Summary
Het doel van dit protocol is om een standaard methode te presenteren aan intraveneuze glucose tolerantie testen (IVGTTs) uit te voeren om de glykemische controle van niet-menselijke primaten te evalueren en hun metabolische status dysmetabolic beoordelen van gezonde.
Abstract
De intraveneuze glucosetolerantietest (IVGTT) speelt een belangrijke rol bij de karakterisering van glucose homeostase. Wanneer zij samen met serum biochemische profielen, met inbegrip van de bloedsuikerspiegel in zowel de nuchtere als de nuchtere toestand, HbA1c, insuline niveaus, klinische geschiedenis van de voeding, lichaamssamenstelling, en het lichaamsgewicht status van een evaluatie van de normale en abnormale glykemische controle gehouden kan worden gemaakt . Interpretatie van een IVGTT wordt gedaan door het meten van veranderingen in glucose en insuline niveaus in de tijd ten opzichte van de uitdaging dextrose. Kritische componenten moeten worden beschouwd: piek glucose- en insulineniveaus, gerelateerd aan T0 (eind glucose infusie), de glucose klaringssnelheid K afgeleid uit de helling van snelle glucose speling in de eerste 20 min (T1 tot T20), de tijd terug naar basislijn glucose, en het oppervlak onder de curve (AUC). Deze IVGTT maatregelen karakteristieke veranderingen als glucose homeostase beweegt van een gezonde t toneno een zieke metabole toestand 5. Hierin zullen we de karakterisering van humane primaten (Rhesus en cynomolgus makaken), die de meest relevante diermodel van type II diabetes (T2D) bij mensen en de IVGTT en ziektebeelden van deze dieren zijn beschrijven een mager gezonde, zwaarlijvige dysmetabolic, en T2D staat 8, 10, 11.
Introduction
De IVGTT is een geschikte functionele test die routinematig wordt gebruikt om de functie β-cellen in mensen te bepalen bij verschillende metabolische toestanden 5, 7. In diermodellen van T2D, wordt ook erkend als een hulpmiddel voor dieren die een metabole ziekteprogressie uit vertonen kenmerkend een gezonde een dysmetabolic hyperglycemische toestand 8, 9. De dichtstbijzijnde diermodel van T2D is aangetoond bij niet-humane primaten (NHP), waarvan rhesus makaken en cynomolgus zijn bekende voorbeelden. Deze dieren ontwikkelen natuurlijke T2D dezelfde risicofactoren leeftijd en obesitas bijdraagt aan de frequentie ervan bij de mens 10. Verder is er een soortgelijke ziekteprogressie en pancreas pathologie toont amyloïde afzettingen dysmetabolic de ziekte vordert 11.
Hier doen we verslag van onze standaard methode van het uitvoeren van een IVGTT in NHP's als onderdeel van onze kolonie karakterisering van metabole status al deze dieren. Deze methode issimpel opzichte van andere, tijdrovende en dure technieken 2 voeren. De IVGTT is nuttig voor het snel karakteriseren en vaak een grote kolonie dieren. Wanneer rekening gehouden met het niveau van geglycosyleerd hemoglobine (HbA1C), dieet en voedselopname van het dier geschiedenis, en hun percentage spiermassa en lichaamsvet, de IVGTT normaliter voldoende voor het karakteriseren metabole en progressie van een dier tegen openlijke diabetes 6 , 8.
HbA1C het gemiddelde glycemische niveau over de levensduur van een rode bloedcel, een betrouwbare meting van glucose niveaus in de afgelopen zes weken tot drie maanden. Wanneer gemeten vanaf de basislijn nuchtere bloedmonster van de IVGTT, deze waarde biedt een venster in de glykemische controle tijdens de maanden tussen procedures. Als het dier is overgegaan van dysmetabolic diabetische sinds hun laatste IVGTT zou een HbA1c waarde veel hoger is dan de vorige waarde te gevendat de overgang begon al snel na hun laatste IVGTT, terwijl een HbA1c waarde dichter bij hun vorige waarde zou aangeven dat ze pas onlangs zijn overgezet. In het algemeen, in rhesus makaken, HbA1c-waarden van meer dan 6% abnormaal worden beschouwd, en geven een slechte glykemische controle 10, 23.
Glycemische niveaus moeten worden geïnterpreteerd in de context van het gedrag en de algemene gezondheid van het dier als geheel. Diabetische makaken - net als mensen - expositie vraatzucht, polydipsie en polyurie. Groep huisvesting van de dieren biedt aanzienlijke uitdagingen voor de meting van deze indicatoren en de individuele zorg die nodig is voor dysmetabolic en diabetische apen. We raden afzonderlijk de huisvesting van de dieren, zodat meer gepersonaliseerde zorg kan worden verleend, en gedragsmatige markers van de gezondheid van de aap gemakkelijker worden gecontroleerd 8. Daarnaast zal diabetische makaken gewichtsverlies, en verhoogde lipidenprofiel (toename vertonencholesterol, hypertriglyceridemie) en verstoorde mineraalmetabolisme in serum chemie. Het is belangrijk om markers lever- en nierfunctie in serumchemie meten, schade aan deze organen vaak complicaties van uitlopende stofwisselingsziekte / diabetes, en kan mede determinanten van glycemische, lipiden en mineralen onevenwichtigheden 9, 11, 18, 24 .
