Summary
L'objectif de ce protocole est de présenter une méthode standard pour effectuer des tests de tolérance au glucose par voie intraveineuse (IVGTTs) pour évaluer le contrôle glycémique chez les primates non humains et d'évaluer leur état métabolique de santé à dysmétabolique.
Abstract
Le test de tolérance au glucose par voie intraveineuse (IVGTT) joue un rôle clé dans la caractérisation de l'homéostasie du glucose. Lorsque combiné avec des profils sériques biochimiques, état compris les niveaux de glucose dans le sang à la fois alimenté et à jeun, HbA1c, les niveaux d'insuline, l'histoire clinique de régime alimentaire, la composition corporelle, et l'état de poids corporel, une évaluation du contrôle glycémique normal et anormal peut être faite . Interprétation d'un IVGTT se fait par la mesure des changements dans les niveaux de glucose et d'insuline dans le temps par rapport au défi dextrose. Les composants critiques à prendre en compte sont: des pics de glucose et d' insuline atteint par rapport à T0 (fin de la perfusion de glucose), le taux de clairance de glucose K dérivée de la pente de la clairance rapide du glucose dans les 20 premières minutes (T1 à T20), le temps pour revenir à la ligne de base de glucose, et l'aire sous la courbe (AUC). Ces mesures de IVGTT montrera des changements caractéristiques que se déplace l' homéostasie du glucose à partir d' un t sainoa état métabolique malade 5. Ici, nous allons décrire la caractérisation des primates non humains (rhésus et cynomolgus macaques), qui sont le modèle le plus pertinent des animaux du diabète de type II (DT2) chez l'homme et l'IVGTT et les profils cliniques de ces animaux d'un sain maigre, à dysmétabolique obèses, et de l' état 8, 10, 11 DT2.
Introduction
L'IVGTT est un essai fonctionnel pratique qui est couramment utilisé pour déterminer la fonction β-cellulaire chez l' homme , à différents états métaboliques 5, 7. Dans les modèles animaux de diabète de type 2, il est bien reconnu comme un outil pour caractériser les animaux qui montrent métabolique progression de la maladie de une saine à un état de dysmétabolique hyperglycémique 8, 9. Le modèle animal le plus proche de DT2 est démontrée chez les primates non humains (PSN), dont rhésus et cynomolgus macaques sont des exemples notables. Ces animaux développent naturellement DT2 avec les mêmes facteurs de risque de l' âge et de l' obésité contribue à sa fréquence comme chez les humains 10. En outre, il existe une progression de la maladie et de la pathologie du pancréas similaire montrant des dépôts amyloïdes que la maladie progresse dysmétabolique 11.
Nous rapportons ici sur notre méthode standard de l'exécution d'une IVGTT dans les PSN dans le cadre de notre caractérisation de colonie de l'état métabolique chez ces animaux. Cette méthode estfacile à réaliser par rapport à l' autre, beaucoup plus de temps et des techniques coûteuses 2. Le IVGTT est utile pour caractériser une grande colonie d'animaux rapidement et fréquemment. Une fois pris en compte avec le taux d'hémoglobine glyquée (HbA1c), l'histoire l' alimentation et la nourriture de l' apport de l'animal, ainsi que leur pour cent de la masse maigre et la graisse corporelle, la IVGTT est normalement suffisant pour caractériser l' état et la progression du métabolisme de l'animal vers le diabète manifeste 6 , 8.
HbA1C représente le niveau glycémique moyenne sur la durée de vie d'une cellule de sang rouge, fournissant une mesure fiable des niveaux de glucose au cours des six semaines précédentes à trois mois. Lorsque mesurée à partir de l'échantillon de sang à jeun base de l'IVGTT, cette valeur fournit une fenêtre sur le contrôle glycémique pendant les mois entre les procédures. Si l'animal est passé d'dysmétabolique à diabétiques depuis leur IVGTT dernière, une valeur d'HbA1C beaucoup plus élevé que leur valeur précédente indiqueraitque la transition a commencé peu après leur IVGTT dernière, alors que, d'une valeur de HbA1C plus proche de leur valeur précédente indiquerait qu'ils ont récemment transition. En général, chez les macaques rhésus, HbA1C valeurs supérieures à 6% sont considérés comme anormaux, et indiquer un mauvais contrôle glycémique 10, 23.
glycémies doivent être interprétés dans le contexte du comportement et l'état général de l'animal dans son ensemble. macaques diabétiques - comme les humains - exposition hyperphagie, polydipsie, polyurie et. le logement des animaux de groupe fournit d'importants défis à la mesure de ces indicateurs et la prise en charge individuelle requis pour dysmétabolique et des singes diabétiques. Nous recommandons individuellement le logement des animaux afin que des soins plus personnalisés peuvent être fournis, et des marqueurs comportementaux de la santé du singe plus facilement être surveillé 8. En outre, les macaques diabétiques présenteront une perte de poids, ainsi que d'un profil lipidique élevée (augmentation de lacholestérol, hypertriglycéridémie) et le métabolisme minéral perturbé dans la chimie du sérum. Il est important de mesurer les marqueurs de la fonction hépatique et rénale dans la chimie du sérum, que des dommages à ces organes sont souvent des complications de l' avancement métabolique trouble / diabète, et peuvent être co-déterminants de la glycémie, des lipides et des déséquilibres minéraux 9, 11, 18, 24 .
