, her iki bu bölümü altındaki alandır. T3 sonra kan beraberlik geç alınırsa, prosedür devam edebilir, ancak beraberlik gerçek zamanlı mümkün olduğunca eğrinin gerçek şeklini korumak için rapor edilmelidir. Bir dakikadan daha fazla bir sapma yakalanıp rapor edilmesi özellikle önemlidir. Ilk on dakikada, glikoz klerensi daha yavaş olma eğilimindedir ve 30 dakika (Şekil 1) içinde ilk haline dönmeyebilir. prosedür T30 sonra her 10 dakikada bir numune uzatılabilirbu başlangıca dönmek için hayvan ne kadar sürer yakalamak.
IVGTT'ler doğrudan insülin duyarlılığını ölçmek için kendi yetenekleri ile sınırlıdır. Bu insülin üretimini ve glukoz açıklığını değerlendirmek için bir yöntem olarak özellikle kullanışlıdır. Ancak, portal kan kaynağından hepatik insülin çıkarma sistemik kan kaynağından "insülin salgılanmasının" ölçümleri ödün. Bu, kısmen pankreas eşit molar miktarlarda salgılanır, ancak genel kan dolaşımı girmeden önce karaciğer tarafından kaldırılmaz C-peptid, ölçülerek Ancak aşılabilir. Bu daha iyi β-hücre fonksiyonu 16 değerlendirmek için insülin üretiminin daha net bir görünüm verir. Insülin duyarlılığı bir IVGTT'nin verilerin minimum modelleme yoluyla dolaylı olarak değerlendirilebilir olsa da, IVGTT'ler. Glikoz temizlenmesi ve insüline bağımlı olmayan mekanizmalar 1, 6 insüline bağımlı mekanizmalar arasında ayrım yapmamaktadır, daha güvenilir önlemler th ile elde edilebilirBöyle bir β-hücresi doz-yanıt eğrisi 14, 15 içerir Derecelendirilmiş şeker infüzyon (CGI,) gibi prosedürlerin e kullanımı.
Bununla birlikte, insülin duyarlılığı hala sadece dolaylı GGI değerlendirilmektedir. Standart bir insülin dozu insülin duyarlılığı tahmininin geliştirilmesi için IVGTT'nin sırasında hayvana tatbik edilebilir, ancak bu β-hücresi işlevinin değerlendirilmesi ödün, endojen insülin üretimi maskeler. Hiperglisemik ve hiperinsülinemik Kelepçe teknikleri kontrollü insülin maruz yoluyla doğrudan glikoz düzenleme ölçer. GGI ve Kelepçe teknikleri hem dezavantajı da gerçekleştirmek için pahalı ve fazla personel ve süresi 16 (prosedürlerin tasarımına bağlı olarak, altı sekiz saat olarak uzun bazen) tamamlamak için ihtiyaç olmasıdır. IVGTT, diğer taraftan, bir saatten az ve en az insan gücü ile gerçekleştirilebilir.
Genellikle, sağlıklı bir hayvan çok hızlı glikoz imha edecekly, genellikle 30 dakika içinde, başlangıç değerlerine geri ve bunların ensülin eğrisi akut ve geç insülin tepkileri için iki farklı tepe sergileyecektir. Bir hayvan infüzyon artabilir sonra daha dismetabolik, onların oruç glikoz ve ilk üç dakika içinde glikoz gezi hale geldikçe. Ancak, bu değerler sağlıklı hayvanlar arasında çok farklı ve aynı hayvandan tarihi değerleri ile karşılaştırıldığında hastalığın ilerlemesi en bilgilendirici olabilir. Genel olarak, ancak, bir dismetabolik hayvanın glikoz temizleme sağlıklı iken büyük ölçüde farklılık olabilir. hastalık ilerlemesinin ilk belirtileri ensülin eğrisi en belirgin olacak. Oruç insülin seviyesi sadece hafif yükselmiş olsa da, insülin AUC genellikle gelişmekte insülin duyarsızlığı için tazminat yansıtan dismetabolik hayvanlarda önemli ölçüde artacaktır. β-hücresi fonksiyonu azalır gibi olsa da, akut faz insülin tepkisinin bir körleştirilmemesi görülebilir. Tonun normalize taban çizgisine, bir diyabetik maymun 0 yaklaşım olabilir, bir azalma AIR, yansıtılacaktır. Bu insülin üretiminde genel bir düşüş ve glikoz klerensi 8, 9, 10, 11 belirgin bir azalma ile takip edilir.