Bij gebruik van deze methode, de historische waarden gegenereerd uit meerdere, frequente karakteriseringen over de levensduur van een aap zijn bijzonder waardevol. Als er andere procedures, zoals een glucose klem of graded glucose-infuus (GGI), zijn nodig om de gezondheid van een dier volledig te kunnen beoordelen, is het vaak bij de eerste karakterisering wanneer hun geschiedenis niet beschikbaar is. Zodra een basislijn is vastgesteld, IVGTTs herhaald met een frequentie van drie maanden zijn meestal voldoende om de voortgang van een dier te volgen. Dit is vooral belangrijk wanneer de dieren zijn ingeschreven in meerdere studies gedurende eenkalenderjaar op basis van hun metabolische status van. Terwijl hun gezondheid tegelijk relatief stabiel kan blijven gedurende jaren, toen de metabole status van een dier verslechtert, een dramatische verhoging van de insulineresistentie en glucose-intolerantie kan zeer snel plaatsvinden. HbA1C waarden zorgen voor een aantal interpolatie van de achteruitgang of verbetering van de gezondheidstoestand van het dier tussen de procedures gepland drie maanden uit elkaar. Daarom is deze werkwijze geschikt voor het karakteriseren van dieren die in meerdere longitudinale studies in de loop van hun natuurlijke levensduur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de David H. Murdock Research Institute IACUC gelegen aan de North Carolina Research Campus (NCRC), in het kader van het protocol 14-017, karakterisering van een niet-menselijke primaat model van diabetes en prediabetes / insulineresistentie en de werkzaamheid van geneesmiddelen te verbeteren insulinegevoeligheid en metabolische functie.
1. Dierlijke Selectie- en Study Voorbereiding
- Kies een dieet en het gewicht stabiel dieren op basis van de maandelijkse voedselinname en het lichaamsgewicht verslagen.
LET OP: Dieren die zijn vertoonden een recente daling in de eetlust mag niet worden gekarakteriseerd totdat hun voedselinname is gestabiliseerd.- Voor volwassen dieren (> 5-6 jr), geen dieren waarvan het lichaamsgewicht tussen opeenvolgende maanden meer verschillen dan 10% zonder eerst de aap te onderzoeken en het uitsluiten van andere dan het veranderen van metabole status voor de dramatische verandering in gewicht oorzaken te selecteren.
- Voor glucose, insuline en C-peptide analyten, bereiden K 2 EDTA monstername buizen met proteaseremmer (aprotinine en DPP4I).
OPMERKING: De DPP4I + aprotinine cocktail biedt een breed spectrum protease remming moet dit vereist aanvullende analyten (glucagon, GLP-1). Indien aanvullende analyt worden verzameld, moet bloedbuisjes worden bereid op dezelfde manier consistentie in monstername handhaven. Monsters voor assays niet gevalideerd voor deze methode moet apart worden ingezameld, in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant.- Bereid de proteaseremmer cocktail door mengen van 100 mg gevriesdroogd aprotinine met 10 ml DPP4I. Voeg 10 ul van de aprotinine + DPP4I mengsel aan elke bloedbuis voor elke milliliter bloed verzameld.
- Voeg een extra 10 pl van de cocktail van proteaseremmers aan elke buis mogelijke verzameling overdosering. Bewaar het behandelde bloed buizen bij -20 ° C tot gebruik. Houd de buizen op nat ijs tijdens de proceduen opnieuw centrifugeren op 4 ° C.
- Gebruik een serum separator buisje om een bloedmonster te verzamelen bij baseline voor standaard serum chemie analyse. Voor het complete bloedbeeld (CBC), een standaard K 2 EDTA zonder proteaseremmers. Gebruik cryovials te hoeveelheid plasma en serum na de bloedmonsters zijn afgedraaid.
- Label het bloed buizen en cryovials adequaat met de identificatie van dieren, de datum, procedure, tijdstip, en sample volume. Label de cryovials de analyt (en) in plasma voor geschikte test.
- Bereid de gehepariniseerde zoutoplossing spoelen door het injecteren van 0,15 ml van 1000 USP eenheden per ml heparine in een 250 ml zak van normale zoutoplossing. Het verkrijgen van een oplossing van 0,06 mg heparine / ml. Tekenen 40 - 60 ml van deze oplossing in een zoutoplossing slot voor het spoelen tussen de monsters. Teken een extra 1 ml en 5 ml in afzonderlijke spuiten spoeling van dextrose infusiepoort voor en na de infusie respectievelijk.