En utilisant cette méthode, les valeurs historiques générées à partir de plusieurs caractérisations fréquentes au cours de la vie d'un singe sont d'une valeur particulière. Si d'autres procédures, comme une pince de glucose ou classé glucose perfusion (GGI), sont nécessaires pour évaluer pleinement la santé d'un animal, il est souvent sur la caractérisation initiale lorsque leur histoire est indisponible. IVGTTs Cependant, une fois une ligne de base a été établie, répétées d'une fréquence de tous les trois mois sont normalement suffisantes pour suivre les progrès d'un animal. Ceci est particulièrement important lorsque les animaux sont enrôlés dans des études multiples à travers unannée civile basée sur leur statut métabolique. Bien que leur santé peut demeurer relativement stable pendant des années à la fois, lorsque l'état métabolique d'un animal se détériore, une augmentation spectaculaire de la résistance à l'insuline et une intolérance au glucose peut se produire très rapidement. Les valeurs d'HbA1c permettent une certaine interpolation de la baisse ou l'amélioration de l'état de santé de l'animal entre les procédures prévues trois mois d'intervalle. Pour cette raison, cette méthode est idéale pour caractériser les animaux utilisés dans de multiples études longitudinales au cours de leur durée de vie naturelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées par l'Institut David H. Murdock recherche IACUC situé sur le campus de North Carolina Research (NCRC), sous protocole 14-017, la caractérisation d'un modèle primate non humain du diabète et du prédiabète / résistance à l'insuline et de l'efficacité de la thérapeutique pour améliorer sensibilité à l'insuline et la fonction métabolique.
1. Sélection animale et préparation d'études
- Sélectionnez l'alimentation et le poids des animaux stables sur la base des relevés mensuels de consommation alimentaire et le poids corporel.
NOTE: Les animaux qui ont exposé une récente baisse de l'appétit ne devraient pas être caractérisés jusqu'à ce que leur apport alimentaire est stabilisée.- Pour les animaux matures (> 5-6 ans), ne sélectionnez pas les animaux dont le poids entre les mois consécutifs corps diffèrent de plus de 10%, sans examiner d'abord le singe et exclure d'autres causes que la modification du statut métabolique pour le changement dramatique de poids.
- Pour le glucose, l'insuline et le C-Peptide analytes, préparer K 2 EDTA prélèvement d'échantillons tubes avec inhibiteur de protéase (aprotinine et DPP4I).
NOTE: Le cocktail DPP4I + aprotinine offre un large spectre d'inhibition de la protéase si cela était nécessaire pour des analytes supplémentaires (glucagon, GLP-1). Dans le cas où les analytes supplémentaires ne sont pas collectées, les tubes de sang doivent être préparés de la même façon pour maintenir la cohérence dans le prélèvement d'échantillons. Les échantillons pour essais non validés pour cette méthode doivent être collectés séparément, selon les recommandations du fabricant.- Préparer le cocktail d'inhibiteur de la protéase en mélangeant 100 mg d'aprotinine lyophilisée avec 10 ml d'DPP4I. Ajouter 10 ul du mélange d'aprotinine + DPP4I à chaque tube de sang pour chaque millilitre de sang prélevé.
- Ajouter une 10 pl supplémentaires du cocktail d'inhibiteurs de protéase à chaque tube pour un éventuel excédent de collecte. Conserver les tubes de sang traité à -20 ° C jusqu'à utilisation. Gardez les tubes sur la glace mouillée pendant la procedure et de spin à 4 ° C.
- Utiliser un tube de séparation de sérum pour prélever un échantillon de sang à la ligne de base pour l'analyse de la chimie du sérum standard. Pour la Numération de cellules sanguines (CBC), utiliser une norme K 2 EDTA sans inhibiteurs de protéase. Utiliser des cryotubes à plasma et le sérum après aliquote des échantillons de sang ont été centrifugés.
- Etiqueter les tubes de sang et les cryotubes de manière appropriée à l'identification des animaux, la date, la procédure, timepoint, et le volume de l'échantillon. Etiqueter les cryotubes avec l'analyte (s) dans le plasma pour le dosage approprié.
- Préparer la chasse d'une solution saline héparinée en injectant 0,15 ml de 1000 unités USP par ml d'héparine dans un sac de 250 ml de solution saline normale. Obtenir une solution de 0,06 mg d'héparine / ml. Dessiner 40 - 60 ml de cette solution dans une serrure saline de rinçage entre les échantillons. Dessinez un supplément de 1 ml et 5 ml dans des seringues séparées pour le rinçage du port de perfusion de dextrose avant et après la perfusion, respectivement.