bir hayvanın metabolik durumu tek IVGTT'nin ile belirlemek zor olabilir. Erken dismetabolik veya pre-diyabetik ya da bir hayvan ayırt çalışırken bu durumda olabilir. giderek daha dismetabolik olma yaparken, insülin üretimi artar euglycemia korumak için. Oruç glukoz değerleri biraz yüksek hale gelebilir iken β-hücre fonksiyonu aşıldığını ve insülin üretimi 18, 20 azalmaya başlayana kadar, bozulmuş glukoz bertaraf çok belirgin hale gelmez. Bir süre için, açık diyabet ayarlanır önce, insülin değerleri ilk faz yanıtı aşıldığını kime erken dismetabolik hayvanın eğrisi benzer, ancak bazı insülin şti olduğunu olabilirll oruç, bazal değerlerin üzerinde üretilen. Bu nedenle, erken dismetabolik ve diyabet öncesi hayvan ensülin eğrisi EAA çok benzer olabilir. Bu durumda, yüksek bir glikoz eğrisi hem insüline bağımlı olmayan insüline bağımlı mekanizma ile etkilendiği, hayvan ayırt etmek için yeterli değildir, erken dismetabolik veya pre-diyabetik ya da. Bu ayrım, doğrudan insülin duyarlılığını 19 ortaya koyacak bir hiperinsülinemik / öglisemik kelepçe, yaparak yapılabilir. Alternatif olarak, bu ayrım birkaç ay sonra hayvanın başka İVGTT performans üzerine yapılabilir. İkinci durumda, ensülin eğrisi artar AUC, hayvan kabul edilebilir, ilk işlem sırasında erken dismetabolik olmuştur. AUC azalır, ancak, hayvanın dismetabolik durumu ilk karakterizasyonu sırasında prediyabetik / ileri edilmiş kabul edilebilir. Bir prediyabetik devlet de Ekteki edilebilirkilo kaybı ile ied ve iki İVGTT prosedürlerini Aradan süre boyunca sıvı alımını artırdı. Bu koşullar İVGTT bir hayvanın sağlığı anlık olarak kullanılan karşıt olarak bu tür prosedürlerin bir tarihin ışığında düşünülen özellikle yararlı bir araçtır neden göstermektedir.
Bilinçli hayvanlarla sandalye-kısıtlama kullanımı 25 test glukoz toleransı sırasında kan glukoz düzeylerinde anlamlı bir yükselme üretmek için ortaya konmuştur. Bu nedenle, hayvan bu prosedür için sedasyon edilir. Ancak, bakım anestezik seçiminde dikkatli olunmalıdır. Burada bildirilen yöntem yalnızca kan şekeri seviyesinin yükselmesine sebep olmadığı, sedasyon için ketamin kullandığı gibi anlamlı insan dışı primatlarda 17, 21 kan şekeri seviyelerini artırabilir sedasyon ksilizin ve deksmedetomidin olarak kullanılması ofα2-adrenoseptör agonistleri söyledi. Bildirilmiştir 22. vesileyle, bir hayvan sergileyebilirteknisyen bir gevşetici hissedebilirsiniz gibi sertlik ve tensing gereklidir. Bu gibi durumlarda, diazepam ve Telazol insülin üretimi ve glükoz metabolizmasının daha sonra α2-adrenoseptör agonistleri 21 çok daha az derin bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla böyle IVGTT'nin gibi metabolik testler, anestezi rejimi dikkate almak önemlidir. Özetle, İVGTT rutin NHPs yapılan basit bir metabolik fonksiyon testi, henüz dolayısıyla onların hayvan bakımı ve sağlık yönetimi, yanı sıra potansiyel yarar bilgilendirmek, farklı metabolik devletler bir koloni içinde hayvanları kategorize değerli bilgiler sağlayabilir metabolik hastalık modellerinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar metabolik hastalık alanında aktif bir sözleşmeli araştırma kuruluşuna (Taç Bioscience) ile bağlıdırlar.