2.Animal Sedatie en voorbereiding
- Verwijder levensmiddelen uit de kooi van het dier niet minder dan 14 uur voor de procedure, en niet meer dan 18 uur.
LET OP: Het is belangrijk dat de dieren worden gevast voor de procedure om eventuele postprandiale variatie in de glycemische waarden te voorkomen. Het is ook een voorzorgsmaatregel om regurgitatie en aspiratie van de maaginhoud te vermijden terwijl verdoofd. - Sedate dieren voor de duur van de procedure IVGTT met ketamine intramusculair als narcose, bij 10 mg / kg. Dien extra ketamine (5-10 mg / kg) met intervallen van 20-30 min, of naar behoefte, tijdens de procedure.
- Weeg de verdoofde dier. Plaats het dier in een lateraal liggende positie op een verwarmde tafel procedure.
- Monitor klinische parameters elke 15 tot 20 min te zorgen het dier in een stabiele vlak van anesthesie. Meet hartslag (100-200 bpm) en SPO 2 (> 92%) met een pulsoxymeter. Meet ademfrequentie (20-50 ademhalingen / min) w et een stopwatch, het tellen van ademhaling visueel of met de hand meer dan vijftien seconden en te vermenigvuldigen met vier. Meet de temperatuur (> 97 ° F) rectaal. Bewaken van de kleur van het slijmvlies rond het tandvlees en lippen (vochtig, roze).
- Bereid twee canule sites. Gebruik tondeuses om het haar uit het gebied van belang waar de katheter wordt ingebracht trim, en steriliseer de hele regio met afwisselend scrubs van chloorhexidine en 70% alcohol.
- Plaats een katheter in de regio van de linker of rechter cephalic of aderen en bevestig deze aan een heparine zoutoplossing flush (0,06 mg heparine / ml) met een drie-weg kraan. Dit is de bloedafname loting plaats.
- Plaats de tweede katheter in een ander been of arm in het gebied van de Cephalic of aderen en voeg een poort. Gebruik deze site voor de dextrose infuus. Gebruik een kleine, 1 ml roes van gehepariniseerde zoutoplossing aan de canule octrooi voorafgaand aan dextrose infuus te houden.
OPMERKING: De IVGTT procedure bestaat uit 8 bloedafname bemonsterings- tijdstippen (Tabel 1).
- Neem de basislijn monster en het gebruik van een draagbare glucometer op de nuchtere bloedglucose te meten. Verkrijgen van een serummonster standaard chemische analyse, evenals een volledig bloedmonster een CBC om de algemene gezondheid van het dier te beoordelen. Verzamel plasmamonsters glucose en insuline niveaus van het referentiemonster onder toepassing van een kit gevalideerd voor gebruik met makaken volgens instructies van de fabrikant 8, 9 testen.
Opmerking: Het is belangrijk om een pre-draw van 0,5 ml genomen uit de canule alvorens een monster voor bloedafname om resterende bloed of heparine te verwijderen in de dode ruimte van de canule hebben. - Na het verkrijgen van het referentiemonster, trekken de dosis 50% dextrose (250 mg / kg) gedurende 30 seconden in de dextrose infusiepoort.
OPMERKING: Hogere modellen dosis (500 mg / kg) kan worden gebruikt,hoewel de dosis moet worden vastgesteld aan de overkant van de procedures om aan longitudinale vergelijkingen te maken.- Spoel de infuuspoort met 5 ml gehepariniseerde zoutoplossing om ervoor te zorgen dat er geen dextrose achtergelaten in de haven. Het einde van de infusie de T0. Laat de technicus vervangen van de handschoenen, als restafval dextrose uit het infuus daaropvolgende bloedmonsters kan verontreinigen.
- De eerste post-infusie sample tijdstip is T3 min, vanaf het einde van dextrose infuus, gevolgd door T5 min, T7 min, min T10, T15 min, T20 min, en het laatste monster tijdstip is op T30 min. Verzamel plasma uit elk tijdstip om te testen glucose en insuline niveaus met de basislijn monster (zie stap 3.1).
- Bij de T3 min tijdstip, gebruik maken van de hand gehouden glucometer om opnieuw te controleren de bloedsuikerspiegel.
OPMERKING: De glucometer metingen bij aanvang en T3 zijn alleen de infusie van het dextrose bevestigen. De bloedsuikerspiegel op het T3 min tijdstip moet ~ 100 mg / dl hoger co zijnmpared de nuchtere uitgangswaarde van het plasma glucose niveau.
- Bij de T3 min tijdstip, gebruik maken van de hand gehouden glucometer om opnieuw te controleren de bloedsuikerspiegel.