2.Sédation animale et préparation
- Retirer les aliments de la cage de l'animal au moins 14 heures avant la procédure, et pas plus de 18 heures.
NOTE: Il est important que les animaux soient à jeun pendant la procédure afin d'éviter toute variation post-prandiale dans les valeurs glycémiques. Il est également une précaution pour éviter la régurgitation et l'aspiration du contenu de l'estomac tandis anesthésiés. - animaux Sobriété pour la durée de la procédure IVGTT avec de la kétamine administrée par voie intramusculaire comme une anesthésie générale, à 10 mg / kg. Administrera kétamine supplémentaire (5 - 10 mg / kg) à des intervalles de 20 - 30 minutes ou selon les besoins, au cours de la procédure.
- Peser l'animal sous sédation. Placer l'animal dans une position couchée latéralement sur une table de procédure chauffée.
- Surveiller les paramètres cliniques, toutes les 15 à 20 minutes pour assurer que l'animal se trouve dans un plan stable d'anesthésie. Mesurer la fréquence cardiaque (100 - 200 bpm) et SPO 2 (> 92%) avec un oxymètre de pouls. Mesurer la fréquence respiratoire (20 - 50 respirations / min) w vec un chronomètre, comptage respirations visuellement ou à la main plus de quinze secondes et en multipliant par quatre. Mesurer la température (> 97 ° F) par voie rectale. Surveiller la couleur de la muqueuse autour de la gomme et les lèvres (humides, rose).
- Préparer deux sites de la canule. Utilisez tondeuses pour couper les cheveux de la zone d'intérêt où le cathéter sera inséré, et stériliser toute la région avec des gommages alternées de chlorhexidine et 70% d'alcool.
- Placer un cathéter dans la région des veines gauche ou à droite céphalique ou saphènes et l'attacher à une chasse d'eau saline héparine (0,06 mg d'héparine / ml) avec un robinet à trois voies. Ceci est le site de prélèvement de sang d'échantillonnage.
- Placer le second cathéter dans une jambe ou un bras dans la région des veines saphènes ou céphaliques et attacher un orifice. Utilisez ce site pour la perfusion de dextrose. Utilisez un petit, 1 ml de solution saline de rinçage héparinée pour maintenir le brevet de la canule avant la perfusion de dextrose.
REMARQUE: La procédure IVGTT se compose de 8 sang nul échantillonnage points de temps (tableau 1).
- Prenez l'échantillon de référence et d'utiliser un glucomètre portatif pour mesurer le taux de glucose sanguin à jeun. Obtenir un échantillon de sérum pour l'analyse de la chimie standard, ainsi que d'un échantillon de sang pour un CBC afin d'évaluer la santé globale de l'animal. Recueillir des échantillons de plasma pour doser les niveaux de glucose et d' insuline à partir de l'échantillon de référence en utilisant un kit validé pour une utilisation avec des macaques selon les instructions du fabricant 8, 9.
NOTE: Il est important d'avoir un pré-tirage de 0,5 ml prélevés sur la canule avant de prendre un échantillon pour la collecte de sang pour éliminer le sang résiduel ou de l'héparine dans le cul-de-espace de la canule. - Après l'obtention de l'échantillon de référence, faire infuser la dose de 50% de glucose (250 mg / kg) pendant 30 secondes dans le port d'infusion de dextrose.
REMARQUE: Les modèles à plus forte dose (500 mg / kg) peuvent être utilisés,si la dose doit être fixé dans les procédures afin de faire des comparaisons longitudinales.- Rincer le port de perfusion avec 5 ml de solution saline héparinée pour vous assurer qu'il n'y a pas de dextrose à gauche dans le port. La fin de la perfusion est T0. Demandez au technicien de remplacer les gants, comme le dextrose résiduel de la perfusion peut contaminer les échantillons sanguins ultérieurs.
- Le premier post-perfusion point de temps d'échantillonnage est au T3 min, à partir de la fin de la perfusion de dextrose, suivie T5 min, T7 min, T10 min, T15 min, T20 min, et le dernier échantillon point de temps est T30 min. Recueillir le plasma de chaque timepoint au dosage du glucose et d'insuline avec l'échantillon de référence (voir étape 3.1).
- Au T3 min point de temps, utilisez le glucomètre portatif pour vérifier à nouveau le niveau de glucose dans le sang.
REMARQUE: Les lectures glucomètre au niveau de référence et T3 sont uniquement destinés à confirmer la perfusion du glucose. Le niveau de glucose dans le sang au T3 min point de temps devrait être co ~ 100 mg / dl supérieurmpared au niveau de glucose dans le plasma à jeun de base.