Acknowledgments
Yazarlar DHMRI CLAS hayvan bakım personelinin güçlü bir destek kabul etmek istiyorum, Tesis Müdürü Sayın Daniel Peralta ve katılan veteriner Dr. Glicerio Ignacio, DVM MRCVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-15R Centrifuge | plasma: 4 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Sorvall ST16R Centrifuge | serum: 22 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Thermo Scientific -86 °C Freezer, Forma 88000 Series | Model: 88500A | ||
| Dextrose 50% (D50) | Webster | 07-8008986 | I.V. glucose infusate |
| 3 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | serial blood draws | |
| 5 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | heparinized saline flush | |
| 10 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | delivery of I.V. D50 | |
| Gauze sponges 2 x 2 | Midwest Veterinary Suppy | 366.23000.4 | Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution |
| 4 ml serum separator tubes | Midwest Veterinary Supply | 366.45000.4 | blood collection tube for superchem panel |
| K2EDTA, 2 ml | VWR | 95057-239 | blood collection tubes |
| Aprotinin, 100 mg | Sigma | A1153-100MG | blood collection tube protease additive |
| 22 G x 1" Catheters | Midwest Veterinary Suppy | 193.75250.2 | I.V. catheter |
| Injection Plug W/ Cap | Midwest Veterinary Suppy | 001.11500.2 | %50 dextrose infusion port |
| Porus Tape, 1/2" x 10 yd | Midwest Veterinary Suppy | 001.85000.2 | maintain adherance of catheters and hep. Locks |
| Chlorhexidine Solution 2% | Midwest Veterinary Suppy | 193.08855.3 | prep catheter site |
| 70% Ethanol | VWR | 71001-654 | prep catheter site |
| tourniquet | Webster | 07-8003432 | |
| 3-way stopcock | Midwest Veterinary Supply | 366.28510.4 | hep. lock |
| 37" extension set | Webster | 07-8454200 | hep. lock |
| Exel 50-60cc LL Syringes | Midwest Veterinary Suppy | 001.12250.2 | Heparinized saline flush |
| 250 ml bag 0.9% saline | Webster | 07-8365593 | flush |
| 1,000 U Heparin, 10 ml | Webster | 07-883-4916 | |
| Ketamine (Ketaset) 100 mg/ml | Fort Dodge | (AV ordered) | |
| Precision Xtra glucose test strips 50/bx | Abbott (American Diabetes Wholesale) | 9381599728K7 | test baseline/T3 blood glucose levels |
| Masimo Rad 57 | DRE | 6052057V | pulse-oximeter |
| Pavia rectal thermometer | Patterson | 07-8391335 | |
| Precision Xtra Glucometer | Abbott | 9381599728K7 | Handheld glucometer |
References
- Bergman, R., Phillips, L., Cobelli, C. Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man. J. Clin. Invest. 68, 1456-1457 (1981).
- Bergman, R., Prager, R., Volund, A., Olefsky, J. M. Equivalence of the insulin sensitivity index in man derived by the minimal model and the euglycemic glucose clamp. J. Clin. Invest. 79, 790-800 (1987).
- Hovorka, R., et al. Partitioning glucose distribution/transport, disposal, and endogenous production during IVGTT. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282, E992-E1007 (2002).
- Salinari, S., Guidone, C., Bertuzzi, A., Manco, M., Asnaghi, S., Mingrone, G. First-phase insulin secretion restoration and differential response to glucose load depending on the route of administration in type 2 diabetic subjects after beriatric surgery. Diabetes Care. 32 (3), 375-380 (2009).
- Clinical Diabetes Research: Methods and Techniques. Roden, M. , John Wiley & Sons. (2007).