4. Animal Recovery en monster verwerking
- Verwijder de canules en druk op de katheter plaatsen voor hemostase na T30 min tijdpunt. Bewaak het dier tot het bewustzijn heeft herwonnen en zit omhoog. Aanbod-feed nadat het dier volledig is hersteld.
- Onmiddellijk leg elke volbloed monster in K 2 EDTA buisjes op ijs. Centrifugeer bij 3000 tpm bij een temperatuur van 4 ° C binnen 10 min verzameld. Aliquot plasmamonsters in cryovials, te bevriezen en bewaar bij -80 ° C tot analyse.
- Laat het bloed in het serum buis standaardserum chemische analyse op kamertemperatuur gedurende ten minste 20 minuten en niet meer dan 30 minuten voor centrifugeren bij 3000 rpm bij kamertemperatuur. Bevries de serummonsters tot getest binnen 48 uur van de collectie.
LET OP: Koel het hele bloedmonsters verzameld voor CBC analyse tot zoSayed binnen 24 uur van de collectie.
- Laat het bloed in het serum buis standaardserum chemische analyse op kamertemperatuur gedurende ten minste 20 minuten en niet meer dan 30 minuten voor centrifugeren bij 3000 rpm bij kamertemperatuur. Bevries de serummonsters tot getest binnen 48 uur van de collectie.
5. gegevensverwerking
- Na vaststelling van de plasma insuline en glucose curves, bepalen de glucose klaringssnelheid K uit de helling van de natuurlijke logaritme van glucosewaarden boven de basislijn 16, 17.
OPMERKING: Een gezonde NHP kan worden verwacht dat een glucose klaring K hebben ruim boven 1, vaak groter dan 2 of meer, als gezonde dieren vaak naar hun uitgangswaarde glucose waarden binnen 30 minuten. Omdat de productie van insuline wegvalt, zal de glucose klaringssnelheid K meer dramatisch dalen, tot onder 1. - Bereken de AUC als geheel, als de som van de totalen van het oppervlak van de trapezoïden die het oppervlak onder de curve van elk lijnsegment tussen tijdstippen door T30 16, 17.
OPMERKING: Traditioneel is de AUC van de eerste tien minuten van de procedure wordt geacht de acute insulinerespons op glucose (AIR), terwijl de AUC van de laatste 20 minuten van de behandeling wordt beschouwd als de late insulinerespons (LIR). Omdat het dier steeds dysmetabolic, zal de insuline AUC toenemen, als gevolg van de vergoeding voor het verhogen van insuline-ongevoeligheid. Als het dier overgangen openlijke diabetes, maar de AUC afnemen, vaak in eerste instantie in de acute fase insuline, gevangen door de lucht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in Figuur 1 resultaten demonstratief typische glucose en insuline krommen van volwassen, gezonde en diabetische cynomolgus makaken in de loop van 30 min IVGTT. Gegevens van gezonde en vergevorderde diabetische apen worden getoond om de duidelijke verschillen tussen dieren van beide uiteinden van de reeks metabolische karakterisering contrast. Deze IVGTT protocol is met succes gebruikt door de auteurs in rhesus makaken met vergelijkbare resultaten.
De nuchtere, basislijn glucosewaarden van een gezonde makaken (rhesus en cynomolgus) kan zo laag als 50 tot 60 mg / dl 8 zijn. Zoals geïllustreerd in de figuur, de initiële glucose excursie - gemeten T3 - kan een gezonde NHP niet zo hoog als een typische basislijn glucosewaarde voor diabetische dieren, die vaak meer dan 200 mg / dl te beklimmen. In de loop van de volgende dertigminuten, het glucosegehalte van een gezond dier vaak terug naar hun uitgangswaarden, terwijl dysmetabolic en diabetische dieren niet (figuur 1; ononderbroken lijnen). De bijbehorende insuline curve voor een gezond dier vertoont twee pieken (figuur 1; blauwe streepjeslijn), die overeenkomen met de aanvankelijke snelle daling van bloedglucose (fase 1) in grotere dan normale deel veroorzaakt door perifere effecten van insuline op glucose transport en opname 3, 4. de omvang van deze randeffecten, zelfs tijdens de eerste fase van de insulinerespons, niet gelijk aan de bijdrage van de lever glucoseverlagende, die gedurende de kleinere maar aanhoudende tweede insulinepiek (fase 2 ), heeft de grootste invloed op glykemische niveaus via onderdrukking van de endogene glucoseproductie 1.