- Au T3 min point de temps, utilisez le glucomètre portatif pour vérifier à nouveau le niveau de glucose dans le sang.
4. Récupération et transformation d'animaux échantillon
- Retirez les canules et appliquer une pression sur les sites cathétérisés pour hémostase après la T30 min point de temps. Surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il ait repris conscience et est assis. Offre d'alimentation une fois que l'animal est complètement rétabli.
- Immédiatement placer chaque échantillon de sang total en K 2 tubes EDTA sur la glace. Centrifuger à 3000 tours par minute à une température de 4 ° C dans les 10 minutes de la collecte. échantillons aliquote de plasma en cryotubes, congeler et conserver à -80 ° C jusqu'à l'analyse.
- Laisser le sang dans le tube de sérum pour l'analyse de la chimie du sérum étalon reposer à température ambiante pendant au moins 20 minutes et pas plus de 30 minutes avant centrifugation à 3000 tours par minute à température ambiante. Congeler les échantillons de sérum avant d'être testés dans les 48 heures de la collecte.
NOTE: Réfrigérer l'ensemble des échantillons de sang prélevés pour l'analyse CBC jusqu'à ce quesayed dans les 24 heures de la collecte.
- Laisser le sang dans le tube de sérum pour l'analyse de la chimie du sérum étalon reposer à température ambiante pendant au moins 20 minutes et pas plus de 30 minutes avant centrifugation à 3000 tours par minute à température ambiante. Congeler les échantillons de sérum avant d'être testés dans les 48 heures de la collecte.
5. Traitement de données
- Après avoir établi les courbes d'insuline plasmatique et de glucose, de déterminer le taux de clairance de glucose K de la pente du logarithme naturel des valeurs de glucose au- dessus de référence 16, 17.
NOTE: Un PSN sain peut être prévu d'avoir un taux de clairance de glucose K bien au- dessus 1, souvent supérieure à 2 ou plus, comme un animal en bonne santé sera souvent revenir à leurs valeurs de glucose de base dans les 30 minutes. Comme la production d'insuline diminue, le taux de clairance de glucose K va baisser de façon plus spectaculaire, tombant en dessous de 1. - Calculer l'AUC dans son ensemble, comme la somme des totaux de la zone des trapèzes représentant l'aire sous la courbe de chaque segment de ligne entre points de temps, à travers T30 16, 17.
NOTE: Traditionnellement, l'AUC des dix premières minutes de la procédure est considérée comme la acute réponse insulinique au glucose (AIR), tandis que l'AUC du 20 dernières minutes de la procédure est considérée comme la réponse de l' insuline en retard (RIL). Comme l'animal devient plus dysmétabolique, l'AUC de l' insuline va augmenter, ce qui reflète une compensation pour l' augmentation insensibilité à l' insuline. Étant donné que les transitions d'animaux vers un diabète patent, cependant, l'ASC va diminuer, souvent d' abord dans la phase aiguë de l' insuline, capturée par l'air.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les résultats représentés sur la figure 1 sont démonstratives des courbes typiques de glucose et d' insuline à partir matures, saines et diabétiques macaques cynomolgus au cours d'une 30 min IVGTT. Les données provenant des singes diabétiques sains et avancés sont présentés dans le but de comparer les différences évidentes entre les animaux des deux extrémités de la gamme de la caractérisation métabolique. Ce protocole de IVGTT a été utilisé avec succès par les auteurs de macaques rhésus avec des résultats similaires.
Les valeurs de glucose à jeun de base d'un macaques sains (rhésus et cynomolgus) peuvent être aussi bas que 50 à 60 mg / dl 8. Comme illustré sur la figure, l'excursion initiale en glucose - mesurée à T3 - pour un PSN en bonne santé ne peut pas monter aussi haut que la valeur de glucose de base typique pour un animal diabétique, qui est souvent supérieure à 200 mg / dl. Au cours de la trente suivanteminutes, les niveaux d'un animal sain de glucose reviennent souvent à leurs valeurs de référence, tandis que les animaux diabétiques dysmétabolique et ne le font pas (figure 1; trait plein). La courbe de l' insuline d' accompagnement pour un animal sain présente deux pics (figure 1; ligne pointillée bleue), qui correspondent à la, baisse initiale rapide de la glycémie (phase 1) médiée en grande partie à la normale par les effets périphériques de l' insuline sur le glucose le transport et l' absorption 3, 4. l'importance de ces effets périphériques, même pendant la première phase de la réponse à l'insuline, ne correspond pas à la contribution du glucose par le foie d' abaissement, qui, au cours du second pic d'insuline plus petite mais plus durable (phase 2 ), a le plus grand impact sur les niveaux glycémiques via la suppression de la production de glucose endogène 1.