- Cobelli, C., Pacini, G. Insulin secretion and hepatic extraction in humans by minimal modeling of c-peptide and insulin kinetics. Diabetes. 37, 223-231 (1988).
- Lorenzo, C., et al. Disposition index, glucose effectiveness, and conversion to type 2 diabetes: the insulin resistance atherosclerosis study. Diabetes Care. 33, 2098-2103 (2010).
- Hansen, B. C. Investigation and treatment of type 2 diabetes in nonhuman primates. Methods Mol Biol. 933, 177-185 (2012).
- Hansen, B. C., Bodkin, N. L. Standardization of IVGTT. Importance of method used to calculate glucose disappearance. Diabetes Care. 16 (5), 847 (1993).
- Hardwood, J. H., Listrani, P., Wagner, J. D. Nonhuman primates and other animal models in diabetes research. J Diabetes Sci Tech. 3, 503-514 (2012).
- De Koning, E. J., Bodkin, N. L., Hansen, B. C., Clark, A. Diabetes mellitus in Macaca mulatta monkeys is characterized by islet amyloidosis and reduction in beta-cell population. Diabetologia. 36, 378-384 (1993).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Insulin secretion, clearance and action before and after gastroplasty in severely obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 18, 295-300 (1994).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Postgastroplasty recovery of ideal body weight normalizes glucose and insulin metabolism in obese women. J Clin Endocrinol Metab. 80, 364-369 (1995).
- Kim, S. H., Abbasi, F., Chu, J. W., McLaughlin, T. L., Lamendola, C., Polonsky, K. S., Reaven, G. M. Rosiglitazone reduces glucose-stimulated insulin secretion rate and increases insulin clearance in nondiabetic, insulin-resistant individuals. Diabetes. 54, 2447-2452 (2005).
- Toffolo, G., Breda, E., Cavaghan, M. K., Ehrmann, D. A., Polonsky, K. S., Cobelli, C. Quantitative indexes of beta-cell function during graded up and down glucose infusion from C-peptide minimal models. Am J Physiol Endocrinol Metab. 280, E2-E10 (2001).
- Wang, X., et al. Quantification of beta-cell insulin secretory function using a graded glucose-infusion with C-peptide deconvolution in dysmetabolic, and diabetic cynomolgus monkeys. Diabetology and Metabolic Syn. 5, 40 (2013).
- Xiao, Y. F., Wang, B., Wang, X., Du, F., Benzinou, M., Wang, Y. X. Xylazine-induced reduction of tissue sensitivity to insulin leads to acute hyperglycemia in diabetic and normoglycemic monkeys. Anesthesiology. 13 (33), (2013).
- Porte, D., Kahn, S. β-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes potential mechanisms. Diabetes. 50, Suppl 1. S160-S163 (2001).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), G214-G223 (1979).
- Ferrannini, E., Gastaldelli, A., Miyazaki, Y., Matsuda, M., Mari, A., DeFronzo, R. A. β-cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J Clin Endocrinol Metab. 90 (1), 493-500 (2005).
- Vaughan, K. L., Szarowicz, M. D., Herbert, R. L., Mattison, J. A. Comparison of anesthesia protocols for intravenous glucose tolerance testing in rhesus monkeys. J Med Primatol. 43, 162-168 (2014).
- Kemnitz, J. W., Kraemer, G. W. Assessment of glucoregulation in rhesus monkeys sedated with ketamine. American Journal of Primatology. 3, 201-210 (1982).
- Dutton, C. J., Parvin, C. A., Gronowski, A. M. Measurement of glycated hemoglobin percentages for use in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus in nonhuman primates. Am J Vet Res. 64, 562-568 (2003).
- Rai, V., Iyer, U., Mani, I., Mani, U. V. Serum biochemical changes in insulin dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus and their role in the development of secondary complications. Int J Diab Dev Countries. 17, 33-37 (1997).
- Shirasaki, Y., Yoshioka, N., Kanazawa, K., Maekawa, T., Horikawa, T., Hayashi, T. Effect of physical restraint on glucose tolerance in cynomolgus monkeys. J Med Primatol. 42, 165-168 (2013).