Als een dier zich ontwikkelt van gezond dysmetabolic, is er typisch een vermindering van the eerste fase van de insulinerespons op de bolus dextrose, die kan worden weerspiegeld in een verlaagd AIR. Echter de AUC onveranderd blijven, aangezien er vaker een algehele toename insulineproductie wordt, voorziet grotendeels ongewijzigd glycemische niveaus in de loop van de procedure de verhoogde insulineproductie compenseert de vermindering van de gevoeligheid. Zodra een dier openlijke diabetes geworden, insulineproductie daalt dramatisch in reactie op de bolus dextrose (figuur 1; rode stippellijn). Glycemische niveaus hoog blijven in de loop van de procedure, als wat glucose klaring gebeurt nu vrijwel geheel gemedieerd door niet-insuline-afhankelijke mechanismen (figuur 1).
Figuur 1: IVGTT Glucose Ontruiming en de productie van insuline Curves voor diabetische en HEalthy Controle Dieren. Hier worden glucose (vaste lijn) en insuline (stippellijn) curves voor een gezonde (blauwe lijn) en diabetische dieren (rode lijn). Deze waarden zijn gemiddelden van de feitelijke gegevens die tijdens IVGTTs uitgevoerd op cynomolgus makaken verzameld (diabetische glucose: n = 27; gezond glucose: n = 21; diabetische insuline: n = 23; gezonde insuline: n = 20; standaardfout bars getoond). Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Klok tijd | Tijdstippen (min) | Echte tijd | Bloedmonster hoeveelheid (ml) | monster Assay | Glucose Meter Reading (mg / dl) | |
| Baseline | 5 ml | 1,5 ml SST - chemie 0,5 ml K 2 EDTA - CBC, HbA1c 3 ml K 2 EDTA + 50 pi prot -. Glucose, insuline, C-Pep | ||||
| 0 | Dextrose infuus 250 mg / kg IV, aangezien meer dan 30 seconden, gevolgd door 5 ml heparine zoutoplossing flush | |||||
| 3 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ui Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ui Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 7 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ui Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ui Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 15 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ui Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ui Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 30 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ui Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
Tabel 1:. IVGTT Procedure tafel Hier afgebeeld is een standaard procedure verslag over een IVGTT, waarin alle relevante informatie gevangen genomen tijdens de procedure. Klok tijden voor sample trekt naar aanleiding van de dextroseinfusie moet worden gerekend vanaf het einde van de infusie. Werkelijke tijden moeten worden geregistreerd voor elke trekking. Klik hier om deze tabel te downloaden als Microsoft Word-document.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De IVGTT evalueert de capaciteit van glucose gestimuleerde insuline-afgifte door een dextrose infuus gebaseerd op lichaamsgewicht 5, 12, 13. Van de assay, wordt de nuchtere bloedglucose en insuline niveau bereikt, en geeft een beoordeling van het vermogen van het dier om vrijgeven van insuline en de terugkeer van de verhoogde glucose niveau in de richting baseline. Dit geeft de gebruiker gegevens aan het dier te karakteriseren als een normale glucose en insulineniveau gezonde controle, een hyperinsulinemie dysmetabolic dier met normoglycemia of een hyperglycemische insuline resistente diabetische dieren.
Het is belangrijk dat bloedmonsters zijn uit het vroege tijdstippen na infusie van dextrose, getekend en verwerkt tijdig en consistent zijn. Dit zal verminderen variabiliteit binnen en tussen de onderwerpen, en de mogelijkheden voor fouten in de temporele volgorde van de data te verlagen. De timing van de T3 is van cruciaal belang, omdat de excursie of plasmaglucose van basislijn tot drie minuten na infusie van het dextrose is een van de eindpunten die wordt gebruikt om de metabole status van de dieren te karakteriseren. Er is een afname van glucose speling binnen de eerste 7-10 minuten na het infuus dextrose, die kunnen worden gemist als deze bloedafnames worden niet overgenomen tijd. Is het gebied onder dit deel van zowel de glucose en insuline curven die wordt gebruikt als eindpunt, benadrukt het belang van deze vroege tijdstippen. Als een bloedafname na de T3 laat wordt genomen, kan de procedure voortgezet maar het tijdstip van de trekking moet worden gerapporteerd om de werkelijke vorm van de kromme zo veel mogelijk behouden. Het is bijzonder belangrijk dat afwijkingen van meer dan een minuut worden vastgelegd en gerapporteerd. Na de eerste tien minuten, glucose klaring neiging om geleidelijker te worden, en kunnen niet binnen 30 minuten (figuur 1) terug naar de basislijn. De procedure kan worden verlengd bemonstering om de 10 minuten na de T30 tevastleggen hoe lang het duurt voordat het dier terug te keren naar de uitgangswaarde.