Comme un animal progresse de santé à dysmétabolique, il existe généralement une diminution de the première phase de la réponse à l'insuline au bol dextrose, ce qui peut se traduire par une AIR réduite. Cependant, l'ASC peut rester inchangée, car il y aura plus souvent une augmentation globale de la production d'insuline, en fournissant des niveaux glycémiques largement inchangés au cours de la procédure que la production accrue d'insuline compense la diminution de la sensibilité. Une fois que l'animal est devenu ouvertement diabétique, la production d'insuline diminue considérablement en réponse au bolus de dextrose (Figure 1; ligne pointillée rouge). Les niveaux glycémiques resteront élevés au cours de la procédure, ce qui se produit une clairance de glucose est maintenant médiée presque entièrement par des mécanismes non-insulino-dépendant (figure 1).
Figure 1: IVGTT Glucose Liquidation et la production d' insuline Curves pour diabétique et HLes animaux de contrôle ealthy. On voit ici le glucose (trait plein) et de l' insuline (ligne pointillée) courbes pour la santé (ligne bleue) et diabétiques (ligne rouge) animaux. Ces valeurs sont des moyennes des données réelles recueillies au cours de IVGTTs effectuées sur macaques cynomolgus (glucose diabétique: n = 27; glucose sain: n = 21; insuline diabétique: n = 23; l' insuline en bonne santé: n = 20; barres d'erreur standards affichés). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Temps d'horloge | Points de temps (min) | Temps réél | Montant de l' échantillon sanguin (ml) | Dosage de l' échantillon | Glucose Meter Reading (mg / dl) | |
| Baseline | 5 ml | 1,5 ml SST - chimie 0,5 ml K 2 EDTA - CBC, HbA1c 3 ml d' EDTA K 2 + 50 ul prot. - Le glucose, l' insuline, C-Pep | ||||
| 0 | perfusion de dextrose 250 mg / kg IV, étant donné plus de 30 sec, suivi par 5 ml Héparine flush saline | |||||
| 3 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pl .: Prot Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pl .: Prot Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 7 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pl .: Prot Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| dix | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pl .: Prot Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 15 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pl .: Prot Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pl .: Prot Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 30 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pl .: Prot Glucose, Ins, C-Pep | ||||
Tableau 1:. IVGTT Procédure Table Montré ici est un rapport de procédure standard pour un IVGTT, détaillant toutes les informations pertinentes capturé au cours de la procédure. temps d'horloge pour l'échantillon tirages suivant le dextroseperfusion doit être calculée à partir de la fin de la perfusion. Les temps réels doivent être enregistrés pour chaque tirage. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau comme un document Microsoft Word.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le IVGTT évalue la capacité de libération d'insuline stimulée par le glucose par une seule perfusion de dextrose en fonction du poids du corps 5, 12, 13. De l'essai, le taux de glucose sanguin à jeun et le taux d'insuline est atteint, et il permet une évaluation de la capacité de l'animal à la libération d'insuline et de retourner le niveau de glucose élevé vers la ligne de base. Ceci permet à l'utilisateur des informations pour caractériser l'animal comme le glucose normal et sain contrôle du niveau d'insuline, un animal avec une normoglycémie dysmétabolique hyperinsulinémique, ou un animal diabétique insulino-résistant hyperglycémique.
Il est important que les échantillons de sang, en particulier des points de temps précoces après l'injection de dextrose, sont étirés et traités d'une manière rapide et uniforme. Cela permettra de réduire la variabilité au sein et entre les sujets, et de réduire les possibilités d'erreurs dans l'ordre temporel des données. Le moment de la T3 est d'une importance cruciale, car l'excursion of glucose plasmatique ligne de base à trois minutes après la perfusion du glucose est l'un des points d'extrémité qui est utilisée pour caractériser l'état métabolique des animaux. Il y a une diminution de la clairance du glucose dans les 7 premiers - 10 min après la perfusion de dextrose, qui peut être manquée si les prélèvements sanguins ne sont pas prises à temps. Il est l'aire sous cette partie à la fois du glucose et les courbes d'insuline qui est utilisé comme critère d'évaluation, en insistant sur l'importance de ces points de temps précoces. Si un prélèvement de sang après la T3 est pris fin, la procédure peut se poursuivre, mais le temps réel du tirage au sort doit être rapporté afin de préserver la vraie forme de la courbe, autant que possible. Il est particulièrement important que les écarts de plus d'une minute être capturés et signalés. Après les dix premières minutes, la clairance du glucose tend à devenir plus progressive, et ne peut pas revenir à la ligne de base dans les 30 minutes (Figure 1). La procédure peut être étendue par échantillonnage toutes les 10 minutes après la T30 àcapturer combien de temps il prend l'animal pour revenir à la ligne de base.
IVGTTs sont limitées par leur capacité à mesurer directement la sensibilité à l'insuline. Il est principalement utile en tant que méthode pour évaluer la production d'insuline et de la clairance de glucose. Cependant, l'extraction de l'insuline hépatique de l'alimentation en sang portai compromet les mesures de "sécrétion d'insuline" de l'alimentation sanguine systémique. Ceci peut être partiellement surmonté, toutefois, en mesurant le peptide C, qui est sécrété en quantités équimolaires du pancréas mais ne sont pas éliminés par le foie avant d'entrer dans l'irrigation sanguine générale. Cela donne une vision plus claire de la production d'insuline afin de mieux évaluer la fonction β-cellulaire 16. Aussi, IVGTTs ne distinguent pas entre les mécanismes insulino-dépendants de la clairance de glucose et non insulino des mécanismes dépendants 1, 6. Bien que la sensibilité à l'insuline peut être évaluée indirectement par la modélisation minimale des données à partir d' un IVGTT, des mesures plus fiables peuvent être atteints par el' utilisation du courrier des procédures telles que la perfusion du glucose Graded (GGI), qui fournit une courbe β-cellulaire dose-réponse 14, 15.
Cependant, la sensibilité à l'insuline est encore évaluée indirectement avec le GGI. Une dose d'insuline standard peut être administré à l'animal au cours de la IVGTT pour améliorer l'estimation de la sensibilité à l'insuline, mais qui va masquer la production d'insuline endogène, l'évaluation de la fonction β-cellulaire compromettre. Le hyperglycémique et les techniques Hyperinsulinémique Clamp mesurent directement la régulation du glucose par l'intermédiaire de l'exposition à l'insuline contrôlée. L'inconvénient à la fois au GGI et les techniques de serrage est qu'ils sont coûteux à réaliser et nécessitent plus de personnel et de temps pour terminer (parfois aussi longtemps que six ou huit heures, en fonction de la conception des procédures) 16. Le IVGTT, d'autre part, peut être effectuée sous une heure et avec un minimum de personnel.
En général, un animal sain disposera de glucose très rapidely, revenant souvent à leurs valeurs initiales dans les 30 minutes, et leur courbe de l'insuline présentent deux pics distincts pour les réponses aiguës et tardives insuline. Comme un animal devient plus dysmétabolique, leur taux de glucose à jeun et de leur excursion de glucose dans les trois premières minutes après la perfusion peut augmenter. Cependant, ces valeurs peuvent varier considérablement entre les animaux sains, et sont les plus informatives de la progression de la maladie par rapport aux valeurs historiques provenant du même animal. Dans l'ensemble, cependant, la clairance du glucose d'un animal dysmétabolique ne peut différer grandement de quand ils étaient en bonne santé. Les premiers signes de progression de la maladie vont être plus évidents dans la courbe de l'insuline. Alors que le taux d'insuline à jeun ne peut être légèrement élevée, l'AUC de l' insuline sera généralement augmenter de façon spectaculaire chez les animaux de dysmétaboliques, ce qui reflète une compensation pour l'insensibilité à l' insuline en développement. Comme la fonction β-cellulaire diminue, cependant, à émousser la réponse de l'insuline en phase aiguë peut être vu. Tsa volonté se traduit par une diminution de AIR, qui, lorsqu'elle est normalisée à la ligne de base, peut approcher 0 chez un singe diabétique. Elle est suivie par une baisse globale de la production d'insuline et une diminution spectaculaire de la clairance de glucose 8, 9, 10, 11.
L'état métabolique d'un animal peut être difficile de déterminer avec une seule IVGTT. Cela peut être le cas lors de la tentative de distinguer un animal soit dysmétabolique précoce ou pré-diabétique. En devenant progressivement plus dysmétabolique, augmentation de la production d'insuline pour maintenir une glycémie normale. Alors que les valeurs à jeun de glucose peuvent devenir légèrement plus élevée, l' élimination au glucose ne devient pas très évident jusqu'à ce que la fonction β-cellulaire a été compromise et la production d'insuline commence à décliner 18, 20. Pour une période de temps, avant que le diabète manifeste est installée, les valeurs d'insuline peut ressembler à la courbe d'un animal dysmétabolique tôt que la première réponse de phase a été compromise, mais un peu d'insuline est still est produit ci-dessus à jeun, les valeurs de référence. De ce fait, l'AUC de la courbe de l'insuline d'une dysmétabolique précoce et l'animal prédiabétique peut être très similaire. Dans ce cas, une courbe de glycémie élevée, étant impacté par les deux mécanismes d'insulino-dépendant ou non insulino-dépendants, ne suffit pas à distinguer l'animal soit dysmétabolique précoce ou pré-diabétique. Cette distinction peut être faite par l' exécution d' une pince hyperinsulinémique / euglycémique, qui démontrera directement sensibilité à l' insuline 19. En variante, cette distinction peut être faite lors de l'exécution une autre IVGTT sur l'animal après plusieurs mois. Dans ce dernier cas, si l'AUC de l'insuline courbe augmente, l'animal peut être considérée comme ayant été dysmétabolique tôt au moment de la première procédure. Si l'ASC diminue, cependant, l'état de dysmétabolique de l'animal peut être considéré comme ayant été avancé / prédiabétique au moment de la première caractérisation. Un état prédiabétique peut également être agrémié par la perte de poids et l'augmentation de l'apport hydrique pendant la période de temps intervenir les deux procédures IVGTT. Ces circonstances illustrent pourquoi le IVGTT est un outil particulièrement utile lorsqu'il est considéré à la lumière d'une histoire de ces procédures au lieu d'être utilisé comme un instantané de la santé d'un animal.