IVGTTs beperkt door hun vermogen om insulinegevoeligheid direct te meten. Het is vooral nuttig als een methode voor het beoordelen van insuline en glucose klaring. Echter, hepatische insuline extractie uit het portaal bloedtoevoer compromitteert metingen van "insulinesecretie" uit de systemische bloedtoevoer. Dit kan gedeeltelijk worden ondervangen, echter door meting c-peptide, dat wordt afgescheiden in equimolaire hoeveelheden van de alvleesklier maar wordt niet verwijderd door de lever voordat de algemene bloedtoevoer. Dit geeft een duidelijker beeld van de productie van insuline aan β-celfunctie 16 beter te kunnen beoordelen. Ook, IVGTTs geen onderscheid tussen insuline-afhankelijke mechanismen van glucose goedkeuring en niet-insuline-afhankelijke mechanismen 1, 6. Terwijl insulinegevoeligheid indirect worden beoordeeld aan minimale modellering van gegevens van een IVGTT, kan betrouwbaarder maatregelen worden bereikt door The gebruik van procedures zoals Graded Glucose Infusie (GGI), die een β-cel dosis-respons curve 14, 15 verschaft.
Echter insulinegevoeligheid nog slechts indirect met de GGI beoordeeld. Een standaard insuline dosis kan worden toegediend aan het dier tijdens de IVGTT naar schatting van insulinegevoeligheid verbeteren, maar die endogene insulineproductie masker, afbreuk beoordeling van β-celfunctie. De Hyperglykemie en Hyperinsulinemische Clamp technieken meten rechtstreeks glucoseregulatie via gecontroleerde blootstelling aan insuline. Het nadeel van zowel de GGI en de klem technieken is dat ze duur en vereisen meer personeel en tijd in beslag (soms wel zes tot acht uur, afhankelijk van het ontwerp van de procedures) 16. De IVGTT, daarentegen, kan onder een uur en met minimale mankracht.
In het algemeen zal een gezond dier beschikken glucose zeer snelly, vaak terugkeren naar hun uitgangswaarden binnen 30 minuten, en hun insuline curve zal twee afzonderlijke pieken vertonen voor de acute en late insuline reacties. Als een dier steeds dysmetabolic hun nuchtere glucose en glucose hun tocht in de eerste drie minuten na infusie kan toenemen. Echter kunnen deze waarden sterk verschillen gezonde dieren en meest informatieve van ziekteprogressie vergeleken met historische waarden van hetzelfde dier. Kortom, maar de glucose klaring van een dysmetabolic dier kan niet sterk verschillen van toen ze nog gezond. De eerste tekenen van ziekteprogressie zullen het duidelijkst worden in de insuline curve. Terwijl de nuchtere insulinespiegel slechts licht verhoogd kan zijn, zal de insuline AUC typisch drastisch toenemen in dysmetabolic dieren, als gevolg van een vergoeding voor de ontwikkeling van insuline-ongevoeligheid. Als β-celfunctie daalt echter een afstomping van de acute fase insulinerespons kan worden gezien. Thij zal worden weerspiegeld in een verminderde AIR, die, wanneer genormaliseerd naar de baseline, kan benaderen 0 in een diabetisch aap. Dit wordt gevolgd door een algemene afname van insulineproductie en een dramatische afname van glucose klaring 8, 9, 10, 11.
De metabole status van een dier kan moeilijk vast te stellen met een enkele IVGTT zijn. Dit kan het geval zijn wanneer het proberen om een dier te onderscheiden als ofwel vroeg dysmetabolic of pre-diabetes. Wanneer steeds geleidelijk dysmetabolic, de productie van insuline toe tot euglycemia handhaven. Terwijl nuchtere glucosewaarden iets kunnen raken verhoogd, heeft een gestoorde glucose niet erg duidelijk geworden tot β-cel functie in gevaar is gebracht en de productie van insuline begint te dalen 18, 20. Voor een periode van tijd, voordat openlijke diabetes heeft ingesteld in, insuline waarden kan de curve van een vroege dysmetabolic dier in wie de eerste fase respons is aangetast lijken, maar sommige insuline still boven gevast, uitgangswaarden wordt geproduceerd. Hierdoor kan de AUC van insuline kromme van een vroege dysmetabolic en pre-diabetische dieren zeer vergelijkbaar. In dit geval verhoogde glucose curve, wordt beïnvloed door zowel insuline-afhankelijke en niet-insuline-afhankelijke mechanismen, niet voldoende is om het dier te onderscheiden als ofwel vroeg dysmetabolic of pre-diabetes. Dit onderscheid kan worden gemaakt door het uitvoeren van een hyperinsulinemische / euglycemische klem, die rechtstreeks insulinegevoeligheid 19 demonstreren. Als alternatief kan dit onderscheid worden gemaakt bij het uitvoeren van een ander IVGTT op het dier na enkele maanden. In het laatste geval, de AUC van insuline curve toeneemt, kan het dier worden beschouwd begin dysmetabolic zijn ten tijde van de eerste procedure. Als de AUC vermindert echter dysmetabolic situatie van het dier kan worden beschouwd als zijnde gevorderd / praediabetische ten tijde van de eerste kwalificatie. Een prediabetic staat kan ook worden en grotied van gewichtsverlies en toename van de vloeistofinname gedurende de periode tussenliggende beide IVGTT procedures. Deze omstandigheden geven waarom de IVGTT is een bijzonder nuttig instrument als overwogen in het licht van een geschiedenis van dergelijke procedures het niet te worden gebruikt als een momentopname van de gezondheid van een dier.