L'utilisation de la chaise de retenue avec des animaux conscients a été démontré pour produire une élévation significative des taux de glucose dans le sang pendant la tolérance au glucose test 25. Pour cette raison, les animaux sont mis sous sédation pendant cette procédure. Cependant, il faut être prudent dans le choix de l'anesthésique. Il a été rapporté que l'utilisation ofα2 adrénorécepteurs agonistes tels que la xylazine et la dexmédétomidine pour la sédation peut augmenter de manière significative le taux de glucose sanguin chez des primates non humains 17, 21. Le procédé décrit ici utilise uniquement la kétamine pour la sédation, qui ne provoque pas de taux de glucose sanguin à la hausse 22. À l'occasion, un animal peut présenterune telle rigidité et tenseur que le technicien peut se sentir un décontractant est nécessaire. Dans de tels cas, le diazépam et Télazol ont été démontrés comme ayant un effet beaucoup moins profond sur la production d'insuline et le métabolisme du glucose , puis agonistes α2-adrénergiques 21. Par conséquent, il est important de considérer le régime anesthésique dans les tests métaboliques, tels que le IVGTT. En résumé, le IVGTT est un test de la fonction métabolique simple qui est couramment effectuée dans les PSN, mais il peut fournir des informations précieuses pour classer les animaux dans une colonie dans différents états métaboliques, donc informer leurs soins des animaux et de la gestion de la santé, ainsi que leur utilité potentielle dans des modèles de maladies métaboliques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs sont affiliés à une organisation de recherche sous contrat (Crown Bioscience) active dans le domaine des maladies métaboliques.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le fort soutien du personnel de soins aux animaux DHMRI CLAS, Facility Manager M. Daniel Peralta et vétérinaire traitant, le Dr Glicerio Ignacio, DVM MRCVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-15R Centrifuge | plasma: 4 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Sorvall ST16R Centrifuge | serum: 22 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Thermo Scientific -86 °C Freezer, Forma 88000 Series | Model: 88500A | ||
| Dextrose 50% (D50) | Webster | 07-8008986 | I.V. glucose infusate |
| 3 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | serial blood draws | |
| 5 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | heparinized saline flush | |
| 10 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | delivery of I.V. D50 | |
| Gauze sponges 2 x 2 | Midwest Veterinary Suppy | 366.23000.4 | Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution |
| 4 ml serum separator tubes | Midwest Veterinary Supply | 366.45000.4 | blood collection tube for superchem panel |
| K2EDTA, 2 ml | VWR | 95057-239 | blood collection tubes |
| Aprotinin, 100 mg | Sigma | A1153-100MG | blood collection tube protease additive |
| 22 G x 1" Catheters | Midwest Veterinary Suppy | 193.75250.2 | I.V. catheter |
| Injection Plug W/ Cap | Midwest Veterinary Suppy | 001.11500.2 | %50 dextrose infusion port |
| Porus Tape, 1/2" x 10 yd | Midwest Veterinary Suppy | 001.85000.2 | maintain adherance of catheters and hep. Locks |
| Chlorhexidine Solution 2% | Midwest Veterinary Suppy | 193.08855.3 | prep catheter site |
| 70% Ethanol | VWR | 71001-654 | prep catheter site |
| tourniquet | Webster | 07-8003432 | |
| 3-way stopcock | Midwest Veterinary Supply | 366.28510.4 | hep. lock |
| 37" extension set | Webster | 07-8454200 | hep. lock |
| Exel 50-60cc LL Syringes | Midwest Veterinary Suppy | 001.12250.2 | Heparinized saline flush |
| 250 ml bag 0.9% saline | Webster | 07-8365593 | flush |
| 1,000 U Heparin, 10 ml | Webster | 07-883-4916 | |
| Ketamine (Ketaset) 100 mg/ml | Fort Dodge | (AV ordered) | |
| Precision Xtra glucose test strips 50/bx | Abbott (American Diabetes Wholesale) | 9381599728K7 | test baseline/T3 blood glucose levels |
| Masimo Rad 57 | DRE | 6052057V | pulse-oximeter |
| Pavia rectal thermometer | Patterson | 07-8391335 | |
| Precision Xtra Glucometer | Abbott | 9381599728K7 | Handheld glucometer |
References
- Bergman, R., Phillips, L., Cobelli, C. Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man. J. Clin. Invest. 68, 1456-1457 (1981).
- Bergman, R., Prager, R., Volund, A., Olefsky, J. M. Equivalence of the insulin sensitivity index in man derived by the minimal model and the euglycemic glucose clamp. J. Clin. Invest. 79, 790-800 (1987).
- Hovorka, R., et al. Partitioning glucose distribution/transport, disposal, and endogenous production during IVGTT. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282, E992-E1007 (2002).
- Salinari, S., Guidone, C., Bertuzzi, A., Manco, M., Asnaghi, S., Mingrone, G. First-phase insulin secretion restoration and differential response to glucose load depending on the route of administration in type 2 diabetic subjects after beriatric surgery. Diabetes Care. 32 (3), 375-380 (2009).
- Clinical Diabetes Research: Methods and Techniques. Roden, M. , John Wiley & Sons. (2007).
- Cobelli, C., Pacini, G. Insulin secretion and hepatic extraction in humans by minimal modeling of c-peptide and insulin kinetics. Diabetes. 37, 223-231 (1988).
- Lorenzo, C., et al. Disposition index, glucose effectiveness, and conversion to type 2 diabetes: the insulin resistance atherosclerosis study. Diabetes Care. 33, 2098-2103 (2010).
- Hansen, B. C. Investigation and treatment of type 2 diabetes in nonhuman primates. Methods Mol Biol. 933, 177-185 (2012).
- Hansen, B. C., Bodkin, N. L. Standardization of IVGTT. Importance of method used to calculate glucose disappearance. Diabetes Care. 16 (5), 847 (1993).
- Hardwood, J. H., Listrani, P., Wagner, J. D. Nonhuman primates and other animal models in diabetes research. J Diabetes Sci Tech. 3, 503-514 (2012).
- De Koning, E. J., Bodkin, N. L., Hansen, B. C., Clark, A. Diabetes mellitus in Macaca mulatta monkeys is characterized by islet amyloidosis and reduction in beta-cell population. Diabetologia. 36, 378-384 (1993).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Insulin secretion, clearance and action before and after gastroplasty in severely obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 18, 295-300 (1994).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Postgastroplasty recovery of ideal body weight normalizes glucose and insulin metabolism in obese women. J Clin Endocrinol Metab. 80, 364-369 (1995).
- Kim, S. H., Abbasi, F., Chu, J. W., McLaughlin, T. L., Lamendola, C., Polonsky, K. S., Reaven, G. M. Rosiglitazone reduces glucose-stimulated insulin secretion rate and increases insulin clearance in nondiabetic, insulin-resistant individuals. Diabetes. 54, 2447-2452 (2005).
- Toffolo, G., Breda, E., Cavaghan, M. K., Ehrmann, D. A., Polonsky, K. S., Cobelli, C. Quantitative indexes of beta-cell function during graded up and down glucose infusion from C-peptide minimal models. Am J Physiol Endocrinol Metab. 280, E2-E10 (2001).
- Wang, X., et al. Quantification of beta-cell insulin secretory function using a graded glucose-infusion with C-peptide deconvolution in dysmetabolic, and diabetic cynomolgus monkeys. Diabetology and Metabolic Syn. 5, 40 (2013).
- Xiao, Y. F., Wang, B., Wang, X., Du, F., Benzinou, M., Wang, Y. X. Xylazine-induced reduction of tissue sensitivity to insulin leads to acute hyperglycemia in diabetic and normoglycemic monkeys. Anesthesiology. 13 (33), (2013).
- Porte, D., Kahn, S. β-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes potential mechanisms. Diabetes. 50, Suppl 1. S160-S163 (2001).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), G214-G223 (1979).
- Ferrannini, E., Gastaldelli, A., Miyazaki, Y., Matsuda, M., Mari, A., DeFronzo, R. A. β-cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J Clin Endocrinol Metab. 90 (1), 493-500 (2005).
- Vaughan, K. L., Szarowicz, M. D., Herbert, R. L., Mattison, J. A. Comparison of anesthesia protocols for intravenous glucose tolerance testing in rhesus monkeys. J Med Primatol. 43, 162-168 (2014).
- Kemnitz, J. W., Kraemer, G. W. Assessment of glucoregulation in rhesus monkeys sedated with ketamine. American Journal of Primatology. 3, 201-210 (1982).
- Dutton, C. J., Parvin, C. A., Gronowski, A. M. Measurement of glycated hemoglobin percentages for use in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus in nonhuman primates. Am J Vet Res. 64, 562-568 (2003).
- Rai, V., Iyer, U., Mani, I., Mani, U. V. Serum biochemical changes in insulin dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus and their role in the development of secondary complications. Int J Diab Dev Countries. 17, 33-37 (1997).
- Shirasaki, Y., Yoshioka, N., Kanazawa, K., Maekawa, T., Horikawa, T., Hayashi, T. Effect of physical restraint on glucose tolerance in cynomolgus monkeys. J Med Primatol. 42, 165-168 (2013).