Het gebruik van de stoel terughoudendheid met dieren bij bewustzijn is aangetoond dat een aanzienlijke verhoging van de bloedsuikerspiegel te produceren tijdens glucosetolerantie het testen van 25. Om deze reden worden de dieren verdoofd voor deze procedure. Wel moet voorzichtigheid worden betracht bij de keuze van de verdoving. Er werd gemeld dat het gebruik ofα2-adrenoceptor agonisten zoals xylazine en dexmedetomidine sedatie kan aanzienlijk verhogen bloedsuikerspiegel bij niet-humane primaten 17, 21. De hier vermelde methode wordt alleen ketamine voor sedatie, die haar niet bloedsuikerspiegel stijgen 22. Soms kan een dier vertonenzoals stijfheid en spannen dat de technicus een relaxerend misschien het gevoel nodig is. In dat geval oefenen Diazepam en Telazol aangetoond dat een veel minder grote invloed op de productie van insuline en glucose metabolisme dan α2-adrenoceptor agonisten 21 hebben. Daarom is het belangrijk om de toegediende anesthesie metabole tests, zoals de IVGTT beschouwen. Samengevat, de IVGTT een eenvoudige metabolische functietest die routinematig wordt uitgevoerd in NHP, maar het kan waardevolle informatie dieren categoriseren in een kolonie in verschillende metabolische toestanden dus informeren hun dierlijke zorg en gezondheidsmanagement, alsmede hun potentieel te verschaffen in modellen van metabole ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn verbonden aan een contract research organisatie (Crown Bioscience) actief op het gebied van metabole ziekten.
Acknowledgments
De auteurs willen graag aan de sterke steun van de DHMRI CLAS dierenverzorgers erkennen, Facility Manager heer Daniel Peralta en de behandelende dierenarts, dr Glicerio Ignacio, DVM MRCVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-15R Centrifuge | plasma: 4 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Sorvall ST16R Centrifuge | serum: 22 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Thermo Scientific -86 °C Freezer, Forma 88000 Series | Model: 88500A | ||
| Dextrose 50% (D50) | Webster | 07-8008986 | I.V. glucose infusate |
| 3 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | serial blood draws | |
| 5 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | heparinized saline flush | |
| 10 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | delivery of I.V. D50 | |
| Gauze sponges 2 x 2 | Midwest Veterinary Suppy | 366.23000.4 | Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution |
| 4 ml serum separator tubes | Midwest Veterinary Supply | 366.45000.4 | blood collection tube for superchem panel |
| K2EDTA, 2 ml | VWR | 95057-239 | blood collection tubes |
| Aprotinin, 100 mg | Sigma | A1153-100MG | blood collection tube protease additive |
| 22 G x 1" Catheters | Midwest Veterinary Suppy | 193.75250.2 | I.V. catheter |
| Injection Plug W/ Cap | Midwest Veterinary Suppy | 001.11500.2 | %50 dextrose infusion port |
| Porus Tape, 1/2" x 10 yd | Midwest Veterinary Suppy | 001.85000.2 | maintain adherance of catheters and hep. Locks |
| Chlorhexidine Solution 2% | Midwest Veterinary Suppy | 193.08855.3 | prep catheter site |
| 70% Ethanol | VWR | 71001-654 | prep catheter site |
| tourniquet | Webster | 07-8003432 | |
| 3-way stopcock | Midwest Veterinary Supply | 366.28510.4 | hep. lock |
| 37" extension set | Webster | 07-8454200 | hep. lock |
| Exel 50-60cc LL Syringes | Midwest Veterinary Suppy | 001.12250.2 | Heparinized saline flush |
| 250 ml bag 0.9% saline | Webster | 07-8365593 | flush |
| 1,000 U Heparin, 10 ml | Webster | 07-883-4916 | |
| Ketamine (Ketaset) 100 mg/ml | Fort Dodge | (AV ordered) | |
| Precision Xtra glucose test strips 50/bx | Abbott (American Diabetes Wholesale) | 9381599728K7 | test baseline/T3 blood glucose levels |
| Masimo Rad 57 | DRE | 6052057V | pulse-oximeter |
| Pavia rectal thermometer | Patterson | 07-8391335 | |
| Precision Xtra Glucometer | Abbott | 9381599728K7 | Handheld glucometer |
References
- Bergman, R., Phillips, L., Cobelli, C. Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man. J. Clin. Invest. 68, 1456-1457 (1981).
- Bergman, R., Prager, R., Volund, A., Olefsky, J. M. Equivalence of the insulin sensitivity index in man derived by the minimal model and the euglycemic glucose clamp. J. Clin. Invest. 79, 790-800 (1987).
- Hovorka, R., et al. Partitioning glucose distribution/transport, disposal, and endogenous production during IVGTT. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282, E992-E1007 (2002).
- Salinari, S., Guidone, C., Bertuzzi, A., Manco, M., Asnaghi, S., Mingrone, G. First-phase insulin secretion restoration and differential response to glucose load depending on the route of administration in type 2 diabetic subjects after beriatric surgery. Diabetes Care. 32 (3), 375-380 (2009).
- Clinical Diabetes Research: Methods and Techniques. Roden, M. , John Wiley & Sons. (2007).
- Cobelli, C., Pacini, G. Insulin secretion and hepatic extraction in humans by minimal modeling of c-peptide and insulin kinetics. Diabetes. 37, 223-231 (1988).
- Lorenzo, C., et al. Disposition index, glucose effectiveness, and conversion to type 2 diabetes: the insulin resistance atherosclerosis study. Diabetes Care. 33, 2098-2103 (2010).
- Hansen, B. C. Investigation and treatment of type 2 diabetes in nonhuman primates. Methods Mol Biol. 933, 177-185 (2012).
- Hansen, B. C., Bodkin, N. L. Standardization of IVGTT. Importance of method used to calculate glucose disappearance. Diabetes Care. 16 (5), 847 (1993).
- Hardwood, J. H., Listrani, P., Wagner, J. D. Nonhuman primates and other animal models in diabetes research. J Diabetes Sci Tech. 3, 503-514 (2012).
- De Koning, E. J., Bodkin, N. L., Hansen, B. C., Clark, A. Diabetes mellitus in Macaca mulatta monkeys is characterized by islet amyloidosis and reduction in beta-cell population. Diabetologia. 36, 378-384 (1993).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Insulin secretion, clearance and action before and after gastroplasty in severely obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 18, 295-300 (1994).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Postgastroplasty recovery of ideal body weight normalizes glucose and insulin metabolism in obese women. J Clin Endocrinol Metab. 80, 364-369 (1995).
- Kim, S. H., Abbasi, F., Chu, J. W., McLaughlin, T. L., Lamendola, C., Polonsky, K. S., Reaven, G. M. Rosiglitazone reduces glucose-stimulated insulin secretion rate and increases insulin clearance in nondiabetic, insulin-resistant individuals. Diabetes. 54, 2447-2452 (2005).
- Toffolo, G., Breda, E., Cavaghan, M. K., Ehrmann, D. A., Polonsky, K. S., Cobelli, C. Quantitative indexes of beta-cell function during graded up and down glucose infusion from C-peptide minimal models. Am J Physiol Endocrinol Metab. 280, E2-E10 (2001).
- Wang, X., et al. Quantification of beta-cell insulin secretory function using a graded glucose-infusion with C-peptide deconvolution in dysmetabolic, and diabetic cynomolgus monkeys. Diabetology and Metabolic Syn. 5, 40 (2013).
- Xiao, Y. F., Wang, B., Wang, X., Du, F., Benzinou, M., Wang, Y. X. Xylazine-induced reduction of tissue sensitivity to insulin leads to acute hyperglycemia in diabetic and normoglycemic monkeys. Anesthesiology. 13 (33), (2013).
- Porte, D., Kahn, S. β-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes potential mechanisms. Diabetes. 50, Suppl 1. S160-S163 (2001).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), G214-G223 (1979).
- Ferrannini, E., Gastaldelli, A., Miyazaki, Y., Matsuda, M., Mari, A., DeFronzo, R. A. β-cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J Clin Endocrinol Metab. 90 (1), 493-500 (2005).
- Vaughan, K. L., Szarowicz, M. D., Herbert, R. L., Mattison, J. A. Comparison of anesthesia protocols for intravenous glucose tolerance testing in rhesus monkeys. J Med Primatol. 43, 162-168 (2014).
- Kemnitz, J. W., Kraemer, G. W. Assessment of glucoregulation in rhesus monkeys sedated with ketamine. American Journal of Primatology. 3, 201-210 (1982).
- Dutton, C. J., Parvin, C. A., Gronowski, A. M. Measurement of glycated hemoglobin percentages for use in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus in nonhuman primates. Am J Vet Res. 64, 562-568 (2003).
- Rai, V., Iyer, U., Mani, I., Mani, U. V. Serum biochemical changes in insulin dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus and their role in the development of secondary complications. Int J Diab Dev Countries. 17, 33-37 (1997).
- Shirasaki, Y., Yoshioka, N., Kanazawa, K., Maekawa, T., Horikawa, T., Hayashi, T. Effect of physical restraint on glucose tolerance in cynomolgus monkeys. J Med Primatol. 42, 165-168 (2013).
